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黄孢原毛平革菌酵母双杂交cDNA文库的构建及应用

黄孢原毛平革菌酵母双杂交cDNA文库的构建及应用
黄孢原毛平革菌酵母双杂交cDNA文库的构建及应用

应用与环境生物学报 2006,12(5):678~682 C h in J A ppl Environ B iol=ISSN10062687X 2006210225

 

黄孢原毛平革菌酵母双杂交c DNA文库的构建及应用3胡国库 颜永红 姜权 吴波 冯红 张义正33

(四川大学生命科学学院/四川省分子生物学及生物技术重点实验室 成都 610064)

摘 要 作为研究木质素降解系统的模式微生物黄孢原毛平革菌,迄今还没有蛋白-蛋白相互作用方面的报道.本研究利用酵母双杂交技术构建了低氮培养基中培养2d和3d的酵母双杂交c DNA文库,分别得到2.5×105和3.0×105个重组子.以142323蛋白为钓饵筛选3d c DNA文库,在S D/2Ade/2H is/2Leu/2Tr p缺陷培养基平板上共获得了约600个单克隆,进一步分析发现,有30个克隆可激活3个报告基因.分离自这些克隆中的质粒DNA能转化大肠杆菌.利用HaeⅢ和Sau3AⅠ限制酶切分析可将它们分为4类.序列测定和同源分析结果表明,其中一类为142323蛋白基因,提示142323蛋白可形成二聚体,另外3类在Gen Bank没有明显同源的基因.通过S BASE网站预测,编号为Y2H333的克隆含有一个OB2f old核酸结合结构域(OB2f old nucleic acid binding domain).这些研究结果表明,所构建的黄孢原毛平革菌

c DNA酵母杂交文库是成功的,142323蛋白在黄孢原毛平革菌中能以蛋白-蛋白相互作用的形式发挥功能.图4表1

参28

关键词 黄孢原毛平革菌;酵母双杂交;c DNA文库;142323蛋白

CLC Q785

Con structi on and Appli ca ti on of Y ea st Two Hybr i d cD NA L i brar i es

of Phanerochaete ch rysosporium3

HU Guoku,Y AN Yonghong,J I A NG Quan,WU Bo,FE NG Hong&ZHANG Yizheng33 (College of L ife Sciences,S ichuan U niversity,S ichuan Key L aboratory of M olecular B iology and B iotechnology,Chengdu610064,China) Abstract There has been no report on p r otein-p r otein interacti on in Phanerochaete chrysosporium,a modelm icr oorganis m for studying lignin degradati on.I n this study,t w o yeast t w o2hybrid libraries containing2.5×105and3.0×105recombinants,were constructed using2d and3d mRNA s derived fr om P.chrysosporium cultures gr owing in l ow2nitr ogen mediu m.142323gene was used t o screen the32day library by yeast t w o2hybrid technique and more than600cl ones were obtained on the S D/2Ade/2

H is/2Leu/2Tr p p lates.Thirty positive recombinants could activate three reporter genes.Plas m ids is olated fr om yeast transfor2

mants were successfully transf or med int o Escherichia coli.The thirty cl ones could be classified int o4types on the basis of the digesti on patterns by HaeⅢand Sau3AⅠ,as well as their sequence analyses.Results showed that one type of cl ones encoded 142323p r otein,i m p lying that homodi m er could be f or med bet w een t w o molecules of142323p r otein.The other three types of cl ones encoded unknown p r oteins.However,the Y2H333contained an OB2f old nucleic acid binding domain on the basis of a2 nalysis in S BASE.These results de monstrated that the yeast t w o2hybrid c DNA libraries were qualified f or studying p r otein-p r otein interacti ons and142323p r otein may p lay i m portant r oles in P.chrysosporium.Fig4,Tab1,Ref28

Keywords Phanerochaete chrysosporium;yeast t w o2hybrid system;c DNA library;142323p r otein

CLC Q785

白腐担子真菌———黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chry2 sosporium)是研究木质素降解系统的模式微生物.木质素是自然界中含量仅次于纤维素、半纤维素的碳源,是地球生物圈中最为丰富的可再生生物资源之一[1].目前用于木质素生物降解研究的白腐菌有10余种,它们主要属于平革菌属(Phanero2 chaete)、栓菌属(T ram etes)、烟管菌属(B j erkandera)、侧耳属(Pleurotus)、香菇属(L entinula)等[2].P.chrysosporium是研究最为广泛的白腐担子真菌,不仅因为它可以降解木质素,而且

收稿日期:2006201218 接受日期:2006204207

3国家自然科学基金资助项目(No.30470984)和教育部博士点基金(No.20040610013) Supported by the Nati onal Natural Science Foun2 dati on of China and the Specialized Research Fund for the Doct oral Pr o2 gra m of H igher Educati on

33通讯作者 Corres ponding author(E2mail:yizzhang@https://www.wendangku.net/doc/00679593.html,)还可以降解自然界中的爆炸物、农药等有毒物质[3,4],因此对黄孢原毛平革菌的深入研究,对解决全球的能源和环境问题都具有重要的意义.20世纪60年代以来,人们对此菌的木质素降解生理、生化、降解机理分子生物学等方面进行了深入的研究[5,6].研究表明,黄孢原毛平革菌在次生代谢期间产生的两类木质素降解酶类———木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶受c AM P、M n2+、氮源等因素在转录水平上的调控[7,8].

蛋白质2蛋白质相互作用在很多生物过程中都起到重要的作用,包括细胞内生物大分子结构的形成、酶复合物的形成以及信号转导途径的调控等[9].因此,黄孢原毛平革菌在次生代谢转换期也存在着各种DNA-蛋白质、蛋白质2蛋白质相互作用为基础的功能网络调控关系.很显然,弄清楚这种功能网络调控关系,对于在更深的层次上认识该菌的木质素降解机理是

十分有帮助的.本研究中,我们成功构建了黄孢原毛平革菌在低氮培养基中培养2d和3d的酵母双杂交cDNA文库,为借助酵母双杂交等技术手段揭示木质素降解机理奠定了实验材料与技术基础.

142323蛋白是一个存在于所有真核生物中高度保守的蛋白调控家族[10,11].它的主要作用是通过与其它蛋白质相互作用,参与几乎所有的生物过程,如细胞信号的转导、细胞周期的调控、细胞的凋亡、恶性肿瘤的形成等[12].在酿酒酵母中的大规模研究表明,酵母中至少有16种蛋白与142323蛋白(B MH1或BMH2)相互作用,但是这些结果还没有得到证实[13,14].最近的研究发现,酵母中的142323还可以与十字型DNA结合[15].我们已利用酵母单杂交方法克隆到黄孢原毛平革菌的142323基因的C DS序列(Gen Bank注册号:AY971673,相应结果将另文发表),本文报道黄孢原毛平革菌在低氮培养基中生长2d和3d培养物的酵母双杂交c DNA文库构建和以142323蛋白为钓饵对3d c DNA文库的筛选结果.

