脂肪酶
第一章概述
脂肪酶(Lipase，E C．3.1.1.3)是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇形成甘油三酸酯酯键的酶。198年,Klibanov A M 等用脂肪酶粉或其固定化酶在有机溶剂体系中成功地催化合成了一系列有机物, 开始了脂肪酶非水相酶学的研究[1]。随着研究的深入, 发现脂肪酶具有良好的醇解、胺解、酯化和转酯等特性, 可被广泛地应用于有机合成、精细化工、药物中间体合成、手性化合物拆分以及生物能源等诸多领域。近年来,通过对界面酶学和非水相酶学的研究，从而进一步拓展了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成大量高价值的产物，此外，脂肪酶在食品、医药、皮革和洗涤剂等许多工业领域中也有广泛的应用，充分显示了其巨大的应用潜力。
产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化。脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，而脂肪酶高产菌的筛选通常采用含甘油三酯的琼脂平板法，并通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，然后采用不同的方法对培养条件进行优化。其筛选的一般过程是：样品分离→富集培养→平板初筛→摇瓶复筛。不同微生物合成脂肪酶的能力不同，因此，要达到工业用脂肪酶生产微生物的要求，首先要筛选和诱导出与所需酶学性质相符的高产菌株，或者构建高表达量的重组基因工程株。
第二章方案论证
2.1脂肪酶的简介
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。
2.1.1脂肪酶的分子结构及特征
研究表明多数脂肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分占分子量的2%~15%，以甘露糖为主，整个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端。研究表明来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从270~641不等，从已报道的文献[2—3]来看，分子量为16KD~200KD。Dong-Woo Lee等报道的B.thermleovorans 单体分子量为16KD,Abel Hiol等报道的Mucor hiemalis f.hiemalis分子量为49 KD，而Lambit Kanwar等报道的一株假单胞菌所产脂肪酶的分子量则为143 KD。J.S.Twu等从鼠肝中提纯了脂肪酶，其全分子量达到了200 KD，亚分子量达53 KD。迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利用X-衍射等手段以及定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性中心的三元组结构。绝大多数脂肪酶的活性中心都是由Ser 和 His参与组成（BaleaoVM,1996）Ser、 His与另一种氨基酸残基（如CCl 和GCL的 GLU,RML和 hPL 的Asp）一起构成脂肪酶催化中心的三元组。如下图（Van T H,1993）。BaleaoVM等（1996）报道的人胰脂肪酶（HPL）,Brady L等（1990）报道的Rhizomcor miehei脂肪酶(RML)和Schrag J D等（1991）报道的Geo candidum脂肪酶等的蛋白晶体结构已经研究清楚。Geo candidum的立体结构也
证明这种三联体的存在，见图1（Brady Letal,1990）。上述三种脂肪酶中，活性中心丝氨酸残基的侧链构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似，不同的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部。
2.1.2脂肪酶的作用机理
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
酶的底物特异性与其结构和酶的活性中心有关。不同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。主要可分为三大类：脂肪酸专一性、酯键位置专一性和立体专一性。
脂肪酸专一性：脂肪酶对不同碳链长度的脂肪酸表现出特殊反应性。不同来源的脂肪酶水解油脂的脂肪酸专一性有很大的差异。例如圆弧青霉和B.Subtilis(Lesuisse E,1993)脂肪酶对短链(C8以下)脂肪酶，黑曲霉和根霉产生的脂肪酸对中等链长（C8 ~C12)脂肪酸具有特异性（曹淑桂，1995），而白地霉（李香春，2003;Jensen R G,1974;岩井美枝子，1989）和P.alcoligenes(Lentingh B M,1993）产生的脂肪酶对三油酸（不饱和脂肪酸）呈现强特异性。
酯键位置专一性：指脂肪酶对底物甘油三酯中的1,3位或2位酯键的识别。三酸甘油酯具有三个酯键，根据脂肪酶对底物作用位置不同可将其分为无位置特异性脂肪酶和位置特异性脂肪酶。例如，黑曲霉、根霉、铜绿假单胞菌（Gilbert E J,1991）、P.alcoligenes的脂肪酶仅催化1或3位酯键水解，对2位酯键无作用；白地霉、圆弧青霉、伯克霍尔德氏菌和荧光假单胞菌的脂肪酶无位置特异性（曹淑桂，2005），水解甘油三酯的所有酯键；目前仅发现一种可水解2位酯键的脂肪酶来源于Geotrichum sp.(Asahara T etal.1993)。
立体专一性：指脂肪酶对底物甘油三酯中立体对映结构的1位和3位酯键的识别和选择水解。不少脂肪酶催化拆分外消旋化合物的反应具较高的立体选择性（E>90）,例如，Akesson等发现，来源于荧光假单胞菌脂肪酶能区分Sn-1和Sn-3位二酰基甘油，但水解Sn-2、 Sn-3二酰基甘油比水解它的对应体速度快得多。因此这类脂肪酸被广泛应用到医药领域（宋欣，2004）。
2.2 产脂肪酶的微生物
最早报道的是兔胰脂肪酶，后来在植物种子中也发现了脂肪酶，而微生物是20世纪初发现的。微生物脂肪酶种类多，且较动植物更易获得纯培养，制备周期短，便于工业化生产和获得高纯度的酶制剂，使得微生物脂肪酶在酶理论研究及实际应用中的重要性逐渐增加，因此对其研究和应用上的发展相当迅速。目前商业脂肪酶绝大多数都是微生物脂肪酶。
产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。
2.3产脂肪酶菌的筛选方法
筛选脂肪酶高产菌的方法常见的是采用含甘油三酯琼脂平板。首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢、费油布等，无菌水梯度稀释样品，涂平板，培养，观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明 B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，观察变色圈的大小。透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶能力，即透明圈和变色圈越大，菌株产脂肪酶能力越大。
2.4脂肪酶的活性测定
脂肪酶的活力测定分两大类，定性检测和定量检测[4]。一般根据目的的不同选择合适的底物和方法。定性检测脂肪酶活力主要采用平板法，即在含有底物的平板上打孔，将酶液加入到孔内，然后根据水解定性分析脂肪酶活力高低。如kouker等于1987年报道了一种脂肪酶平板检测法，他们以三油酸甘油为底物，罗丹明B为指示剂，在平板上比较酶液周围荧光圈大小，进而判断脂肪酶活力大小。
