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分泌抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

分泌抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
分泌抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

吉林农业大学

硕士学位论文

分泌抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

姓名:龙淼

申请学位级别:硕士

专业:临床兽医学

指导教师:刘清河;张乃生

20060501

杂交瘤细胞制备

杂交瘤细胞的制备 1. 骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的细胞,浑圆透亮,大小均一,边缘清晰,排列整齐,呈半致密分布。弃上清,以不完全培养基洗涤一次后,用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞(SP2/0)轻轻吹下。 2. 脾淋巴细胞的准备 a、取加强免疫后3天的小鼠,摘除眼球采血供分离阳性血清。 b、颈脱位将小鼠致死,用75%酒精消毒体表5min,随即放入超净台内小鼠解剖板上,左侧卧位,用7号针头固定四肢。 c、无菌打开腹腔取出脾脏,用基础培养基洗涤,并仔细去掉周围附着的结缔组织。 d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏,用小针头在脾脏上插孔,并用镊子挤压,使脾细胞充分释放,制成脾细胞悬液。 3. 饲养细胞的制备 取一只健康的ICR小鼠,摘眼球采血,颈脱臼处死,体表消毒和固定后,从大腿上剪开皮肤,暴露腹膜,酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器,12#针头,注射5-10mL HAT培养基到腹腔,右手固定注射器,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部,抽回腹腔内液体,注入已准备好的容器中。 4. 细胞融合 a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中,1000rpm离心10min,上清要充分吸净,以免影响PEG的作用。 b、将融合管置于手掌中,轻轻振荡底部,务使两种细胞充分混匀。 c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中,边加边轻轻摇匀。 d、立即滴加37℃预热的DMEM,使PEG稀释而失去作用,具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基,第二分钟内加2mL,第三分钟加8mL (遵照先慢后快的原则),37℃静置10min,1000rpm离心10min,弃上清。 e、加入5mL的HAT培养基,轻轻悬浮沉淀细胞,再加入适量的腹腔巨噬细胞,最后补加HAT至50mL左右。 f、分装于96孔细胞培养板,然后将培养板置37℃,5%CO2培养箱内培养。 g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。 h、观察杂交瘤细胞的生长情况,待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时,吸取适量细胞上清进行抗体检测。

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique):一种免疫学技术,将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交,获得既能产生抗体,又能无限增殖的杂种细胞,并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性: 单克隆抗体的优点:(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说,即:高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性:(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备: 单克隆抗体的制备原理:应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程:抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原,是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合,发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种,一是诱导免疫应答的能力,也就是免疫原性,二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原,抗原的具体分类可以参见抗原,在进行单克隆抗体制备过程中,很多物质都可以成为抗原,在常规的科研实验中,科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

干货 I 细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

细胞培养之实验操作及注意事项|细胞复苏/冻存/传代 一、细胞培养前期准备工作 细胞培养仪器设备: ●细胞培养通风橱(即生物安全柜) ●培养箱(通用推荐:湿式二氧化碳培养箱) ●离心机 ●医用冰箱(4℃)和冰柜(-20℃)、生物超低温冰箱(-80℃)、液氮冷冻罐●倒置显微镜 其他用品:细胞培养容器(培养瓶、培养皿、多孔板等),吸管和移液器,培养基、血清和试剂 注意事项: ●无菌工作区域:细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区 域处于无菌状态,最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。 ●无菌试剂和培养基:商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌, 注意操作过程中不要被污染,其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法(例如:高压蒸汽、无菌过滤等)进行灭菌。 ●无菌操作:要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75% 酒精消毒;尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作,避免交叉污染;试剂瓶和培养用具使用时方可开盖,用后要第一时间盖上,暴露于环境中的时间尽可能要短。 ●整体的细胞实验环境也弥足重要,需要定期对实验室环境进行较为彻底的清