1 材料与方法

1.1 真菌P.chrysosporium菌种和培养

1.1.1 菌种 真菌菌种P.chrysosporium Burds BK M2F1767是一个研究木质素降解的常用模式菌株[5],为本实验室保存.大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,其基因型为sup E44 (lac U169(φ80lac ZΔM15)hsd R17rec A1end A1gyr A96thi21 rel A1),本室保存;酿酒酵母(Saccharo m yces cerevisiae)AH109 (BD公司),其基因型为MA Ta,trp12901,leu223,112,ura32 52,his32200,gal4Δ,gal80Δ,L YS2::G AL1UAS2G AL1TA TA2 H IS3,G AL2UAS2G AL2TA TA2AD E2,URA3::M EL1UAS2 M EL1TA TA2lacZ,M EL1和酿酒酵母(S.cerevisiae)Y187(BD 公司),其基因型为MA Tα,ura3252,his32200,ade22101,trp12 901,leu223,112,gal4Δ,m et?,gal80Δ,URA3::G AL1UAS2

G AL1TA TA2lacZ,M EL1用于酵母双杂交实验.

1.1.2 P.chryosoporium的培养 将该菌的分生孢子接种到C M培养基平板上,37℃培养4~5d后收集孢子,将其浓度调节到A

600n m

≈1.5,接种3mL孢子悬液到盛有30mL低氮培养液的500mL三角瓶中,充氧后39℃静置培养,分别在d2和d3过滤收集菌体,用于提取菌体总RNA,并纯化mRNA.

C M培养基和低氮培养液按冯红所述的方法配制[16].

1.2 载体

pG ADT72Rec和pH I S2均来自BD M atch maker T M L ibrary Constructi on&Screening Kit(BD公司).

1.3 RNA的制备和c DNA的合成

采用Trizol试剂(I nvitr ogen公司)提取菌体总RNA.采用O ligotex mRNA Kit(Q I A GE N公司)从菌体总RNA中纯化Poly A+mRNA.采用BD M atch maker T M L ibrary Constructi on& Screening Kit(BD公司)合成第1和第2条c DNA链.用BD CHROMA SP I N T M TE2400Colu mn(BD公司)纯化c DNA.以上操作均按相应试剂盒说明书进行.

1.4 酵母双杂交c DNA文库的构建

用BD Match maker T M L ibrary Constructi on&Screening Kit (BD公司)进行c DNA文库的构建.主要步骤包括用L i A c方法制备酵母AH109菌株的感受态细胞.将合成的ds2cDNA、线性化的pG ADT72Rec载体、变性的Herring Testes Carrier DNA与酵母感受态细胞混合,并加入PEG/L i A c,混匀,30℃放置45 m in,每15m in混合细胞一次;再加入160μL DM S O,42℃水浴中放置20m in,每10m in混合一次;700g离心5m in,用3 mL YP D PlusM ediu m(来自试剂盒)悬浮细胞,30℃振荡培养90m in,700g离心5m in,用0.9%的NaCl悬浮细胞,将细胞涂布于S D/2Leu平板,30℃培养3~6d.收集转化子,将细胞悬浮于含25%甘油的YP D培养基中,调整其浓度至≥2×107细胞/mL,分装1mL/管,保存于-80℃.

1.5 钓饵载体的构建

采用定向克隆的方法将钓饵蛋白142323的ORF克隆到BD载体pG BKT7上,上下游引物分别为5′2GCCG AATTC ATG2 GCCC AGT CGCGTG AAG A23′(黑体为Eco RⅠ限制酶识别位点)和5′2GT CGG ATCCAG ACT CGTTGTCGGCCTC AT23′(黑体为B am HⅠ限制酶识别位点).将重组质粒按上述方法转化酵母Y187,涂布在S D/2Tr p平板上,选择酵母转化子,同时在S D/2 H is/2Tr p和S D/2Ade/Tr p平板上分别作自激活试验和对酵母细胞的毒性试验.最后将酵母转化子浓度调整为≥2×109/ mL.

1.6 酵母双杂交克隆筛选与鉴定

将1mL酵母双杂交c DNA文库AH109细胞于室温水浴中解冻,与5mL钓饵酵母Y187细胞混合于2L的三角瓶中,加入45mL2×YP DA/Kan(50μg/mL),混匀.30℃缓慢振荡培养20~24h(30~50r/m in).将培养物转至100mL离心管中,1000g离心10m in.用50mL0.5×YP DA/Kan(50μg/ mL)洗细胞2次,合并2次的洗液重新悬浮细胞,1000g离心10m in.再用10mL0.5×YP DA/Kan(50μg/mL),涂S D/2 Ade/2H is/2Leu/2Tr p培养基平板,30℃培养3~8d,计算接合(mating)效率.将4缺平板(S D/2Ade/2H is/2Leu/2Tr p)上长出的阳性菌落再划到另一个4缺平板上培养以去除细胞中可能存在的多余的质粒,β2半乳糖苷酶活性分析(验证第3个报告基因).

可激活3个报告基因的酵母转化子用蜗牛酶破壁提取酵母质粒,转化大肠杆菌,用于回收质粒并测序.

将纯化的候选阳性克隆的文库质粒与钓饵质粒共转化酵母AH109,进一步验证阳性菌落并进行β2半乳糖苷酶活性分析,再将阳性菌落划到4缺平板上与正负对照进行对比.

2 结果

2.1 poly A+mRNA提取及质量检测

poly A+mRNA的质量将直接影响到合成c DNA的质量.紫外分光光度计测定结果显示,来自于低氮培养基的黄孢原毛平革菌2d和3d poly A+mRNA A

260n m

/A280n m分别为1.9和2.1,浓度分别为0.48μg/μL和0.324μg/μL.图1为2d和3d poly A+mRNA经甲醛变性胶琼脂糖电泳结果.从图中可见, poly A+mRNA的范围在500~3000nt之间.以上2项结果表明,制备的2种黄孢原毛平革菌的poly A+mRNA可用于c DNA 的合成.

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 5期胡国库等:黄孢原毛平革菌酵母双杂交c DNA文库的构建及应用

图1 甲酰胺变性凝胶电泳检测黄孢原毛平革菌poly A +mRNA

Fig .1 Electr ophoresis analysis of poly A +mRNA fr om P .chryosoporium

by a denaturing for maldehyde agar ose /E B gel M:1kb DNA Ladder .1道和2道分别为22day 和32day poly A +mRNA

 Lanes 1and 2,22day and 32day poly A +mRNA,res pectively

2.2 合成c DNA 的质量检测

合成c DNA 的长度是保证所构建的c DNA 文库质量的关键因素之一.分别取2.025μL 的2d mRNA 和3.0μL 的3d mRNA 逆转录合成第1链c DNA,PCR 合成双链cDNA,通过柱纯化除去小片段(<200bp ),c DNA 样品通过1%琼脂糖凝胶电泳检测(图2).从图中可见,合成的c DNA 分子的长度分布范围在0.5~3kb 之间,说明合成的c DNA 的长度符合文库构建要求

.

图2 电泳检测双链c DNA

Fig .2 Analysis of ds 2c DNA synthesized fr om 22day and

32day poly A +mRNA of P .chryosoporium

M:1kb DNA Ladder .1道和2道分别为22day 和32day c DNA Lanes 1and 2,22day and 32day ds 2c DNA,res pectively

2.3 酵母双杂交c DNA 文库质量评估

取20μL 纯化的c DNA 与6μL pG ADT72Rec2载体转化酵母AH109,通过体内重组构建c DNA 文库.用2d 和3d c DNA

构建的文库分别有2.5×105和3.0×105个重组子.从文库中

随机挑取20个菌落进行菌落PCR,结果表明,其重组到

pG ADT72Rec 载体上的c DNA 片段在0.5~2kb 之间,说明文

库中c DNA 的大小适合做双杂交筛选.根据Clarke 2Carbon 公式,按特定条件下该菌含有30000种不同的mRNA 分子(根据文献[3]在黄孢原毛平革菌基因组上预测到11777个基因),每种mRNA 分子平均长度为1500nt 计算,本研究中构建的

c DNA 文库涵盖了黄孢原毛平革菌99%以上的cDNA.