常用的定量测定方法有三种：碱滴定法、PNPB法、皂铜法。
2.4.1 碱滴定法
这是最早也是使用最为普遍的用于脂肪酶活性检测的方法。原理为以橄榄油或三油酸甘油酯或三丁酸甘油酯和2%聚乙烯醇乳化液为底物，在脂肪酶作用下，脂肪酶水解为甘油及游离脂肪酸，以1%酚酞为指示剂，用0.05MNaOH中和反应产生的脂肪酸，每产生1umol脂肪酸定义为一个酶活力单位。
三种方法中碱滴定法（Fox PF 1983;Yeap CK,1998;Hee BZ,2003）最为常用，该法简单易行。不过使用碱滴定法时如何选择底物是关键之一，其中，三丁酸甘油酯和三油酸甘油酯为国外进口的商品，脂肪酶活力检测的结果稳定性优于国产的橄榄油。
2.4.2 PNPB法
PNPB（Lee D Wet al.1999）法因其反应灵敏、重复性较好，是目前国外普遍采用的测活方法。此法不同于碱滴定法，它的原理为在一定的PH/温度条件下，以对硝基苯丁酸酯为底物，乙腈为溶剂，加入酶液反应15分钟，然后在405nm 下测定反应产生的对硝基苯的吸光度，以反应产生的对硝基苯的量评估酶活力，测定前需制作对硝基苯吸光度标准曲线。该法活力单位定义为：脂肪酶在最是温度、最适PH下，每分钟水解产生1umol的对硝基苯酚所需的酶量。该法的缺点是底物价格昂贵。
2.4.3 皂铜法
是以甘油三酯和阿拉伯胶为底物，反应产生的脂肪酸用有机溶剂（正己烷）抽提，然后有机相中加入醋酸铜水溶液生成皂铜，最后提取有机相，加入染色剂二乙基二硫氨基甲酸，混合均匀后在430nm测定二乙基二硫氨基甲酸的吸光度，反应也需制作吸光度标准曲线。该法检测灵敏度高，但是由于试验中使用大量苯进行铜皂的萃取，容易造成环境污染和对人体的伤害。
因此，PNPB法和皂铜法（Lee D Wet al.1999）虽然检测灵敏度高，但相对操作繁琐，而且PNPB法使用的试剂昂贵。因此，建议酶量和总酶活较高时，可以用碱滴定法，而当脂肪酶经过凝胶过滤、离子交换层析后总酶活较低，可以用PNPB法和皂铜法。此外，尚有一些其他测定方法，如在Beisson等报道了甘油氧化法、PH电极自动滴定法、油膜表面张力法等，因不常用，不做详细介绍。
2.5 脂肪酶活性的影响因素
脂肪酶活性的影响因子很多，包括各种金属离子和有机化合物及表面活性剂
等物质。王艳茹（1999）报道了Ca2+和K+对一株微球菌所产脂肪酶有激活作用，而Cu2+、Mn2+、Fe2+等对酶有抑制作用。吴松刚等（1997）报道了Ca2+和Mg2+对一株细菌有较强的激活作用，Na+、K+和Li+具有微弱激活作用，而Pb+、Ca2+和Co2+则表现为不同程度的抑制作用。牛冬云等（2002）报道了微量（ <0.01mol/L）的Ca2+和K+对一株解淀粉芽孢杆菌有激活作用，过量时有抑制作用。Chartrain 等发现1mM Zn2+可以抑制P.aeruginosa MB5001脂肪酶94%的酶活力，而加入10 mM Ca2+可重新将酶激活。P.pseudoalcaligenes F-111脂肪酶能够在30℃1mM Fe3+中保温1h被抑制60%的酶活，但1mM Ca2+ 、Hg2+、Zn2+、 Cu2+、Mn2+、Mg2+、 Co2+、Cd2+、Pb+等在同一条件下对酶活没有显著性影响。邹文欣等（1996）报道了Ca2+、Mn2+和Ba2+对液化沙雷氏菌脂肪酶有一定激活作用，Mg2+、Na+、K+对酶活性的影响不大，Fe2+ 和Fe3+抑制酶活，Zn2+则使酶活性完全丧失，Ca2+能和脂肪酸生成不溶的丐皂而促进反应的进行，也有人推测Ca2+是脂肪酶的一个组成成分。另外，某些有机化合物及表面活性剂对酶活性的影响也较大，有的活性剂可以增加酶活，Houria Abbas等的实验分别测定了加入0.005%的Tween20和Tween80可以使Strain DB700A的脂肪酶活性增加一倍多，但若按1%的量加入去污剂，酶活则略有降低；加入10mmol/L胆酸盐能明显提高酶的活性，而SDS、Triton X-100等能明显抑制其活性，该酶在乙醇中很快失活，而在丙酮中5天后还有89%活性。
第三章实验部分
3.1材料、试剂及仪器
3.1.1材料
从学院餐厅附近油污桶壁上采集的土样。
3.1.2试剂
表 1.1 常用生化试剂
配制试剂
1）溴甲酚紫
变色范围：PH5.2~6.8，颜色由黄变紫。常用浓度为0.04%[5]。
配制：称0.1g指示剂，加18.5mL0.01mol/LNaOH，加蒸馏水至250mL.
2)2%(w/v)的聚乙烯醇(PVA)溶液
称取20g聚乙烯醇(PVA)放入80 mL蒸馏水中，边搅拌边加热，使其完全溶解，自然冷却后加蒸馏水定容至100mL。用双层纱布过滤，保存滤液备用。
3）橄榄油乳化液
取橄榄油和聚乙烯醇按1：3比例混合，用高速组织搅拌机搅拌乳化3~5分钟，4℃备用。
4）0.025mol/L PH7.5磷酸缓冲液
甲液：称取化学纯KH2PO417.01g，加蒸馏水溶解定容至500mL.
乙液：称取化学纯Na2HPO444.77g, 加蒸馏水溶解定容至500mL.
吸取甲液13 mL，加入乙液100 mL，即成0.025 mol/L PH7.5磷酸缓冲液。以酸度计或精密试纸校正PH。使用时用蒸馏水稀释10倍，即成0.025 mol/L PH7.5磷酸缓冲液。
5)0.05mol/LNaOH溶液
称取分析纯NaOH4.5g，用蒸馏水溶解定容至1000mL(约0.1mol/L)，用邻苯二甲酸氢钾标定。然后再用蒸馏水稀释一倍，即为0.05 mol/LNaOH溶液，此液贮于附有钠石灰管的玻璃瓶中使用。
标定：精确称取105℃干燥至恒重邻苯二甲酸氢钾0.5000克置250mL锥形瓶中，加50mL煮沸后冷却的蒸馏水溶解，再加2滴1%酚酞指示剂（以95%中性酒精配制）以待标定的0.1mol/LNaOH滴定至微红色为终点。
N=W/(V×0.2042)
式中，N—NaOH溶液的摩尔浓度
W—邻苯二甲酸氢钾的克数
V—滴定消耗NaOH溶液的毫升数
0.2042—邻苯二甲酸氢钾的毫克摩尔
3.1.3主要仪器设备
表 1.2 使用的仪器设备
3.1.4 培养基的配制
1）富集培养基（%）
（NH
4）
2
SO
4
0.1，NH
4
NO
3
0.1，NaCl 0.1，MgSO
4
·7H
2
O 0.05，K
2
HPO
4
0.1，
橄榄油1.0，pH值为7.0。在0.056MP高压蒸汽灭菌30min[7]。
2) 分离培养基（%）
（NH
4）
2
SO
4
0.1，NH
4
NO
3
0.1，NaCl 0.1，MgSO
4
·7H
2
O 0.05，K
2
HPO
4
0.1，
琼脂1.5，橄榄油乳化液12.0，1.6%溴甲酚紫0.1，pH值为7.0。
3）初筛培养基（%）
（NH
4）
2
SO
4
0.1，NH
4
NO
3
0.1，NaCl 0.1，MgSO
4
·7H
2
O 0.05，K
2
HPO
4
0.1，
琼脂1.5，橄榄油乳化液12.0，1.6%溴甲酚紫0.1或者0.05%罗丹明B[10] 2.0，pH值为7.0。在0.056MP高压蒸汽灭菌30min。
4）种子斜面培养基（%）
NaNO
3 0.2，MgSO
4
·7H
2
O 0.05，K
2
HPO
4
0.1，KCl 0.05，FeSO
4
·7H
2
O 0.001，
蔗糖3.0，琼脂2.5，pH值为7. 0。
5）发酵培养基（%）
（NH
4）
2
SO
4
0.1，MgSO
4
·7H
2
O 0.1，K
2
HPO
4
0.1，蔗糖0.5，橄榄油0.5，蛋
白胨3.0，pH值自然
3.2 产脂肪酶菌株的筛选
3.2.1 富集培养