扫消毒和杀菌,包括实验用仪器和室内地面、桌面等。 二、细胞的复苏与冻存 细胞复苏: 在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下,需要进行细胞复苏:a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后,快速转移 至37℃水浴条件下轻轻转动融化(一分钟内)。 b)75%酒精擦拭冻存管外部后,转移至通风橱中。 c)加入适量新鲜的完全培养基混合,约800-1000rpm下离心5-10分钟,实 际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。 d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中,做好标记,37℃,5%CO2条 件下培养。 细胞冻存: 为现有细胞系做细胞储备,需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存: a)准备细胞冻存液,置于2℃-8℃下备用。 b)观察待冻存的细胞,密度达到80%-90%左右,将贴壁/悬浮细胞分别按照传 代方法收集。 c)使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后,计算出冻存溶液的体积,从而 保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。 d)约800-1000rpm下离心5-10分钟,无菌条件下小心弃去培养基,不要搅 动细胞沉淀。 e)用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀,分装至冻存管中,做好标记

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体(antibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),简称单抗。 与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒(Georges Ko1er)和英国科学家米尔斯坦(Cesar Milstein)两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤技术的基本原理 1975年G. Kohler和C. Mistein利用细胞融合技术,首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较,单克隆抗体更具有其特殊的优点。也正是它的特异性和高纯度的单一性而被利用于多种产业,从而获得巨大的经济效益。 抗体由B淋巴细胞产生,为了得到能产生单一抗体的淋巴细胞,并且要求这种淋巴细胞既能在一般的体外培养条件下进行正常的生长繁殖,而且还要能持久的产生这种单一抗体。G. Kohler和C. Mistein 发现存在多发性骨髓瘤疾病中的B淋巴肿瘤,由于在浆细胞中发生了成瘤转而能产生免疫球蛋白,而且这种细胞能在体外生长易被克隆。。受到这种天然肿瘤B淋巴细胞能产生抗体的启发,他们利用骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合成杂交瘤细胞制造各种单克隆抗体,使之成为一种成型的生产单克隆抗体的杂交瘤技术。 骨髓瘤细胞可以在体外生长,而且比正常细胞生长繁殖速度要快。此种细胞可以从患骨髓瘤的小鼠体内中获得,只是这种细胞不会产生抗体。用特定的抗原刺激正常小鼠脾脏B淋巴细胞,B淋巴细胞就会产生相应单一的特异性抗体,但这种B淋巴细胞却难以体外培养。杂交瘤技术就是将这两种具有功能的细胞融合在一起,在体外快速生长的杂交瘤细胞。此种杂交瘤细胞群持续分泌的成分但已有特异性的抗体。我们称为单克隆抗体。 其原理从三个方面阐明: (一)细胞的选择与融合

建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体,所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞,通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖,只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤,所以是理想的脾细胞融合伴侣。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤,使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1 000~2 000)是目前最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为40%(W/V)。 (二)选择培养基的应用 细胞融合一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中,经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5~7d,无需特别筛选;细胞的多聚体形式也容易死去;而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下,经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细

杂交瘤细胞培养及其注意事项

杂交瘤细胞培养及其注意事项 单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用,包括细胞的培养、培养基的选择,融合时期的选择,从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养,促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。 标签:杂交瘤;细胞培养;单克隆抗体 随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用,杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善,但是国内实验室设备和条件有限,多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被,结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株,融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存,仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。 1杂交瘤的起源和生产 1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤(8-azaguanine)筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的新细胞系,称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1,形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外,同时分泌X63产生的抗体,因其抗体不纯,现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1,SP2/0,FO,X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。 1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤,需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞,但融合率不高,还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢,抗体分泌力弱及效价较低,且难于克隆化等困难[2],限制了人骨髓瘤细胞的应用。 1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合,而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合(Kohler,et al. 1977;Schwaber,1977)。脾脏是大量T或B细胞的来源,与小鼠骨髓瘤细胞融合时,最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说,一个B淋巴细胞只能产生一种抗体,其”后代”也只能产生此种抗体,因为抗体是由DNA上的基因所决定,基因是可以遗传的。在正常情况下,小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞,一只纯种小鼠体内可有(1~5)×107种不同的抗体,即有(1~5)×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会,就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠,使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合,然后经过多次筛选,从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时,又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性,从而可以无限制地提供