2.4 142323蛋白钓饵筛选3d c DNA 文库

c DNA 文库转化子与142323钓饵转化子进行接合实验,接

合效率为2.15%,符合酵母双杂交c DNA 文库筛选的要求.在4缺(S D /2Ade /2H is/2Leu /2Tr p,含60mmol/L 32AT )平板上得到600个单菌落,β2半乳糖苷酶活性分析发现,有30个克隆可激活3个报告基因,纯化的质粒可成功转化大肠杆菌.PCR 扩增这些插入片段并对PCR 产物进行Hae Ⅲ和Sau 3A Ⅰ限制酶切分析,结果表明,它们可被分为4类,每一类中随机选取克隆进行测序.第1类有16个克隆,均为142323基因(Y2H67为代表);第2和第3类分别有6个(Y2H30)和4个(Y2H389)克隆,它们都是含有WD 结构域的新基因(结果将另文发表);第4类有4个克隆(Y2H333).上述4类c DNA 序列均可定位在黄孢原毛平革菌基因组上.其中Y2H333可被定位于scaff old_15上,命名为fgenesh1_pg .C,其ORF 为1131bp,编码376个氨基酸残基.所得序列与Gen Bank 中的已知蛋白质序列进行同源性比较,发现其氨基酸序列与环形泰勒虫(Theileria annulata )的半胱氨酸蛋白酶有38%的同源性,与假单孢菌(Pseudo m onas syringae )的Ⅲ型效应因子Hop I 1有30%的同源性.在S BASE

网站预测其含有一个OB 2f old 核酸结合结构域(OB 2f old nucleic

086 应用与环境生物学报 C h in J A ppl Environ B iol 12卷

acid binding domain).将从大肠杆菌中回收的Y2H333质粒与钓饵质粒重新共转化酵母AH109,为减少假阳性,重新转化酵母AH109并与正负对照(质粒的组合方式见表1)划在同一个4缺平板(图3),表明Y2H333可激活2个报告基因的表达,β2半乳糖苷酶活性分析表明其同样可以激活β2半乳糖苷酶活性(图4).

表1 重新转化酵母AH109的质粒组合

Table1 AH109transf or mants with t w o p las m ids #BD2fusi on AD2fusi on Result 1pG BKT72Lam pG ADT72RecT AD-

2pG BKT7pG ADT72Rec2Y2H333-

3pG BKT7214.3.3pG ADT72Rec-

4pG BKT7214.3.3pG ADT72Rec2Y2H333+

5pG BKT7253DNA2BD pG ADT72RecT AD+

3 讨论

黄孢原毛平革菌基因组全序列的测定已由美国能源部(DoE)和联合基因组研究所(JGI)于2003年完成[3].然而基因组编码和储存的重要遗传信息是通过蛋白质的表达来实现的,因此,大规模地研究基因的功能已成为生命科学研究领域的核心内容.细胞或组织中的蛋白质不是杂乱无章的混合物,而是严格有序的,蛋白质间的相互作用、相互协调是维持这种有序性及细胞正常生命活动的基础.研究蛋白质间的相互作用有多种方法,常用的有酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等.其中,Fields和Song于1989年创立的酵母双杂交系统(yeast t w o2hybrid syste m)[17]是当前发展迅速、应用广泛的主要方法.该方法不但可用来在体内检验蛋白质间的相互作用,而且还能用来发现新的作用蛋白质,在对蛋白质组中特定的代谢途径中蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用.

T7噬菌体是第一个被用于大规模杂交分析的噬菌体,在发现的25个相互作用中,只有4个已经报道.该研究表明,系统鉴定基因组编码特定蛋白质间众多的相互作用是可能的[18].Flaj olet(2000)等人用双杂交方法构建“钓饵”和“猎物”随机的丙型肝炎病毒(HCV)基因组文库,用随机筛选的200个钓饵和猎物文库双杂交分析,得到5个相互作用结果,通过调节这些相互作用可能开发出特异的抗病毒试剂[19].酿酒酵母(S.cererisiae)基因组已于1996年测序完成,用酵母双杂交技术分析了其6000多个开放阅读框间的相互作用,分别用阵列筛选法和文库筛选法得到281个和692个相互作用蛋白质[20].It o(2001)等人将克隆的酵母阅读框分为不同的集合(pools),用集合筛选法得到1533个相互作用的蛋白质中有841个是可靠的.在线虫(Caenorhabditis elegans)中发现有148个蛋白与27个生殖器发育有关的蛋白结合,这些结果为进一步研究线虫的生殖器发育的分子机制提供了线索[21].

目前还没有黄孢原毛平革菌蛋白质相互作用的报道,其基因组计划的完成为大规模研究其蛋白-蛋白相互作用提供了方便.本文首次成功构建了黄孢原毛平革菌代谢转换期2d和3d的酵母杂交cDNA文库,这对促进运用酵母杂交实验技术平台,为深入研究黄孢原毛平革菌代谢转换期基因表达调控及信号转导途径奠定了实验材料和技术基础.

黄孢原毛平革菌产生2种依赖于H

2

O2的过氧化物酶———木质素过氧化物酶(L iP)和锰过氧化物酶(MnP),它们是木质素降解的主要酶类.20世纪80年代以来,已经有不同的实验室克隆到编码L iP同工酶的基因(lip)[22~24]和M nP同工酶基因(m np).目前已经在锰过氧化物酶的启动子区域发现了几个可能的顺式元件,如CCAAT盒、金属应答元件(MREs)、热激元件和激活蛋白结合位点2(AP22)等[5,25,26].本室于1999年利用凝胶迁移率变动分析实验[16]和DNA足迹分析技术在li pC5′2端克隆到2个顺式调控元件———P BE1和P BE2.Gold 等于2004年发现1个M n2+应答的顺式调控元件[27].在人类和植物中的研究发现,142323蛋白参与细胞的信号转导和基因表达调控,在酵母中142323蛋白可以与蛋白和DNA结合,但黄孢原毛平革菌142323蛋白的功能还不清楚.本研究以142323蛋白为钓饵筛选3d c DNA文库,获得4个可能与142323相互作用的蛋白,其中Y2H333经S BASE网站预测,含有OB2f old 核酸结合结构域.此结构可与核酸结合,并包含反密码子结合结构域[28],因此142323蛋白在黄孢原毛平革菌中可能参与蛋白质的翻译过程.这些结果为进一步研究142323在黄孢原毛平革菌中的作用奠定了基础.总之,对这些相互作用进一步的鉴定、分析将为我们了解黄孢原毛平革菌调控机理及信号转导途径提供有益的线索.