采集的土样称取5g溶于45mL无菌生理盐水（带玻璃珠）作1∶10稀释，充分摇匀，静止，取稀释液5mL加入到装有50mL富集培养基的三角瓶中，在摇床上30℃，180r/min，振荡培养5d。
3.2.2 平板分离
从产生混浊的富集培养液取样，作梯度稀释（10-2~10-7），即取富集样液1mL加入到9mL无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，制成浓度为10-2的稀释液，再从中吸取1mL加入到另一支9mL无菌生理盐水的试管中制成浓度为10-3的稀释液，以此类推梯度稀释到10-7，各取0.1mL涂布于分离平板，倒置，于30℃培养3d~5d，如果菌落周围形成黄色透明圈（脂肪酸与溴甲酚紫反应形成黄色透明圈），则表明该菌株能分解利用培养基中的油脂。
3.2.3 产脂肪酶菌株的初筛
将分离平板上的产酶菌落编号，接种到种子斜面培养基上，并同时分别转入含溴甲酚紫和含罗丹明B的初筛培养基平板上，30℃倒置培养，用游标卡尺测量菌落直径和变色圈直径，以变色圈直径与菌落直径的比值作为初筛依据，选出高酶活菌株。
3.2.4 产脂肪酶菌株的复筛
将初筛确定的高酶活菌株，从斜面培养基取菌，接入装有50mL产脂肪酶发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃振荡培养3d。将培养液用漏斗加滤纸过滤，取清液检测脂肪酶活力。
3.2.5脂肪酶产生菌的保藏方法
方法一：取2ml灭过菌的离心管，加入约1~2ml无菌蒸馏水；取分离到的已经活化的脂肪酶产生菌，刮取菌体于上述的离心管内，分别编号，于4℃下保藏。以上操作都在无菌条件下完成。
方法二：斜面保藏，取2ml灭过菌的离心管，加入1ml左右的油脂培养基，摆成斜面，待培养基冷却后，将生长旺盛的菌株接种到斜面，待其生长一定时间后，置于4℃下保藏，定期检查。
3.2.6 脂肪酶活性的测定
脂肪酶从橄榄油中分解出脂肪酸，这些脂肪酸又被过量添加的NaOH中和，然后用HCl回滴，可以测定出脂肪酸的量。在规定条件下，每分钟释放出1μmol 游离脂肪酸所需的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）。
反应乳化液的配制：取 5.0gPVA,加入100ml水，加热溶解，冷却后用2mol/LNaOH调至7.8，过滤，定容为100ml，加入橄榄油，两者比例为4:1，在摇床上振荡乳化至乳白色。
0.1mol/LTris-HCL缓冲液的制备：称取，加入12.144g Tris-B，用1L水溶解，用1mol/LHCL调pH8.0,备用，需新鲜配制。
0.05mol/LNaOH溶液的制备：取4.58g固体NaOH溶于1L水中，用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时稀释1倍。
1%酚酞做指示剂，95%乙醇作反应终止剂
橄榄油乳化液4 mL，0.1mol/LTris-HCL缓冲液4 mL，稀释的待测酶液2mL。取100ml三角瓶2只，分别加入上述反应液，37℃水浴反应20min后加待测酶液前需预热5min左右），加入10 mL95%乙醇终止反应。取出，于空白和样品中各加入2滴酚酞做指示剂，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为终点。记录消耗的NaOH体积，对照组的乙醇终止剂应在加入酶液之前加入。
酶活计算：U = (V - V0) ×50 ×n/t
式中： U —样品的酶活力；
V—滴定样品时消耗0.05mol/L NaOH标准溶液的体积；
V0—滴定对照时消耗0.05mol/L NaOH标准溶液的体积；
50—0.05mol/L NaOH标准溶液1.00ml相当于50umol脂肪酸；
n —酶液体积
t—反应时间/min
第四章结果与讨论
4.1结果
4.1.1 产生脂肪酶菌株的菌落形态鉴定
菌株在溴甲酚紫的培养基上30℃培养5d的菌落呈乳白色，不透明，表面光滑隆起，湿润，边缘不整齐，周围的水解圈呈黄色，且透明。菌株在罗丹明B 初筛培养基上30℃培养2d后呈深粉色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐极尽圆形，周围水解圈呈白粉色且不透明[9]。
4.1.2 产生脂肪酶菌株的筛选
经过筛选得到了25株产脂肪酶的细菌菌株，用游标卡尺测量出其直径以及水解圈大小，并计算出水解圈与菌株直径大小比值，其比值范围在 1.97~4.87之间（表1）。菌株编号为01~08号、09号、10~15号、16~21号、22~25号分别是由10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度产生。大小形态以及比值相差不大并集中居多的在10-4浓度处。
4.1.3 产脂肪酶高酶活菌株酶活力测定
由表2可知，筛选出来的菌株脂肪酶的活性与水解圈和菌株大小的比值呈一定的线性关系：脂肪酶的活力随着水解圈与菌株大小的比值的变化而变化。4.2讨论
4.2.1脂肪酶产生菌的筛选
菌种筛选是一项工作量较大的工作，要快速、高效的分离到有用的菌株，必需建立一套有效的筛选方法模型[8]。本实验采用的分离方法是溴甲酚紫显色法，此方法是利用了脂肪酶水解脂肪产酸导致生长环境PH值下降，显示指示剂的存在可以使细菌周围形成显色圈，根据水解圈直径与细菌菌落直径之比大小作为初筛依据。本实验用于筛选的指示剂是溴甲酚紫，筛选效果不太理想，对于产酶能力强的菌株，显色效果明显，而由于溴甲酚紫的变色范围位4.0~6.8比较狭窄，导致有些产酶能力不强，但对于生长环境偏碱性的弱脂肪酶菌则显色效果差。甚至不显色。另外利用酸碱显色反应的原理筛选的过程中，有可能存在其他因素使
培养基中出现酸而不是酶水解产酸而出现的酸碱显色反应，例如，有些微生物本身能够产酸。这样根据变色圈来分离产脂肪酶的微生物的误差有点大。
现在脂肪酶分离筛选使用的底物很多，包括三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、橄榄油等。三丁酸甘油酯作底物时因其链长太短，且价格昂贵而被放弃；橄榄油被很多研究者作为底物来分离脂肪酶菌。
4.2.2 菌株的鉴定
菌株在溴甲酚紫的培养基上30℃培养5d的菌落呈乳白色，不透明，表面光滑隆起，湿润，边缘不整齐，周围的水解圈呈黄色，且透明。菌株在罗丹明B 初筛培养基上30℃培养2d后呈深粉色，不透明，表面光滑，隆起，湿润，边缘整齐极尽圆形，周围水解圈呈白粉色且不透明。
第五章结论
通过溴甲酚紫及罗丹明B平板筛选法对脂肪酶产生菌进行筛选，得到25株为可精确测量出菌落大小及水解圈大小的细菌，以其水解圈与菌株直径大小比值为初筛依据确定高酶活性菌株，比值越大活性越高，挑选出比值在3.0以上的菌株进行摇瓶复筛，得到10株脂肪酶产生菌，其酶的活性在15U/mL~21U/mL。这与董明奇等[6]报道的脂肪酶高产菌株的筛选及酶学特性研究中的酶活比较数据范围4U/mL~22U/mL大体相似，且属于其范围的一个子集。本实验中得到酶的活力随着水解圈与菌株的比值的减小而减小的结论与张胜利等[10]报道的水解圈与菌体的比值和酶的活性呈线性关系一致。本研究只是对筛选出来的菌种做了初步的形态鉴定，其生理生化性质和分子鉴定部分有待于进一步研究。
表1 筛选到的菌株大小以及水解圈比值
Table 1. Screening to strains of size and hydrolysis circle ratio
表2 筛选到的菌株酶的活性比较
Table 2. Screening to strains of the enzyme activity
本次实验并未取得理想中的效果，分析其原因总结如下：（1）本实验从桶壁上筛选得到25株菌均是细菌，而野生菌的产酶能力较低，不利于生产中的应用，若想得到一株能应用生产中的高产酶能力的菌，还得进行
大量的筛选。