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中,有两次筛选过程,第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基),第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法: 细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径: 一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸,为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径(“S途径”),她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。 因此,在HAT培养液中,未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径,且D途径又被氨基蝶呤阻断,所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的S途径,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法: 在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的,经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异,必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选,

4第四章 单克隆抗体与基因工程抗体制备技术

第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物,由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇,每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此,将抗原注入机体后,刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体,故称为多克隆抗体(PoAb)。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能,但不能在体外连续培养,小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖,即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下,只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力,形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合:杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体,所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞,通常选用被免疫动物的脾细胞,脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性,只有肿瘤细胞才是具备这一条件,所以选择同一体系的骨髓瘤细胞,因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤,其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶(HGPRT)的缺陷株,是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用:细胞融合的选择培养基中有三种关键成分:次黄嘌呤(H)、氨甲蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T),所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径;氨甲蝶呤(A)是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA,而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株,不能在该培养基上生长,只有融合细胞具有亲代双方遗传性能,才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择:细胞融合是一个随机的过程,需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释,进行克隆化处理,再将阳性细胞进行再次克隆化,应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖,再进行冰冻,体外培养或动物腹腔接种。

杂交瘤细胞的培养,保存和复苏

杂交瘤细胞培养冻存与复苏 杂交瘤细胞适用于无血清的培养基,无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质,以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640,F12,IMDM,DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上,最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能,你可以参考以下操作: 【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制 ①RPMI-1640基础培养液,1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸),通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3,用少量三蒸水溶解,边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml,通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压),分装,置30℃,菌检48小时4℃存放。效期不超过三个月。 ②RPMI-1640完全培养液,100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3%L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配,4℃下存放不超过一周,用于细胞融合和克隆化培养的全培养液,可将小牛血清增至20%。 ③200mmol/L(3%)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50℃使全溶,0.22μm膜滤除菌,按每管4ml分装,-20℃保存。 ④双抗溶液 青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中,小量分装,-20℃冻存。 杂交瘤细胞的保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一部分杂交瘤细胞保存,否则在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中,难免

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法 单克隆抗体制备过程中,有两次筛选过程,第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基),第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法: 细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径: 一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸,为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径(“S途径”),她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。 因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径,且D途径又被氨基蝶呤阻断,所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的S途径,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法: 在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的,经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异,必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选,选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,是每孔细胞不超过一个,通过培养让其增殖,然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体,上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞,继续进行有限

杂交瘤细胞生成抗体技术

杂交瘤细胞生成抗体技术 (一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。 1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体。 这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇(PEG)的融合效果更好,且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种,所以由它们产生的杂交瘤细胞系,只分泌一种针对预定的抗

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法:细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HA T培养液中选择性存活下来,并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此,单克隆抗体制备过程中,两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理: B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程: 1)免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性(恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。 4)阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便,RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5)克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。 (1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。 (2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化,所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2~3次的再克隆才成。应该注意的是,每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时)

教案 课程名称细胞生物学实验授课题目(章、节)实验八:杂交瘤技术的实验原理及其操作演示授课老师刘庆平授课对象2002级生物工程授课时间第十三周教学方法理论教学选用教具多媒体教学实验内容提要: 杂交瘤技术的实验原理及其操作演示(4学时) 第一节实验介绍150分钟 (一)、实验原理; (二)、实验目的; (三)、实验用品; (四)、实验方法和过程; (五)、实验结果分析; 第二节.实验多媒体示教30分钟