References

1 Erikss on KEL.Concluding remarks,where do we stand and where are we going?L ignin bi odegradati on and p ractical utilizati on.J B iotechol, 1993,30:149~158

2 Varela E,Mart nez AT,Mart nezMJ.Southern bl ot screening f or lignin per oxidase and aryl2alcohol oxidase genes in30fungal s pecies.J B io2 technol,2000,83:245~251

3 Martinez D,Larr ondo LF,Putna m N,Gel pke MD,Huang K,Chapman J,Helfenbein KG.Genome sequence of the lignocellul ose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78.N at B iotechnol,2004, 22(6):695~700

4 Sp iker JK,Cra wford DL,Crawf ord RL.I nfluence of2,4,62trinitr ot olu2 ene(T NT)concentrati on on the degradati on of T NT in exp l osive2con2 ta m inated s oils by the white2r ot fungus Phanerochaete chrysosporium.A p2 pl Environ M icrobiol,1992,58(9):3199~3202

5 Gold MH,A lic M.Molecular bi ol ogy of the lignin degrading basidi omy2 cete Phanerochaete chrysosporium.Rev M icrobiol,1993,57:605~622 6 Kirk TK,RL Farrel.Enzy matic"combusti on":the m icr obial degrada2 ti on of lignin.A nn Rev M icrobiol,1987,41:465~505

7 Boom inathan K,Reddy CR.cAMP2mediated differential regulati on of lignin per oxidase and manganese2dependent per oxidase p r oducti on in the white2r ot basidi omycete Phanerochaete chrysosporium.Proc N atl A cad Sci USA,1992,89:5586~5590

8 B r own JA,A lic M,Gold MH.Manganese per oxidase gene transcri p ti on in Phanerochaete chrysosporium:activati on by manganese.J B acteriol, 1991,173:4101~4106

9 Lane DP,Cra wford LV.T antigen is bound t o a host p r otein in S V402 transf or med cells.N ature,1979,278:261~263

10 RosenquistM,L sterfj ord MA,Larss on C,Sommarin M.Data m ining the A rabidopsis genome reveals fifteen142323genes:exp ressi on is dem2 onstrated f or t w o out of five novel genes.Plant Physiol,2001,127:

186

 5期胡国库等:黄孢原毛平革菌酵母双杂交c DNA文库的构建及应用

142~149

11 Ada m RD.The Giardia lam blia genome.Int J Parasitol,2000,30: 475~484

12 B ridgesD,Moorhead G BG.142323p r oteins:A number of functi ons f or

a numbered p r otein.Sci STKE,2005(296):1~10

13 Gavin AC,Bosche M,Krause R,Grandi P,Marzi och M,Bauer A, Schultz J,R ick J M,M ichon AM,Cruciat C M,Remor M,Hofert C, SchelderM,B rajenovic M,Ruffner H,Merino A,Klein K,Hudak M,D icks on D,Rudi T,Gnau V,Bauch A,Bastuck S,Huhse B, Leut w ein C,Heurtier MA,Cop ley RR,Edel m ann A,Querfurth E, Rybin V,D re wes G,Raida M,Bouwmeester T,Bork P,Seraphin B, Kuster B,Neubauer G,Superti-Furga G.Functi onal organizati on of the yeast p r oteome by syste matic analysis of p r otein comp lexes.N ature, 2002,415:141~147

14 Tong AH,Lesage G,Bader G D,HD ing,Xu H,Xin X,Young J, Berriz GF,B r ost RL,ChangM,Chen Y,Cheng X,Chua G,Friesen H,Goldberg DS,Haynes J,Humphries C,He G,Hussein S,Ke L, Kr ogan N,L i Z,Levins on JN,Lu H,Menard P,Munyana C,Pars ons AB,Ryan O,Tonikian R,Roberts T,Sdicu AM,Shap ir o J,Sheikh B,Suter B,Wong S L,Zhang LV,Zhu H,Burd CG,Munr o S,San2 der C,R ine J,Greenblatt J,PeterM,B retscher A,Bell G,Roth FP,

B r own G W,Andrews B,Bussey H,Boone C.Gl obal mapp ing of the

yeast genetic interacti on net w ork.Science,2004,303:808~813

15 Callej o M,A lvarez D,Price G B,Zannis2Hadj opoul os M.The142323 p r otein homol ogues fr om Saccharo m yces cerevisiae,Bmh1p and Bmh2p, have crucifor m DNA2binding activity and ass ociate in vivo with ARS307.J B iol Che m,2002,277(41):38416~38423

16 Feng H(冯红),Zhang YZ(张义正).Analysis of5′up strea m regu2 lat ory sequences of lignin per oxidase(L I P)genes of Phanerochaete chrysosporium.Acta B iochi m et B iophys S in(生物化学与生物物理学报),1999,31:669~674

17 Fields S,SongO.A novel genetic syste m t o detect p r otein-p r otein in2 teracti ons.N ature,1989,340:245~246

18 Bartel P L,Roecklein JA,SenGup ta D,Fields S.A p r otein linkage map of Escherichia coli bacteri ophage T7.N ature Genetics,1996,12: 72~76

19 Flaj oletM,Rot ondo G,Daviet L,Berga metti F,I nchaus pe G,Ti ollais

P,Transy C,Legrain P.A genom ic app r oach of the hepatitis C virus generates a p r otein interacti on map.Gene,2000,242:369~379

20 Uetz P,Gi ot L,Cagney G,Mansfield T A,Juds on R S,Knight JR, Lockshon D,Narayan V,Srinivasan M,Pochart P,Qureshi2Em ili A, L i Y,Godwin B,Conoer D,Kalbfleisch T,V ijaya modar G,YangM, Johnst on M,Fields S,Rothberg J M.A Comp rehensive analysis of p r o2 tein-p r otein interacti ons in Saccharo m yces cererisiae.N ature,2000, 403:623~627

21 W alhout AJ,Sordella R,Lu X,Hartley JL,Te mp le GF,B rasch MA, Thierry-M ieg N,V idalM.Pr otein interacti on mapp ing in C.elegans using p r oteins involved in vulval devel opment.Science,2000,287: 116~122

22 Zhang YZ,Zylstra GJ,O lsen RH,Reddy CA.I dentificati on of c DNA cl ones for ligninase fr om Phanerochaete chrysosporium using synthetic oligonucleotide p r obes.B ioche m B iophys Res Co mm un,1986,137: 649~656

23 Zhang YZ,Reddy CA,Ras ooly AJ.Cl oning of several lignin per oxi2 dase(L I P)2encoding genes:sequence analysis of the L I P6gene fr om the white2r ot basidi omycete,Phanerochaete chrysosporium.Gene, 1991,97:191~198

24 Naidu PS,Zhang YZ,Reddy CA.Characterizati on of a ne w lignin per2 oxidase gene(G LG6)fr om Phanerochaete chrysosporium.B ioche m B io2 phys R es Co mm un,1991,173:994~1000

25 Godfrey BJ,Mayfield MB,B r own JA,Gold MH.Characterizati on of a gene encoding a manganese per oxidase fr om Phanerochaete chrysospori2 um.Gene,1990,93:119~124

26 Gold MH,Youngs HL,Solle win Gel pke MD.Manganese per oxidase.

I n:SigelA,Sigel H eds.Manganese and Its Role in B i ol ogical Pr oces2

ses.Ne w York:Marcel Dekker,2000,37:559~586

27 Ma B,Mayfield MB,Godfrey BJ,Gold MH.Novel p r omoter sequence required for manganese regulati on of manganese per oxidase is ozy me1 gene exp ressi on in Phanerochaete chrysosporium.Eukaryot Cell,2004, 3:579~588