（2）目前，我们仅对野生菌株进行了产酶条件的初步探索，要得到活性更高、性状更好的菌株，需要对菌种进行改良，或者基因的改造等分子手段来提高菌株的酶活性。
致谢
在即将完成论文之际，首先感谢我的导师。从论文的选题、实验方案的设计到论文写作，无不浸透着导师的学术思想和心血。三年来，我得到恩师的悉心教诲，导师执着的敬业精神，严谨的治学态度，深邃的科学洞察力，勇于创新的科学精神，忘我的工作作风，严肃豁达的人生观，使我终生受益，并永远激励我奋发向上。毕业在即，在此谨向老师表示我最衷心的感谢！
同时感谢本实验室老师在学习上的关心和帮助。
本篇毕业论文的写作也得到了同组同学的热情帮助。感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学，和曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们，在此，我再一次真诚地向帮助过我的老师和同学表示感谢！
参考文献
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脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
sn-1,3位专一性脂肪酶在食品工业中的应用
2013~2014学年第一学期 《生物技术在食品中的应用》第二次作业 论文题目：sn－1,3位专一性脂肪酶在食品工业中的应用 学院：生物与农业工程学院 专业：食品科学与工程 班级：XXXXX 学号：XXXXX 姓名：XXXXX 任课教师：XXXXX
sn－1,3位专一性脂肪酶在食品工业中的应用 生物与农业工程学院4XXXX9 XXXX 摘要：由于油脂中三酰甘油的1,3位和2位的脂肪酸对油脂的理化、营养和生理特性方面有较大的差异，因此专一性水解三酰甘油1,3位的脂肪酶成为研究的热点。文章综述了sn－1,3位专一性脂肪酶在结构脂质、母乳脂肪替代品、类可可脂和甘油二酯等方面的应用，并展望了今后的研究开发方向及前景。 关键词：sn－1,3位专一性脂肪酶；结构脂质；母乳脂肪替代品；类可可脂；甘油二酯；前景展望 脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，主要水解三酰甘油的酶。它作用在体系的亲水-疏水界面层，其催化部位含有亲核催化三联体（Ser-Asp-His）或（Ser-Glu-His），催化部位被埋在蛋白质分子中，表面由相对疏水的氨基酸残基形成。脂肪酶按照其底物的专一性分为三大类：第一类是非专一性脂肪酶，表现为三酰甘油被水解为游离脂肪酸和甘油；第二类是脂肪酸专一性脂肪酶，表现为专一性地水解特定类型的脂肪酸; 第三类是位置专一性脂肪酶，这类脂肪酶对于三酰甘油特定位置的脂肪酸优先水解，主要是三酰甘油的1位和3位，因此也被称为sn－1,3位专一性脂肪酶。最近，随着对三酰甘油中脂肪酸不同位置对人体的生理功能不同的深入了解，研究者对sn－1,3位专一性脂肪酶表示出独特的兴趣和关注。 1 酶法合成结构脂质 结构脂质(SLs)是经化学或者酶法改变甘油骨架上脂肪酸组成和(或者)位置分布，得到具特定分子结构的三酰基甘油[1]。通过改变三酰基甘油骨架上脂肪酸组成及位置分布，可最大限度地降低脂肪本身潜在的或不合理摄入带来的危害，最大限度地发挥脂肪的有益作用[2]。 目前合成SLs主要有化学方法和酶法。化学法一般是以碱金属为催化剂，通常反应条件剧烈、产物难于分离、副反应多且采用的化学试剂容易污染环境。相比之下，脂肪酶具有精确的位置特异性、化学基团专一性、脂肪酸链长专一性和立体结构专一性，因此，可根据需要对期望的产品实现精确的控制，并可以随意设计具有特定生理功能的健康油脂疗效油脂[3]。SLs根据应用功能的不同分为很多种，如MLM型、强化多不饱和脂肪酸的SLs、低热量油脂等。 MLM型SLs即在C-1，C-3位上携带有2条8-12个碳的直脂肪酸链，而在2位上是长不饱和脂肪酸链，如亚油酸和亚麻酸。MLM摄入体内在脂肪酶和胰酶的作用下，以中等脂肪酸和长链脂肪酸的中间速度被水解，有较高的柔水性，比长链有更强的消化吸收性，并提供了足够必需脂肪酸。MLM可以同时满足能量需要和必需脂肪酸的需要，具有特殊的营养价值[4]。MLM型的结构脂质通常是通过sn－1,3－专一性脂肪酶对中链脂肪酸三酰甘油(MCT)和长链脂肪酸(LCT)进行酯交换或者催化LCT与中链脂肪酸乙酯得到的。Kuan－Hsiang Huang等[5]采用Rhizomucormiehei产生的固定化酶IM60催化三油酸甘油酯和辛酸乙酯的酯交换，他们对8种脂肪酶进行了考察，最终选定了催化活性最高的IM60。李琳媛等[6]利用固定化脂肪酶Lipozyme TL IM催化酯交换合成MLM结构的SLs。 Lee等[7]使用固定化专一性脂肪酶催化脂肪酸三酰甘油与二十二碳五烯酸乙酯酯交换，得到一种SL,并证实IM60固定化脂肪酶有较高的1,3位专一性。 利用sn－1,3位专一性脂肪酶生产低热量油脂也是最近研究的热点。短链脂肪酸( SCFA) 具有分子量小、分解迅速、单位量产能少等特点，而SCFA主要位于三酰甘油的sn－3位，因此利用sn－1,3位专一性脂肪酶将丙酸、丁酸等短链脂肪酸引入三酰甘油可制成低热量的油脂。最近国对大豆油进行改性的研究，使用Lipozyme RM IM催化大豆油与辛酸酸解反应，制备高附加值的低热量型功能性脂[8]。 2 合成母乳替代品 婴儿体内血浆、组织和细胞膜的脂类组成模式依赖于母乳中脂类的组成。随着对母乳脂肪的研究深入，母乳脂肪酸的特点已经被人们所知，在婴儿配方奶粉中添加DHA、ARA等已经广泛用于生产。近来的研究表明，乳脂中饱和脂肪酸主要是棕榈酸的结构位置对婴儿的生长发育起到了关键的作用。
急性胰腺炎患者的血清淀粉酶和脂肪酶的变化情况及临床价值分析
急性胰腺炎患者的血清淀粉酶和脂肪酶的变化情况及临床价 值分析 摘要：目的：探究急性胰腺炎患者的血清淀粉酶和脂肪酶的变化情况并分析其临床价值。方法：选取在我院接受急性胰腺炎治疗的146名患者，按照病因的不同将其分为三组：胆源性急性胰腺炎患者51例，酒精性急性胰腺炎患者28例，其他病因的急性胰腺炎患者67例。又按照病情的严重程度和CT检查结果将这些患者分为三组：轻度患者42例，中度患者73例，重度患者31例。通过分析患者的血清淀粉酶浓度、脂肪酶浓度以及脂肪酶浓度/血清淀粉酶浓度，得出实验结论。结果：酒精性急性胰腺炎患者的血清淀粉酶浓度明显低于胆源性和其他患者（P<0.05），三组患者的脂肪酶浓度相差不大，不具有统计学意义（P＞0.05）；轻度、中度、重度急性胰腺炎患者的血清淀粉酶浓度、脂肪酶浓度以及两种指标的比值均相差不大，不具有统计学意义（P＞0.05）。结论：酒精性和非酒精性患者能够通过血清淀粉酶浓度来鉴别，而轻、中、重度患者则不能通过脂肪酶浓度/血清淀粉酶浓度来判定。 关键词：急性胰腺炎；血清淀粉酶；脂肪酶；临床价值 1.前言 急性胰腺炎（AP）是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应。本次实验选取146例急性胰腺炎患者，将其按照病因（胆源性、酒精性、其他）分为三组，又按照病情程度（轻度、中度、重度）分为三组，然后分析各组患者的血清淀粉酶浓度、脂肪酶浓度、脂肪酶浓度/血清淀粉酶浓度，现报到如下。 2.资料与方法 2.1一般资料 此次实验选择2014年3月到2015年3月在我院进行过急性胰腺炎治疗的146例患者，从患者的记录资料可见，患者的年龄为20~76岁，平均年龄 47.23±0.69岁，其中男性患者有86例（58.9%），女性患者60例（41.1%）。按照《急性胰腺炎分类标准发展变迁与现状》所述的分类标准[2]，按照病因将患者分为胆源性（51例）、酒精性（28例）、其他（67例）三组。另外按照病情严重情况和CT检查结果将患者分为轻度（42例）、中度（73例）、重度（31例）三组。 2.2方法 在患者入院当天，医护人员立即采集患者的筋脉血液，利用干化学法检测血液中含有的血清淀粉酶浓度（参考范围0~108U/L）、脂肪酶浓度（参考分为 23~300U/L），并分析两者的比值。 2.3观察指标 检测分析患者的血清淀粉酶浓度、脂肪酶浓度以及脂肪酶浓度/血清淀粉酶浓度。 2.4统计学分析 这次试验中，选择spss18.0对数据进行统计，采用均数±标准差（ ±s）表示数据，采用t检验来比较均数，用χ2检验来比较计量资料。当P<0.05时，差异具有统计学意义。 3.结果 3.1不同病因患者的分析结果