教学重点、难点及基本要求: 重点及难点: 杂交瘤获得成功的基本要素。 1、动物免疫 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞的融合 基本要求: 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 教研室主任意见: 单元教学小结(经验效果、问题、改进措施、信息反馈等) 本教案以讲授一个单元(2-4学时)一次实验(实习)为单位填写。填写要用钢笔。字迹要清晰、工整。按表项目逐一填写。

实验二杂交瘤技术的实验原理及其操作演示 (多媒体教学演示4学时) 杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术,被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的,一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合,即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞,如果把单个杂交瘤细胞克隆化,扩增传代,其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性,一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性,因此被广泛用于疾病的论断和治疗,生物大分子的鉴定、定位和分离纯化,以及一些细胞器,特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面, 具有极其远大的应用前景, 因此,用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要,应用范围越来越广。 实验目的 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法 2. 能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体 实验原理 杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。 一、动物免疫 动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下,可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时,相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫,以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖,从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。 二、细胞融合 B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体,但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡;而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白,却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来,我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。 脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官, 取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后,能产生五种细胞类型;未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞, 自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的,因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。

杂交瘤技术基本程序与方法

杂交瘤技术基本程序与方法 一、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体。 这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇(PEG)的融合效果更好,且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种,所以由它们产生的杂交瘤细胞系,只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子,克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系,但其基本原理和方法是一样的。 二、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上,各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序,该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前,培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备:超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min)、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml 注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管),眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul),弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。此外,杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备,依据检测单抗的方法不同而各异,请参阅本节有关部分。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、

单克隆抗体制备方法(全)

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无性繁殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备: 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min)、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管),眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul),弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。此外,一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 (一)动物的选择与免疫 1.动物的选择纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐 剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:① 将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 (二)细胞融合

杂交瘤细胞的复苏与冻存

杂交瘤细胞的复苏与冻存 一. 杂交瘤细胞的复苏 杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存,若无意外情况时,可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快,使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃,以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。 通常情况下,冻存时细胞数量多,生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法,这也是各个实验室普遍采用的程序。 不过,冻存的细胞并不都能100%复苏成功,其原因较多,如冻存时细胞数量少或生长状态不良,或复苏时培养条件改变或方法不当,也可能细胞受细菌或支原体污染,以及液氮罐保管不善等。在出现上述情况时,可采用一些补救方法复苏这些细胞,如小鼠皮下形成实体瘤法,脾内接种法,小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法,以及96孔板培养法等。 二 杂交瘤细胞的冻存 细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度(0℃- -20℃,每分钟下降1℃;-20℃--40℃每分钟下降2℃),可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面的细胞冻存方法,细胞复苏存活率均在80%以上。 1.材料: 带盖吸管筒一只(铝质或洋铁皮制),内壁(包括筒底和盖)衬1-2层石棉纸或石棉布; 含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基,冰浴降温至0℃左右(用作冻存液);灭菌安瓶或带盖小瓶;-70℃冰箱;液氮及液氮罐;处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。 方法:复苏时,从液氮中取出安瓶,立即在37℃水浴融化,待最后一点冰块快要融化时,从水浴中取出,置冰浴上。用5-10ml HT 培养基稀释,1000r/min 10分钟,弃上清,再悬浮于适量HT 培养基中,转入培养瓶或24孔板,置37℃,7.5% CO2培养。如果细胞存活力不高,死细胞太多,可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。 2、方法: (1). 将杂交瘤细胞(或其他细胞)离心,重新悬浮于预冷的冻存液中,浓度为106-107左右/ml ,分装安瓶,每瓶1ml ,置冰浴上;安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。 (2)安瓶封口后仍置冰浴上。 (3)将安瓶放入一带收口绳的小布袋内,布袋上标明冻存号、细胞名称等,立即将布袋放入吸管筒内,置-70℃冰箱。 (4)2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒,将盛有细胞的布袋移入液氮罐;在布袋的线绳上作好标记或代码;最后在液氮冻存簿上作详细记录。 (5)液氮罐应定期补充液氮(最好是专人管理);补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜

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