28 Koonin EV,Wolf YI,A ravind L.Pr otein f old recogniti on using se2 quence p r ofiles and its app licati on in structural genom ics.A dv Protein Che m,2000,54:245~275

286 应用与环境生物学报 C h in J A ppl Environ B iol 12卷

白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素

饲料研究FEED RESEARCH NO .5,2011 15 综述 白腐真菌对秸秆的降解效果及影响因素 张爱武1 董 斌2 康 伟11.吉林农业大学中药材学院2.沈阳鑫育隆饲料有限公司 收稿日期:2010 - 12 - 21 基金项目:吉林省长春市科技计划项目(09YJ21)通信作者:张爱武 农作物秸秆是世界上数量最多的农业生产副产品之一。据联合国环境规划署报道,世界上种植的农作物每年可提供各类秸秆约20亿t。我国是农业大国,也是秸秆资源最丰富的国家之一,主要的秸秆约20种,而且数量巨大。目前秸秆的利用仍以原始利用为主,且利用方式单一,其中玉米秸秆分布广且数量多,利用潜力最大。由于目前用作饲料的数量还不到秸秆总量的10 %,秸秆还田和副业加工利用等不到5 %,大部分被浪费掉。麦秸和稻草等用作饲料的就更少。农作物秸秆由于营养品质低下,适口性差等原因,在饲料方面的利用率很低。饲喂反刍动物时,需对秸秆进行预处理,以提高其营养价值和适口性。基于我国国情,虽然物理和化学处理方法对秸秆品质均有较大改善,但是由于实际生产中成本、操作和环境污染等方面原因,推广使用范围较小。一系列的实验室研究和饲养试验表明:利用微生物降解方法处理秸秆具有广阔的前景。 利用微生物可转化秸秆,因为微生物能利用和分解多种畜禽不能利用的复杂有机化合物,合成含有丰富蛋白质和脂肪的菌体细胞,这些分解产物和菌体可用于饲料。微生物在秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短和可再生等优点,越来越受到国内外研究者重视。国内研究使用较多的是以乳酸菌-纤维分解菌-丙酸菌为主的微生物活菌制剂。自70年代以来,国外许多学者和研究人员致力于白腐真菌的研究。白腐真菌是一类丝状真菌,因腐生在树木或木材上,引起木质白色腐烂而得此名。它依靠降解木质纤维材料的能力穿入木质,侵入木 质细胞腔内,释放降解木质素和其他木质组分的酶,导致木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐。分类学上,白腐真菌属于真菌门,绝大多数为担子菌纲,少数为子囊菌纲。白腐真菌分布十分广泛,无论高山或平原,凡是有树木生长、存放或使用木材的地方都有分布。各地区白腐真菌种类的变化常随树木种类与气候诸多条件而改变。 1 白腐真菌降解秸秆的效果 早在20世纪70年代,国外就比较重视对白腐真菌的研究。我国近来利用白腐真菌降解秸秆的研究已有所进展。白腐真菌通过次生代谢物包括,各种胞外酶、过氧化物酶、二价锰过氧化物酶及漆酶的催化作用有效降解木质素。王连稹报道,白腐菌处理秸秆主要是由于其在生长活动过程中能分泌多种酶,这些降解酶主要是木质素降解酶,其次是纤维素降解酶及半纤维素降解酶,以降解细胞壁物质中的木质素、纤维素及半纤维素。已知的白腐真菌包括,栓菌属、平革菌属、侧耳菌属、半胶菌属和黑管菌属等;常见的包括,长绒毛栓菌、云芝、黄孢原毛平革菌、糙皮侧耳菌、紫半胶菌、黑管菌和裂褶菌等,国际上很多研究者发现,有降解能力的是黄孢原毛平革菌,属非褶菌目、伏革科和显革菌属。Zadrazil 等(1984) 对包括桦多孔菌、漏斗状侧耳、云芝深褐色次革菌、辐射卧孔菌、粉状侧孢霉和拟革盖菌等200个品系进行筛选后发现,有几十种白腐真菌能显著改善秸秆的适口性,提高木质素的降解率,大幅度提高秸秆的瘤胃干物质消化率,从而使秸秆成为反刍动物的一种含较高营养价值的廉价能量饲料。 有关香菇菌的研究报道,香菇和平菇等木腐类真菌分解木质素和纤维素的能力较强,这类食用菌

CLONTECH酵母双杂中文版

目录 (一)介绍 4 (二)试剂盒物品清单 7 (三)额外附加物品列表9 (四)酵母菌株11 (五)酵母载体14 (六)方法简述:单杂交文库的构建和筛选16 方法简述:双杂交文库的构建和筛选17 (七)构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 (八)构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 (九)构建生成cDNA文库21 (十)构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库(简述)27 (十一)酵母单杂交文库的构建和筛选28 (十二)酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对(Yeast Mating)来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 (十三)分析阳性相互作用结果38 (十四)问题解决指南44 (十五)参考文献47 (十六)相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C:单杂交对照载体信息53 附录D:双杂对照载体信息54 表格列表 Table I. BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II. BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III.单杂交系统的载体14 Table IV.双杂交系统的载体15 Table V.各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI. RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII.单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII.单杂共转化对照实验:期望的结果29 Table IX.双杂交转化的对照实验的设置33 Table X.双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI.双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII.双杂交共转化的对照实验:期望的结果 Table XIII.用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs

白腐菌液体菌种培养条件的试验研究_吴薇

No.1.2008 收稿日期:2007-07-20*通讯作者 基金项目:中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项。 作者简介:吴薇(1970—),女,浙江人,博士研究生,副教授,研究方向为农产品加工与贮藏工程和生物质材料工程。 吴 薇1,顿宝庆2,姜训鹏1,吕程序1,高振江1*,路明2* (1.中国农业大学工学院,北京100083;2.中国农科院生物质能源研究中心,北京100081) 摘要:对3种白腐菌的液体菌种培养条件进行了优化研究。结果表明,黄孢原毛平革菌液体菌种培养的较优条件为培养时间4d、初始pH6.0、装量50mL、琼脂添加量0.2%,W3液体菌种培养的较优条件为培养时间5d、初始pH6.5、装量50mL、琼脂添加量0.3%,变色栓菌液体菌种培养的较优条件为培养时间5d、初始pH6.5、装量75mL、琼脂添加量0.1%。关键词:白腐菌;液体菌种;培养条件中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)01-0016-03 白腐菌液体菌种培养条件的 试验研究 Studyoncultureconditionsonliquidstrainofthewhite-rotfungi WUWei1,DUNBao-qing2,JIANGXun-peng1,LVCheng-xu1,GAOZhen-jiang1*,LUMing2* (1.CollegeofEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083;2.ResearchCenterof EnergySources,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081) Abstract: Inthispaper, cultureconditionsonliquidstrainofthethreewhite-rotfungiwerestudiedforthe optimization.Theefficiencyofstudyandapplicationinwhite-rotfungiintherelevantfieldscanbeimprovedinalargeextant. TheresultsshowedthattheoptimumcultureconditiononliquidstrainofPhanerochaete chrysosporiumwas4dayscultureperiod,theinitialpH6.0,liquidcapacity50mL,agarrecruitment0.2%.The 提高海藻糖的百分含量。 将海藻糖和三氯乙酸混合液用3倍体积的95%乙醇在4℃冰箱中醇析12h后,在5000r/min下离心20min得到沉淀物。将此沉淀物冷冻干燥12h后,可得海藻糖晶体。 参考文献: [1]ElbeinAD.Metabolismofα,α-trehalose[J].AdvCarbo-hydChemBiochem,1974,30:227-256 [2]戴秀玉,程苹.海藻糖的生理功能、分子生物学研究及应用前景[J].微生物学通报,1995,22(2):102 [3]程池.天然生物保存物质———海藻糖的特性和应用[J].食品与发酵工业,1996,22(1):59-64 [4] 刘洋,张红缨,张今.酵母菌中海藻糖的提取方法与糖代谢研究[J].吉林大学自然科学学报,1998,(4):85-88 [5]章银良,毛多斌,张勋.产海藻糖酿酒酵母培养基优化及生理学研究.生物技术,2001,11(6):27-29 [6] 章银良,熊卫东,张露,等.胁迫条件下酿酒酵母积累海藻糖的发酵研究[J].郑州轻工学院学报(自然科学版),2003, 18(2):50-52[7]JohanMT.MicrobiolReview[J].1984,48(1):42-59[8] JoaoAJ,MariaDL,PolizeliTMetal.FEMSMicrobiolo-gyLetter,1997,154:165-171 [9]CarmenLAP,AnitaDP.BiotechnologyAnnualReview, 1996,(2):293-314 [10]KokiS,ToshiyaK,EiichiTetal.AppliedandEnviron- mentalMicrobiology,1998,64(11):4340-4345 [11]SJStasinopoulos,RJSeviour.Stimulationofexpolysac- charideproductionintheFungusAcremoniunpersiciumwithfattyacids[J].BiotechandBioengi,1990,36:778-782 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 食品开发与机械 16