脂肪酶拆分外消旋_苯乙胺的研究进展
the formation of flavour components in cider[J].J I Brewing,1988,94 (6):391-395. [26]MANGAS J J,GONZALEZ M P,RODRIGUZE R,et al.Solid-phase extraction and determination of trace aroma and flavour components in cider by GC-MS[J].Chromatographia,1996,42:101-105. [27]WILLIAMS A A,MAY H V.Examination of an extract of cider volatiles using both electron impact and chemical ionization gas chro-matography-mass spectrometry[J].J I Brewing,1981,87:372-375. [28]POLLARD A,KIESER M E,STEVENS P M,et al.Fusel oils in ciders and perries[J].J Sci Food Agr,1965,16:384-389. [29]龙明华.以浓缩苹果汁酿造的苹果酒挥发性香气成分分析[J].酿酒 科技，2006（6）：94-95. [30]彭帮柱，岳田利，袁亚宏，等.气相色谱-质谱联用法分析苹果酒香气 成分的研究[J].西北农林科技大学学报，2006，31（1）：71-74. [31]岳田利，彭帮柱，袁亚宏.基于主成分分析法的苹果酒香气质量评价 模型的构建[J].农业工程学报，2007，23（6）：223-227. [32]林巧，杨永美，孙小波，等.苹果酒发酵条件的控制与研究[J].中国 酿造，2008（10）：60-63. 手性是自然界化合物的普遍特征。构成自然界物质的一些手性分子虽然从化学式组成来看是一模一样，但其空间结构完全不同，其性质也是不同的[1]。如DL-（±）-合霉素的治疗效果仅为D-（-）-氯霉素的一半；20世纪50年代欧洲发生的“海豹儿”出生的灾难性事故，正是由于“反应停”是一种外消旋的手性药物，其（R）型异构体具有镇静作用，而（S）型却具有致畸作用。因此，如何将物质纯化为光学纯级别是目前化学工业的重要研究目标。α-苯乙胺（DL-α-Phenylethylamine）是一种有着良好应用前景的化工中间体原料，由于α-苯乙胺分子中含有一个手性中心，可分为（R）和（S）2种对映异构体及外消旋α-苯乙胺，其中（R）、（S）这2种单一对映体既可以作为某些外消旋有机酸或醇类物质的手性拆分试剂，又可以作为不对称合成的手性原料，因此是一种重要的手性中间体[2]。目前光学纯级别化合物的获得方法主要有手性合成和外消旋体拆分2种。本文主要阐述利用脂肪酶对外消旋α-苯乙胺的拆分研究进展。 1脂肪酶拆分机理 分子模拟研究表明，对映体在Candida Antarctica脂肪酶B活性中心以不同的方式定向[3]。手性底物的对映体以不同方式定向和结合到酶活性中心，这一事实可以作为改变对映体选择性的依据。目前被普遍接受的是“立体特异性口袋”理论：在酶的立体结构中存在着一个氧负离子空洞，称为“活性口袋”，这个活性口袋是由几个氢键供体构成的，主要为酶骨架及其侧链中酰胺的质子。而决定脂肪酶底物选择性的最重要因素正是活性口袋的空间限制和疏水性质以及四面体中间体的稳定性。JENSEN R G等[4]通过研究Candida Antarctica脂肪酶B与2-己酸辛酯的过度态结构对该脂肪酶的立体选择性进行了分析，从结构来看，酶活性部位是由一个丝氨酸、一个组氨酸和一个天冬氨酸的残基（Ser-His-Asp）组成的“催化三联体”，并且活性部位呈“手性”构象，具有高度选择的特征。脂肪酶在催化过程中将这种特征传递给手性底物，使反应具有内在的选择性，即优先催化底物中的某些组分，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异[5]。 2脂肪酶的选择 酶法拆分手性物质主要是利用酶的立体选择性，整个反应过程就是外消旋底物的2个对映体竞争酶的活性 脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺的研究进展 吴华昌，由耀辉，邓静，马钦远 （四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000） 摘要：利用脂肪酶拆分外消旋α-苯乙胺是目前生产光学纯α-苯乙胺的重要方法之一，文中主要从脂肪酶拆分机理、脂肪酶的选择、酰化剂的选择及反应体系溶剂的确定等方面，阐述近年来国内外研究状况。 关键词：脂肪酶；光学纯；酰化剂；溶剂 中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）05-0023-03 Chiral resolution of racemicα-phenylethylamine by lipase WU Huachang,YOU Yaohui,DENG Jing,MA Qinyuan (Department of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong643000,China) Abstract:Chiral resolution by lipase is an important way for production of optically pureα-Phenylethylamine.Mechanism of chiral resolution by lipase,choice of lipases and acylation agents,and selection of reaction solvent was reviewed in the paper. Key words:lipase;optical purity;acylation agent;solvent 收稿日期：2009-12-11 作者简介：吴华昌（1970-），男，四川隆昌人，副教授，主要从事非水相酶催化应用研究工作。 ααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααααα
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、 原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是 脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁 酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
脂类代谢关键酶
1.胆固醇合成 乙酰乙酰CoA硫解酶 （1）2×乙酰CoA——————————→乙酰乙酰CoA HMG CoA合成酶 （2）乙酰乙酰CoA——————————→HMG CoA HMG CoA还原酶 （3）HMG CoA—————→MV A—→鲨烯（30C）—→胆固醇（27C） 关键酶 2. HMG CoA还原酶的调节 3.脂肪动员过程
HSL甘油二酯酶甘油一酯酶甘油激酶 甘油三酯——→甘油二酯———→甘油一酯———→甘油———→3—磷酸甘油↓↓↓（肝、肠、肾）↓游离脂酸游离脂酸游离脂酸糖代谢或异生4.脂肪动员关键酶 HSL（激素敏感性甘油三酯脂酶） （1）HSL活性增加：肾上腺素、胰高血糖素、ACTH、TSH （脂解激素） （2）HSL活性降低：胰岛素、前列腺素E2 （抗脂解激素） 5.脂酸的分解 （1）脂酸的活化—————→脂酰CoA生成（线粒体外进行），消耗2个高能磷酸键 脂酰CoA合成酶、A TP 脂酸+ CoA-SH——————————→脂酰～SCoA + PPi(迅速水解) （2）脂酰CoA进入线粒体 肉碱脂酰转移酶Ⅰ(限速酶)
（3）β-氧化 （4）能量产生 2n碳原子的脂酸————（n-1）次β-氧化 （n-1）分子FADH2 （n-1）分子NADH + H+ n分子乙酰CoA 共产生 1.5×（n-1）+ 2.5×（n-1）+10×n-2=(14n-6)分子ATP 脂酸的合成（胞液）————关键酶：乙酰CoA羧化酶 主料———乙酰CoA 辅料———ATP、NADPH、HCO3-（CO2）、Mn2+、生物素（辅基） 乙酰CoA羧化酶、生物素、Mn2+ 乙酰CoA + ATP + HCO3-————————————→丙二酰CoA +ATP+Pi
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
脂肪酶
第一章概述 脂肪酶(Lipase，E C．3.1.1.3)是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇形成甘油三酸酯酯键的酶。198年,Klibanov A M 等用脂肪酶粉或其固定化酶在有机溶剂体系中成功地催化合成了一系列有机物, 开始了脂肪酶非水相酶学的研究[1]。随着研究的深入, 发现脂肪酶具有良好的醇解、胺解、酯化和转酯等特性, 可被广泛地应用于有机合成、精细化工、药物中间体合成、手性化合物拆分以及生物能源等诸多领域。近年来,通过对界面酶学和非水相酶学的研究，从而进一步拓展了脂肪酶的应用领域，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成大量高价值的产物，此外，脂肪酶在食品、医药、皮革和洗涤剂等许多工业领域中也有广泛的应用，充分显示了其巨大的应用潜力。 产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，而实际上可能更多。脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化。脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，而脂肪酶高产菌的筛选通常采用含甘油三酯的琼脂平板法，并通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多利亚蓝等作为筛选标记，然后采用不同的方法对培养条件进行优化。其筛选的一般过程是：样品分离→富集培养→平板初筛→摇瓶复筛。不同微生物合成脂肪酶的能力不同，因此，要达到工业用脂肪酶生产微生物的要求，首先要筛选和诱导出与所需酶学性质相符的高产菌株，或者构建高表达量的重组基因工程株。
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据
苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法． １．３．３对硝基苯酚法 对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积． ２３种方法的比较 ２．１实验仪器和操作难易程度的比较 平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）． ２．２实验试剂及精确度的比较 平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）． ２．３各种方法的适用范围 平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）． 表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较 ３结论 在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活． 致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助． 参考文献： ［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１． 万方数据
糖类代谢和脂肪代谢
第四章生命的物质变化和能量转换 第4节生物体内营养物质的转变 一、教学目标： 知识与技能：1、知道糖类、脂肪在生物体内的代谢过程。 2、知道糖类、脂肪之间的转变关系。 3、初步学会用所学知识解释日常生活中的营养物质转变实例。 过程与方法：通过分析日常生活中糖类、脂肪代谢及相互转变的实例，感受这两大类营养成分在体内的代谢过程。 情感态度与价值观：通过学习营养物质的相互转变，逐步养成科学合理的饮食习惯。 二、重点： 1、糖类的代谢 2、脂肪的代谢 三、难点： 糖类、脂肪之间的转变过程及途径 四、教学准备： 多媒体课件、学案 五、教学过程
附：生物体内营养物质的转变（学案） 学习目标： 1．知道糖类、脂肪在生物体内的代谢过程 2．知道糖类、脂肪之间的转变关系 3．通过学习营养物质转变，结合生活实际，养成健康的饮食与生活习惯 学习重点： 糖类、脂肪代谢过程 学习难点： 糖类、脂肪的相互转变 学习过程： 一．自主学习 1．知识回顾：人体消化系统组成、食物消化过程与消化酶；物质进出细胞的方式；生物体中能源物质的种类；细胞有氧呼吸的过程（三羧酸循环） （1）人体所需营养物质主要有_______________________________ _ ； 可以通过_____________途径获得。当我们吃了食物，实际上食物__________(是，不是)已经进入了人体，而是需要先经过___________________然后才能够被利用。 （2）三大主要营养物质分别是____________、______________、________________； 淀粉的消化过程是：___________________________________________________ _ ；消化的最终产物是___________，以________________方式被小肠上皮细胞吸收。 蛋白质的消化过程是：_________________________________________________ ；消化的最终产物是___________，以________________方式被小肠上皮细胞吸收。 脂肪的消化过程是：________________________________________ ____________；消化的最终产物是__________和_________，以______________方式被小肠上皮细胞吸收。2．阅读，思考，讨论： 糖类代谢 （1）生物体细胞主要以__________________方式利用葡萄糖获得能量。 （2）动物体内的___ 细胞和细胞可以以形式储存一定量的糖类物质。（3）北京填鸭在肥育期要填饲过量的糖类饲料，减少运动，从而使鸭在短期内变成肥鸭，这说明什么？ （） 脂类代谢 （1）为什么长期偏食高油、高脂食物的人更容易肥胖？ （2）饮食中摄入脂肪就不能控制体重了吗？