酵母双杂交技术

酵母双杂交系统 1.原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如,酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是,单独的DNA结合域不 能激活基因转录,单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因,它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2.试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为: 2.1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合,构建 成诱饵质粒。 2.2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合,构建成文库质粒。2.3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2.4、酵母细胞中,已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用,但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用,则可激活报告基因的转录;反之,则不能。利用4种报告基因的表达,便可捕捉到新的蛋白质。 3.特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法,但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用,这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白,都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性,即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清,可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用,从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提,构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理,才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备, 并能对实验结果作出预测与分析,尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别

黄孢原毛平革菌培养实验要点

黄孢原毛平革菌的培养实验 关键词:显微镜三角瓶 ATCC 北京标准物质网 一、黄孢原毛平革菌 试验所用菌种黄孢原毛平革菌BKM-F-1767,密封,置于冰箱中。 二、黄孢原毛平革菌的培养基 1.黄孢原毛平革菌培养基的组成 基本培养基:2.Og 马铃薯浸出液,20g 葡萄糖,3g KH 2PO 4 ,1.5g MgSO 4 ·7H 2 O, 0.1mg FeSO 4·7H 2 O,0.2mg CuSO 4 ·5H 2 O,8mg 维生素B1,用蒸馏水定容到1000mL。 斜面孢子培养基:采用改良PDA培养基(L-1):200g 马铃薯浸出液,20g 葡 萄糖,20g 琼脂,3g KH 2PO 4 ,1.5g MgSO 4 ·7H 2 O,0.1mgFeSO 4 ·7H 2 O,0.2mg CuSO 4·5H 2 O,8mg 维生素B1。 2.培养基的消毒灭菌 为了对微生物进行纯培养,防止杂菌污染,必须对微生物生长的培养基进行消毒灭菌。培养基的消毒灭菌步骤如下:将装有液体培养液的锥形瓶塞上棉塞,罩上牛皮纸,用线扎紧。首先在高压灭菌锅内放水,使水面超过加热电阻丝两指左右,放置好锅内桶,在锅内放入待灭菌的培养基和需消毒的物品,盖好锅盖,拧紧螺钉,打开放气阀。然后接上电源,待水烧开3min后(将锅内冷空气赶出后),关闭放气阀,待压力升高。当温度指到121℃,压力为0.1 5MPa时,使温度压力恒定。从这时计时25min,关掉电源,等锅内温度冷却下降至0℃刻度,打开放汽阀放气,打开锅盖.再取出培养基及消毒物品。至此,消毒灭菌完毕。 所谓“白腐真菌”,并非生物学上的概念。 第一,它不属于生物系统分类学范畴的术语,而是从功能角度上对生物进行描述和界定。 第二,它既不专指某一种真菌,也不泛指某一些真菌,而是限定为一类腐生在木质上有相同的进攻能力并造成木质发生相同的结构及外观变化——白腐的丝状真菌的总称。

白腐真菌在环境保护中研究与应用进展

摘要综述了近年来白腐真菌在环境保护中的研究进展,主要包括在多种工业废水处理、垃圾堆肥及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的应用。关键词 白腐真菌 环境保护 应用 中图分类号 X703.1TQ085+.413 白腐真菌在环境保护中研究与应用进展 吴林林 阮宇鹰 武琳慧黄民生 华东师范大学环境科学系(上海 200062) 环境保护 0前言 环境中难降解有机污染物日积月累并持久存在 的结果已严重危害生态系统的健康和人类社会的可持续发展。这些污染物产生于各种工农业生产及人类生活活动中,除难以降解外它们还具有较高的生物毒性和致癌、致畸、致突变危害性,是环境治理与保护工作的重点和难点。白腐真菌通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等关键酶催化自由基链式反应,对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。自20世纪80年代以来,国内外许多学者开始应用白腐真菌进行环境治理与修复的实验和应用研究。本文对白腐真菌在多种工业废水处理、垃圾及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的研究与应用进展进行了综述。 1 白腐真菌在工业废水处理中的研究与应用 1.1 造纸废水处理 吴涓等研究了不同白腐真菌对灰法造纸黑液废 水的处理效果,考察了黑液废水浓度和碳氮源添加量对黑液脱色及CODCr去除率的影响。研究结果表明,变色栓菌(Trametesverscolor)对黑液废水的 CODCr和色度的去除率分别达到64.25%和47.31%, 在添加0.2%纤维二糖和0.02%天冬酰胺的情况下应用自行分离、筛选的白腐真菌(AH28-2)处理黑液废水时CODCr去除率也达到了60%以上。该研究还发现,锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)酶活相对比值对造纸黑液的CODCr去除率有明显影响,MnP/LiP酶活比值越高时CODCr去除率也越高,说明在该降解系统中MnP起到主要作用[1]。 Marwaha等分别采用黄麻绳、棉花和小麦作为黄孢 原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium,简称PC菌,下同)生长、挂膜载体在厌氧条件下对造纸黑液进行预处理,结果表明,以黄麻绳为载体时废水的脱色率和CODCr去除率最高,相应的运行参数为温度40℃、pH5.5、 菌丝体负荷340mg、外加葡萄糖浓度1%(m/v)、 停留时间72h。Joyce等应用PC菌构建新型生物转盘(MyCoR反应器,即真菌生物转盘反应器)来处理纸厂漂白废水。实验结果表明,这种生物转盘能够有效降低白水的CODCr和BOD5并使氯化木质素脱氯。秦文娟等[2]将几种不同的白腐真菌菌丝悬浮液与海藻酸钠、氯化钙混合后凝固成球状,用于造纸E段氯漂废水的脱色处理,结果发现Polystic- tusversicolor和Phlebiaradiate两种PC菌对废水的 脱色效果最好(24h内废水色度下降50%左右)。王双飞等在8%PVA、0.5%海藻酸钠、3%细胞浓度的条件下制备固定化PC菌间歇式处理造纸E段氯漂废水。实验结果表明,在连续运行1个月内,处理效果稳定,废水的脱色率保持50%左右,TOC去除率分别保持50%~58%,比游离态PC菌间歇式连续处理分别高出17%和12%。 1.2染料及印染废水处理 张朝晖等应用PC菌生物膜反应器进行酸性染 料卡布龙红和弱酸大红的降解实验。结果表明,在限碳培养条件下挂膜培养5d后,木素过氧化物酶活力达到最高,此时分别加入酸性染料卡布龙红和弱酸大红,质量浓度分别为25、50、100mg/L和12.5、 25、50mg/L,48h后培养液基本脱色,较高浓度下菌膜上有少量吸附的残余染料,5d后染料质量降解 率分别为100%、88%、92%和58%、65%、38%[3]。 李慧第一作者简介:吴林林男1981年生华东师范大学环境科学系在读硕士主要从事水污染控制与生物修复研究 Vol.31No.1Jan.2006 上海化工 ShanghaiChemicalIndustry 8??