脂肪酶与淀粉酶的临床意义
脂肪酶与淀粉酶的临床意义 （源于丁香园） 急性胰腺炎是一种常见且较为严重的急腹症，其发病迅猛，病死率高。急性期胰腺炎和其他急腹症较难鉴别，且重型胰腺炎发病率逐渐增多，因而急性胰腺炎的及时准确诊断尤为重要。 急性胰腺炎临床症状多有典型的腹痛、恶心、血清淀粉酶和脂肪酶水平升高。每一天都有很多的淀粉酶和脂肪酶测定用于评估腹痛患者，甚至是常规生化检查的一部分。 血清淀粉酶是临床应用最广泛的急性胰腺炎酶学诊断指标之一，优点是技术简单，容易获得，灵敏度高。脂肪酶存在于胰腺腺泡内，当患者发生胰腺炎时，腺泡出现损伤并致使脂肪酶进入血液循环从而导致血清中脂肪酶含量升高。脂肪酶作为胰腺组织分泌的消化酶，在胰腺疾病的特异性较淀粉酶高，可作为胰腺疾病的主要辅助诊断指标。 然而在平常实际工作中，我们经常会遇到急性胰腺炎患者，有的血清淀粉酶升高而脂肪酶活性不升高；有的脂肪酶活性升高而血清淀粉酶不升高；有的淀粉酶和/ 或脂肪酶升高却不被诊断为急性胰腺炎，所有这些叫检验人员和临床医师无所适从，因为解释这些测试结果可能非常困难。 血清淀粉酶和/ 或脂肪酶正常，能诊断急性胰腺炎吗？胰腺急性炎症和自身消化导致淀粉酶和脂肪酶的释放，血液中的水平升高。出于这个原因，在急性腹痛患者血清淀粉酶和脂肪水平正常通常会排除急性胰腺炎的诊断，诊断急性胰腺炎脂肪酶阴性预测值非常高（≥95%）。然而，由于多种原因，胰腺炎的诊断却可能极具挑战性。急性胰腺炎时，患者可表现为正常的血清淀粉酶和脂肪酶，实在是令人大跌眼镜。 根据一些学者研究发现，19%～32% 的急性胰腺炎患者有正常的血清淀粉酶。因此，单纯检测血清淀粉酶诊断急性胰腺炎的敏感度和特异性还是有一定的局限性。有报道指出，伴高甘油三酯急性胰腺炎患者的血尿淀粉酶水平不升高，其原因是不确定的，最有可能是某些血清因素抑制了酶的活性。急性酒精性胰腺炎也常常有正常的血清淀粉酶水平，单纯依靠高淀粉酶血症，对于急性酒精性胰腺炎的诊断是不合理的，应该放弃。在急性胰腺炎时正常血清淀粉酶可以见到，但正常血清脂肪酶是极其罕见的。Shafqet 等报告了首例氢氯噻嗪引起的急性胰腺炎患者正常脂肪酶。Shah 等认为，临床上对于急性胰腺炎的诊断，正常血清淀粉酶和脂肪酶应该被予以接受。急性胰腺炎时表现为正常的血清淀粉酶和脂肪酶可出现在高甘油三酯血症、大量胰腺坏死、胆石胰腺炎、酒精性胰腺炎及急性胰腺炎恢复期患者等疾病中。重症胰腺炎时由于胰腺组织大量坏死，胰腺腺泡严重破坏，淀粉酶生成很少，脂肪酶不能再分泌，导致血淀粉酶/ 脂肪酶反而可能不高。正如肝衰竭时转氨酶进行性下降一
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。 关键字：脂肪酶，酶活测定，非水相，食品工业应用。 简介：脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。脂肪酶最早被发现可追溯至1901年，其天然作用底物为三脂酰甘油酯，能够将酯键水解，释放甘油二酯甘油一酯甘油以及游离脂肪酸随着非水酶学的发展，研究者发现，脂肪酶在非水相中能够催化酯化。酯交换以及转酯化反应，并且具有高度的选择性和专一性，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。但是，由于目前脂肪酶相对于传统的化学催化剂的生产成本仍然偏高，这是制约脂肪酶工业化应用的主要问题，因此，在了解脂肪酶催化特性的基础上，通过筛选高产菌株，或者改变脂肪酶催化环境等方法提高脂肪酶的产率和利用率，降低利用脂肪酶进行工业化生产的成本是目前急需解决的主要问题。 1、脂肪酶的结构特点 研究表明, 来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270~ 641不等,其分子量为29 000~ 100 000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,并利用X -衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组( triad)结构。多数脂肪酶都是单链蛋白, 比如CCL( A) 含有534个氨基酸残基, 其组成3 个小的和11个大的β-折叠及10个α-螺旋。其催化活性三元组由Ser-209、His-449和Glu341组成, Ser-209处于超二级结构折叠-螺旋[β-折叠( 202~208)-α -螺旋( 210~220) ]的转角处。多数成熟的天然蛋白还含有糖类组分, 如CCL( A) 含有4. 2%葡萄糖、甘露糖和木糖等,所以实际测得的分子量比理论分子量偏大[157 223(理论) , 60 000(实测)]。 脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时“盖子”覆盖在酶的活性位点上。酶难以靠近底物分子而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开. 近年来发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构在关闭状态酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时疏水端会暴露出来隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域引起脂肪酶的构象改变增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活。 2、脂肪酶的来源 脂肪酶是一种普遍存在于生物体的酶类，具有重要的生理学意义，同时也具有工业化应用的潜在可能性脂肪酶能够催化三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化酯交换以及转酯化反应。在真核生物体内，脂肪酶参与许多类脂化合物的代谢过程，包括脂肪的消化、吸收、利用以及脂蛋白的代谢，在植物中，脂肪酶存在于储存能量的组织中。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65 个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数
生物化学脂质代谢知识点总结(精选.)
第七章脂质代谢 第一节脂质的构成、功能及分析 脂质的分类 脂质可分为脂肪和类脂，脂肪就是甘油三脂，类脂包括胆固醇及其脂、磷脂和糖脂。 脂质具有多种生物功能 1.甘油三脂机体重要的能源物质 2.脂肪酸提供必需脂肪酸合成不饱和脂肪酸衍生物 3.磷脂构成生物膜的重要组成成分磷脂酰肌醇是第二信使前体 4.胆固醇细胞膜的基本结构成分 可转化为一些有重要功能的固醇类化合物 第二节脂质的消化吸收 条件：1，乳化剂（胆汁酸盐、甘油一酯、甘油二酯等）的乳化作用； 2，酶的催化作用 位置：主要在小肠上段
第三节甘油三脂代谢 甘油三脂的合成 1.合成的部位：肝脏（主要），脂肪组织，小肠粘膜 2.合成的原料：甘油，脂肪酸 3.合成途径：甘油一脂途径（小肠粘膜细胞） 甘油二脂途径（肝，脂肪细胞）
注：3-磷酸甘油主要来源于糖代谢，部肝、肾等组织摄取游离甘油，在甘油激酶的作用下可合成部分。 内源性脂肪酸的合成： 1.场所：细胞胞质中，肝的活性最强，还包括肾、脑、肺、脂肪等 2.原料：乙酰COA，ATP，NADPH，HCO??，Mn离子 3.乙酰COA出线粒体的过程：
4.反应步骤 ①丙二酸单酰COA的合成： ②合成软脂酸：