印染

白腐真菌对染料废水脱色及降解的研究进展 环境081 刘冰星0810240122 摘要:系统介绍了白腐真菌对染料脱色和降解作用的研究进展、脱色机理及其影响因素,旨在为以后 真菌对染料废水的脱色及降解提供参考和依据. 关键词:白腐真菌;染料;脱色及降解;机理 在所有的工业废水中,来自染料工业和印染行业的染料废水是最难处理的工业废水之一,这是因为染料是一种化学结构复杂的化合物,它含有人工合成的复杂的芳香烃分子结构很难被除去.据报道,商业染料的种类约有10万种,每年染料的总产量为7×10 t,我国年产量已达1.5×10 t,这其中大约有10%~15%的染料会直接随废水排入环境当中,这种现象在我国更为严重.染料具有高度的稳定性,难被生物降解,在环境中可以存留很长时间,染料的颜色是造成染料废水高色度的原因,从而它们产生视觉污染,使水体透明度下降,并且许多染料是由一些致癌物质(例如苯胺及其他芳环物质)合成,因此染料废水必须进行处理. 染料废水通常通过物理或化学方法处理,主要包括吸附法、絮凝沉淀技术、化学氧化法、离子交换技术、超滤膜技术、光催化技术等,然而,这些技术对废水中色度的去除效果不太明显,并且处理费用高,处理废水的范围较窄,所以众多学者都把研究焦点集中在微生物对染料废水的处理上.近几年,已有大量可以降解或吸附染料的微生物的报道,这些微生物包括细菌、真菌和藻类. 自然界中白腐真菌(white rot fungi)是一种重要的生物资源,它们对木质素具有良好的降解能力.Eaton 等L5 于1980年将白腐真菌应用到对造纸废水和印染废水的处理中,此后许多研究证实了白腐真菌在废水处理中是很有发展前景的微生物.其中研究最多的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium).白腐真菌产生的细胞外酶(包括木质素过氧化物酶Lips和锰过氧化物酶Mnps)被认为是降解木质素和染料的特殊酶系L4 J.这些酶具有非特异性、无需底物诱导的特殊性能,对许多结构不同、高度稳定、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。本文综述了白腐真菌对印染工业中染料的脱色研究,讨论了其脱色机理及其影响因素,旨在为以后染料废水的生物处理提供依据. 1 白腐真菌的生物学背景、种类及培养特性 1.1 白腐真菌的生物学背景 木腐真菌寄生或腐生在木材上,能释放降解性酶降解木质素、纤维素,侵入木质细胞腔内获取营养,导致木材腐朽,成为海绵状团块.根据腐朽后团块颜色分为白腐真菌和褐腐真菌Ll .白腐真菌多为担子菌纲(Ba—sidiomycetes).多数的多孔菌、伞菌都属于这一类型.《中国真菌志》(多孔菌科卷)记载了46属137种,其菌丝体为多核,少有隔膜,无锁状联合,多核的分生孢子常为异核,担孢子却是同核体,存在同宗配合和异宗配合两类交配系统 1.2 白腐真菌的种类’ 白腐真菌的种类很多,其中典型的有如下几种:黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),Tinc— toporia sp.,特罗格粗毛盖菌(Funalia trogii),Trametes hirsute,采绒革盖菌(Trametes versicolor),烟管菌 (Bjerkandera sp.),Pleutrotus ostreatus,杂色云芝(coriolus versicolor),朱红密孔菌(Pycnopororus cinnabar—i )等,

(完整版)酵母双杂交原理

酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence),而GAL4-ad没有。因此,在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd,LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad,VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB,?BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转

文库构建及酵母双杂交技术

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库(genomic library)将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断,并将所有这些片断都与适当的载体连接,引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求:载体容量越大,所要求的DNA片断数目越少,所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体: 载体系列(容量为24 kp )、cosmid载体(容量为50 kb )、YAC(容量为1 Mb )、BAC (容量为300 kb) 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备:断点完全随机,片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法,使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接:直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列,酶酶催作用,使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上,转化大肠杆菌寄主细胞,构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育,加入与微磁球相连的Streptavidin,用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

难降解有机物对白腐真菌P450的诱导及P450的作用

中国环境科学 2009,29(4):407~412 China Environmental Science 难降解有机物对白腐真菌P450的诱导及P450的作用 宁大亮1,王 慧1*,王立华1,2,丁 昶1(1.清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京 100084;2.河北北方学院理学院,河北张家口 075000) 摘要:实验考察了多环芳烃和氯酚类化合物对黄孢原毛平革菌P450的诱导作用及其P450对生物降解的影响.结果表明,萘、菲、2,4-二氯酚、五氯酚能够诱导该真菌P450,使微粒体P450比浓度达到37~137pmol/mg.在营养限制条件下,菲诱导的P450是营养丰富条件的5.7倍;P450抑制剂的作用使萘、菲、芘、2,4-二氯酚的降解效率下降36%~100%,但是对2,4,6-三氯酚和五氯酚的降解未产生影响.在营养丰富条件下,P450抑制剂的作用使萘、菲、芘、2,4,6-三氯酚的降解效率下降47%~100%,使五氯酚的降解效率增大57%,但对2,4-二氯酚的降解未产生影响. 关键词:白腐真菌;P450;多环芳烃;氯酚;诱导 中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:1000-6923(2009)04-0407-06 Induction and function of cytochrome P450 in degradation of refractory organic chemicals by Phanerochaete chrysosporium. NING Da-liang1, WANG Hui1*, WANG Li-hua1,2, DING Chang1 (1.State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China;2. College of Science, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China). China Environmental Science, 2009,29(4):407~412 Abstract:The involvement of P450 in degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and chlorophenols by white rot fungus Phanerochaete chrysosporium was investigated. The significant induction of P450s by naphthalene, phenanthrene, 2,4-dichlorophenol and pentachlorophenol were observed. The specific concentrations of microsomal P450s were up to 37~137 pmol/mg in the induced cells. The content of phenanthrene-induced P450 from nutrient-limited culture was 5.7 times higher than that from nutrient-sufficient culture. Piperonyl butoxide (PB), a P450 inhibitor, markedly inhibited the degradation of naphthalene, phenanthrene and pyrene in both nutrient-limited and nutrient-rich culture medium. Moreover, in nutrient-limited culture medium, PB inhibited 2,4-diclorophenol degradation but had no effect on degradation of 2,4,6-triclorophenol and pentachlorophenol. In nutrient-rich culture medium, in contrast, PB inhibited 2,4,6-triclorophenol degradation but did not affect 2,4-diclorophenol degradation. The degradation of pentachlorophenol was even elevated with the presence of PB in nutrient-rich cultures. Key words:white rot fungus;P450;polycyclic aromatic hydrocarbons;chlorophenol;induction 白腐真菌是一类可降解木质素、营腐生生活的白色丝状真菌,能够降解许多难降解有机污染物,其胞外木质素降解酶一直是环境领域研究热点[1].近年来,白腐真菌细胞内的细胞色素P450的降解功能越来越引起人们的关注.P450是一类含高铁血红素IX的单加氧酶,在许多生物体中参与多环芳烃、多氯联苯、农药等多种难降解污染物的降解[2].白腐真菌中的黄孢原毛平革菌拥有150多个功能未知的P450基因[3],是迄今所知的P450基因最丰富的真菌. 白腐真菌能够依赖胞内酶降解一些多环芳烃[1],其P450基因的表达也受多环芳烃的诱导[4];白腐真菌降解三氯酚[1]、五氯酚[5]的过程中胞内酶的作用也很重要;在动物和部分微生物中多环芳烃和氯酚类物质的代谢几乎都与P450有关[2,6].但是目前除了糙皮侧耳菌的P450对菲的 收稿日期:2008-09-16 基金项目:国家“973”项目(2004CB418506);国家自然科学基金资助项目(30400012) * 责任作者, 副教授,wanghui@https://www.wendangku.net/doc/00679593.html,

酵母双杂交实验流程(精).doc

模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白

酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基(YPD YPDA)取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品:三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注:以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 (1)选择2-3mm的单克隆(枪头吸取)放入3-5ml的YPDA液体培养基,30°摇菌200rpm,8h 7号下午开始,过夜培养,次日若菌液浓度达到标准,可先置于4度冰箱保存。 需要用品:200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 (2)吸取2.5-10ul酵母培养液,加入25ml YPDA液体培养基,摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips:由于第一次活化的菌夜浓度不一,此处建议设置梯度,分别取2.5、5、10 ul酵母培养液,加入25ml YPDA液体培养基(转化5个以下质粒的话,25ml菌量就够后续使用)。 4月8号星期五 (3)将菌液转移至灭菌的50ml离心管中,用天平配平后,室温下700g离心5分钟。 (4)弃掉上清,加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体(由于离心转速较低,沉淀易悬起来,故倒掉上清液时要小心操作)。 (5)30°震荡培养,直到OD值达到0.4-0.5 (3-5h)。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前,配置好TE/LiAc溶液,并准备好冰浴。 (6)将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中,用天平配平后,室温下700g离心5分钟。(7)弃掉上清,用30ml无菌水重悬菌体(小心操作)。 (8)再次用天平配平后,室温下700g离心5分钟,弃去上清,加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。(9)将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中,高速离心15s。 (10)弃去上清,加入600ul 1.1x TE/LIAC,感受态细胞制备完成,置于冰上待用。 需要物品:50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml

酵母双杂交的优势及关键点

酵母双杂交的优势及关键点 分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展,为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势,已出现了很多新技术,酵母双杂交就是其中的一种。酵母双杂交可以简要概括为:基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近,诱导了基因的表达。 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用,具有其独特优势。 1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行,蛋白质保持天然的折叠状态,蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。 2、双杂交系统的敏感度非常高,蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。 3、在筛选文库时,双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列,省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 经典的酵母双杂交技术的建立的主要关键点在于酵母双杂系统的转录因子和报道株。 一、转录因子 典型的转录因子含有DNA结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。DNA结合区带共性的结构主要有:1)HTH 和 HLH 结构:由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成,α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接,即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2)锌指结构:多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中,由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+,其余约 12-13个残基则呈指样突出,刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。3)亮氨酸拉链结构:多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端,与癌基因表达调控有关。由两段α - 螺旋平行排列构成,其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基,亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状,两条肽链呈钳状与 DNA 相结合。 1、酵母双杂系统的转录因子 酵母双杂交技术的建立要归功于Fields对酵母转录因子GAL4的研究,GAL4包括两个彼此分离的结构域.。位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。而AD则是通过与转录机构

白腐菌

野生白腐菌分离与纯化的初步试验 前言 白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌,能够分泌胞外氧化酶降解木质素,且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力,这些酶可以促使木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐,故称为白腐真菌 白腐菌: white rot fungi 定义: 属担子菌纲丝状真菌,因腐朽木材呈白色而得名。代表菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),在污染土壤修复中常有应用。 白腐菌是属于担子菌亚门的真菌,因腐朽木材呈白色而得名,是能够降解木材主要成分的微生物之一。木材在白腐过程中大部分纤维仍保持完整,且纤维素结晶度变化不大。由此设想利用对降解木质素选择性好的白腐菌进行生物制浆,能开辟制浆方法的新途径。白腐菌除了能降解木质素用于预理、生物漂白、生物制浆外,对其它有机异生物质也有很强的分解能力,因而在废水处理中也有广泛的应用前景。 为降低制浆能源消耗,可在制浆之前依靠白腐菌对木质素进行分解和改性,用选择过的微生物培养基对原料进行预处理。通过白腐菌对原料的预处理,可降低后阶段制浆能耗的50%,并且纤维强度性能也得到改进。 白腐菌预处理制浆不仅在木质材料制浆当中应用研究较多,在非木质制浆原料(如芦苇、蔗渣、剑麻、黄麻等)预处理制浆中的应用研究同样广泛。 可以看出,白腐菌预处理在硫酸盐法、碱法、机械法和烧碱-蒽醌法等制浆方法中都可以不同程度地降低制浆成本、提高纸张质量。但是菌种筛选困难和预处理周期较长是制约白腐菌应用的最大障碍,大规模应用于制浆预处理还需要相关方面技术的突破。 利用白腐菌可以降解木质素、半纤维素和纤维素的特性,白腐菌在制浆造纸各个环节的应用都得到了很广泛的研究,但是利用白腐菌直接制浆却鲜见报道。筛选对纤维素没有影响或影响较小的选择性极高的白腐菌种直接处理原料制浆是一个新的研究方向。20世纪90年代末,日本神户制钢所应用白腐菌在常温常压下分解木材成功制出优质纸浆。选定适宜温度,可以分解出80%的木质素,比一般化学制浆法成本降低了50%。这种白腐菌对木质素的脱除分解率极高,而对纸浆纤维中的纤维素分解极少,这样可使纸浆得率高达60%,超过化学法得浆率的50%。据此计算,木材的消耗量可节约1/9。此种制浆方法将是传统制浆方法的巨大挑战。同样,制浆周期长、白腐菌筛选困难是大规模生产的最大障碍。 在造纸工业中,为了使最终产品的白度既高又稳定,必须把浆中残余木质素所造成的棕黑色通过漂白来除去。用生物方法脱除浆中的残余木质素是现阶段人们研究最多的一种方法,普遍认为白腐菌是最有效的菌种。

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