③软脂酸延长在内质网和线粒体内进行： 脂肪酸碳链在内质网中的延长:以丙二酸单酰CoA为二碳单位供体 脂肪酸碳链在线粒体中的延长:以乙酰CoA为二碳单位供体 脂肪酸合成的调节： ①代谢物的调节作用： 1.乙酰CoA羧化酶的别构调节物。 抑制剂：软脂酰CoA及其他长链脂酰CoA 激活剂：柠檬酸、异柠檬酸 糖代谢增强，相应的NADPH及乙酰CoA供应增多，异柠檬酸及柠檬酸堆积，有利于脂酸的合成。 ②激素调节： 甘油三脂的氧化分解： ①甘油三酯的初步分解： 1.脂肪动员：指储存在脂肪细胞中的脂肪，被肪脂酶逐步水解为FFA及甘油，并释放入血以供其他组织氧化利用的过程。 2.关键酶：激素敏感性甘油三脂脂肪酶（HSL）
探讨血清淀粉酶、血清脂肪酶联合检测在急性胰腺炎诊断中的临床价值
探讨血清淀粉酶、血清脂肪酶联合检测在急性胰腺炎诊断中的临床价值 发表时间：2016-09-14T11:39:27.553Z 来源：《心理医生》2016年12期作者：张永颖 [导读] 对比AMY，LPS器官特异度更强，升高时间更早，且维持的时间更长，因此在急性胰腺炎的诊断中效果更佳。 （牡丹江市第一人民医院检验科黑龙江牡丹江 157011） 【摘要】目的：分析血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LPS）检测方式在急性胰腺炎诊断中的临床价值。方法：选取80例急性胰腺炎患者分为重度和轻度急性胰腺炎组，和50例健康体检者行AMY与LPS检测，对比三组的检测结果。结果：重度急性胰腺炎组与轻度急性胰腺炎组患者的AMY、LPS水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度急性胰腺炎组AMY、LPS水平比轻度急性胰腺炎组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：AMY联合LPS检测可以为急性胰腺炎提供重要的诊断依据。 【关键词】血清淀粉酶；脂肪酶；急性胰腺炎；临床价值 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）12-0078-02 急性胰腺炎（AP）是消化系统中较为常见的疾病，具有病情发展快、并发症多的特点，该病患者如疾病迅速恶化极易产生各种严重并发症，甚至导致多器官功能的衰竭。随着人们生活水平的提高，长期存在高脂饮食与不良生活习惯者在增加，使得急性胰腺炎的发患者数也进一步增多。临床收治的急性胰腺炎多数为轻型患者，经过相关纠正治疗后预后大多较好，但也存在部分患者的病情程度较深，不但会表现出胰腺器官的多种病症，也会伴随较为严重的全身性炎症反应或大量器官的严重损伤。对于重型急性胰腺炎，早期诊断比临床治疗具有更重要的作用[1]。血清淀粉酶与脂肪酶的联合检测是该疾病常见的临床检验项目，为进一步探寻诊断效果更好的检测，我院对急性胰腺炎患者进行了淀粉酶与脂肪酶的联合检验，现报道如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 选取我院2014年10月～2015年6月收治的急性胰腺炎患者80例，其中男52例，女28例，年龄24～80岁，平均（53.2±15.3）岁。将80例急性胰腺炎患者分为重度急性胰腺炎组38例和轻度急性胰腺炎组42例，选取同时期体检科50例健康体检者为对照组，两组在一般资料上比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 1.2 方法 所有受试者均在清晨空腹状态下抽取静脉外周血3ml，室温静置凝血后置于离心机中离心。检测淀粉酶和脂肪酶的含量。淀粉酶含量的标准范围0～220U/L，超过220U/L判断为阳性;脂肪酶的标准范围为5.6～51.3U/L，超过51.3U/L判断为阳性。 1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件录入数据，血清学指标、临床症状等计量资料用（x-±s）表示，采用方差分析进行比较，灵敏性、准确性、特异性等计数资料用频数（n）或率（%）表示，相关性分析采用一元线性回归分析，P＜0.05为差异有显著性。 2.结果 检测结果如下。健康对照组：AMY（84.74±21.16）U/L、LPS（92.73±49.87）U/L；轻度急性胰腺炎组：AMY（569.32±378.33）U/L、LPS（1177.91±675.12）U/L；重度急性胰腺炎组：AMY（774.31±728.64）U/L、LPS（1738.48±1668.43）U/L。重度急性胰腺炎组与轻度急性胰腺炎组患者的AMY、LPS水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度急性胰腺炎组AMY、LPS水平比轻度急性胰腺炎组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3.讨论 急性胰腺炎的发病，是由于胰腺被自身消化酶消化所造成的，引起此反应的原因多种多样，如外伤性、自身反应性、暴饮暴食等。是一种急性的胰腺自我消化的化学性炎症，常伴有相邻、相近的一系列其他器官的功能损伤。急性胰腺炎具有进展快、病情重、发病急的特点，死亡率非常高，对体内的内环境及重要脏器具有严重的损伤作用，也会有猝死的表现。曾有相关文献报道，急性胰腺炎中重型胰腺炎的死亡率可达到20%[2]，50%患者常伴有并发症的出现，所以早期快速诊断急性胰腺炎具有非常重大的意义。 AMY与LPS是已在临床上得以普及的检验项目。其中，AMY在患者血清中升高的规律为3～12h即开始持续性升高，1～2d内到达最高值，发病2d后大部分患者AMY水平会趋于正常，但是也有极个别患者的AMY水平升高后会持续1周以上。所以，对于12h内发病、出现上腹部剧烈疼痛的患者采用AMY检测对急性胰腺炎的初步判断较为有价值。但AMY升高程度与胰腺炎轻重程度不完全成比例，对于重型胰腺炎患者，由于胰腺腺泡结构破坏严重，AMY的生成量显著减少，此时AMY或尿AMY的水平反而呈现正常值水平，AMY处于正常范围决不能排除急性胰腺炎的可能[3]，约12%致死性胰腺炎患者的AMY可始终在正常范围内。因此，仅仅依靠AMY对急性胰腺炎进行诊断极易出现漏诊，造成难以挽回的后果。除此之外，在患某些胆道疾病、消化道穿孔、阻塞性胰腺疾病、胰腺肿瘤、肝炎、阑尾炎、妇科疾病时，AMY 水平也会有不同程度的增高，可见AMY不适用于作为急性胰腺炎发病的唯一指标。 血清LPS是胰腺消化酶的重要组成成分，在患有急性胆囊炎、肝炎、胆道结石、肿瘤或胰管阻塞、胰腺炎等其增高较为常见。在急性胰腺炎发病期间AMY和LPS都会增高，但出现及存在的时间有其各自的特点。AMY持续时间比LPS短，增高的程度比LPS低，特异度比LPS低。增高的LPS在血液中可持续10d左右，特异度比AMY高，所以LPS在诊断急性胰腺炎时较AMY更理想。LPS主要由胰腺腺泡合成，在健康者的血清中水平很低。发病时胰腺滤泡广泛破坏，胰管阻塞，LPS进入十二指肠受阻，使血液中的LPS浓度急剧升高。健康人群的LPS水平很低，发病后，LPS的水平会在4～8h后立刻明显升高，并于1～2d达到最高值，保持1周左右时间。对比AMY，LPS器官特异度更强，升高时间更早，且维持的时间更长，因此在急性胰腺炎的诊断中效果更佳。 综上所述,联合检测血清淀粉酶及脂肪酶可提高急性胰腺炎的诊断率,在临床中应推广应用。 【参考文献】 [1]陈斌.Ｃ反应蛋白、淀粉酶及脂肪酶联合检测在急性胰腺炎早期诊断中的作用[J].国际检验医学杂志，2015，36(3)：298-300. [2]秦学军.血清淀粉酶和脂肪酶联合测定在急性胰腺炎诊断中的意义[J].中国实用医药，2013，8(7)：44-45. [3]董秀鹏.血清淀粉酶和脂肪酶联合检测在急性胰腺炎诊断中的应用[J].国际检验医学杂志，2015，36(5)：655-656.