蛋白质组学与分析技术1
名词解释
蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。
三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱；
第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。
高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期
长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。
吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸
附中心的过程。
PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA
得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。
广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一
基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。
狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。
cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。
基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。
基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术
同源建模：又称比较建模，其原理是序列相似则结构相似，即存在同源关系的两条序列具有相似的结构。当两条序列的同源性大于30%时，序列的同源性能够暗示两者结构相似，序列的同源性越高则结构模型的准确性越高。
蛋白质一级结构：蛋白质分子多肽链中氨基酸的排列顺序。
一、蛋白质组学主要包刮那些分析技术及各自特点
一、蛋白质分离纯化技术
1.硫酸铵沉淀技术：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来因而分离出的蛋白含量多，种类比较全。
2.双向电泳：在双向凝胶电泳中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等点聚焦点一向电泳中分离，接着被被转移到二向SDS-PAGE凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。因此该技术分离蛋白具有灵敏度高的优点。但对膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离有待改善。
3.高效液相色谱：在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。
3.多维液相色谱：多维液相色谱是一项很好的分离蛋白质与多肽的技术，具有灵敏度高、表现度高、分辨率高以及与LC-MS等仪器联用实现自动化等优点。
4.蛋白质薄层层析：薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0．01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。
5.蛋白质柱层析：根据分子筛效应。大分子物质，直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，只能分布在颗粒之间；小分子物质，在凝胶颗粒间隙中扩散，走的路程较长，从而达到分离的目的。
二、蛋白质的鉴定技术
1.完全水解法：打断了蛋白质中的所有肽键，因而该方法虽然能够分析蛋白质中的氨基酸组
成，但是却不能揭示蛋白质的序列。
2.Edman讲解法：需要选择性地从蛋白质分子的N端打断末端肽键从而使末端氨基酸依次从蛋白质分子上水解下来，该方法是确定蛋白质N端最方便的方法，具有灵敏度高。
3.生物质谱：通过测定样品的离子的质荷比来进行成分和结构分析的分析方法。这种技术具有高灵敏度和高质量检测范围，使得检测相对分子质量高达几十万道尔顿的生物大分子成为可能。
三、蛋白质定量方法
1.染色定量：具有很好的通用性和高灵敏度，但是染色影响后续的鉴定过程，并且由于2D 电泳的重复性差，导致染色强度与蛋白质含量不成正比。
2.利用荧光染料进行定量：该技术克服了不同凝胶重复性差的问题，定量更加准确。但是由于它是在等点聚焦前对蛋白质进行标记，可能会带来一系列的问题。
3.质谱蛋白定量：该技术具有超强的质量分辨能力，对细胞蛋白混合物进行一维分离后就可
以鉴定。
4.蛋白质芯片技术：可以高通量的检测蛋白质表达的上调与下调。
四、蛋白质结构分析
1.X射线结晶：具有分辨率高，普遍性高，没有分子量限制；收集数据块，可以自动化；可
以找出膜蛋白晶体。以及不损伤样品、无污染、快捷、测量精度高、能得到有
关晶体完整性的大量信息等优点。能否得到一个高度有序的晶体，是限制该技
术的一个瓶颈。
2.核磁共振：不需要晶体结晶，精度高，动态结构，接近生理条件下研究蛋白质相互作用，
特别适合研究低亲和力的瞬态复合物。其缺点是：必须同位素标记，数据处理
复杂，目前最大30kd，要求蛋白质不聚合，折叠良好，蛋白浓度高、量大稳
定，没有X射线衍射分辨率高。
3.同源建模：方法目前被认为是最精确的方法。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效，具有简单、自动化、对学术团队免费的优点。
2．蛋白质组研究的技术路线流程图
3．蛋白样品的制备原则与纯化原理
制备原则：
总目标：增加制品的纯度(purity)或比活(specific activity),并且希望所得蛋白质的产量达到最高值
1.前处理：因动/植物/细菌而异
2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法
3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等
4.结晶
1、前处理：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
1.尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失
2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解
3.样品裂解液应该新鲜制备、并且分装冻存于-80C,不要反复冻融已制备好的样品
通过超速离心清除所有的杂质
4.加入尿素之后加温不要超过37C,防止氨甲酰化而修饰蛋白
2、蛋白质粗分离
2.1蛋白质的浓缩
透析：利用蛋白质不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。
超滤：利用压力或离心力，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。如果滤膜选择得当，还能同时进行粗分级。
凝胶过滤层析：也称分子排阻层析(molecular-exclusion)，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。
2.2蛋白质沉淀
等电点沉淀：蛋白质处于等电点时，其净电核为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其它条件相同时，它的溶解度达到最低点。
盐析：当溶液的离子强度增加到足够高，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析
原来溶液中大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水；原来被迫与蛋白质表面的疏水基团接触的水分子被移去溶剂化盐离子，疏水基团被暴露，疏水相互作用使蛋白质聚集而沉淀。
有机溶剂分级分离法
有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，从而增加两个相反电荷之间的吸引力（库伦定律）。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
密度梯度离心：蔗糖梯度聚，蔗糖梯度（如Ficoll），其它合成材料的密度梯度
3.蛋白质的细分离：
3.1层析法
当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是一个常数，称为分配系数。
离子交换层析：根据电荷来分离分子。如果解离基团带负电，则能结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果解离基团带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂；
3.2凝胶过滤
疏水相互作用层析：利用载体和样品的疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水相互作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
亲和层析：亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。
1.待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
2.具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
3.利用生物学的特异性进行分离，因而分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。
3.2金属螯合层析
1.分子中含有能够与二价金属离子螯合的基团的化合物或生物大分子。
2.分子结构中已经含有二价金属离子的金属结合蛋白。这类物质分子中含有的金属离子可以与螯合介质上的亚氨基发生螯合作用，一般选用无金属离子的螯合介质分离。
3.3吸附层析
利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。
3.4聚焦层析
利用层析过程中固定相偶联的具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动相中的某些两性离子发生等电聚焦反应而进行分离的一种方法.
pH梯度自动产生，省去梯度混合装臵，所以仪器设备简单；
有聚焦效应，能产生很窄的分离区带，所以分辨率高；
多元缓冲液和多元缓冲交换剂有商品供应，易于使用；
分离容量大，操作简单容易；
适合于分离任何水溶性的两性分子。
3.5高效液相层析
使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。
3.6蛋白质的电泳分离
3.6.1聚丙烯酰胺凝胶
机械性能好，有弹性，透明 化学上稳定
对pH和温度比较稳定
是非离子型的
没有吸附和电渗作用
所需样品量小 分辨率高
可控制凝胶孔径大小
具有分子筛作用
限制样品扩散（抗对流）
稳定的亲水凝胶（酰胺基团）
3.6.2等电聚焦电泳
利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
3.6.3双向电泳
广义：将样品进行电泳后，为了不同的目的在它的直角方向再进行一次电泳。
狭义：双向电泳大都指第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。
样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点、分子量等信息。分离的结果不是带，而是点。
4．简述高效液相色谱、气相色谱、质谱、液质联仪的工作原理及用途
高效液相色谱：
高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统五大部分组成。还可以根据一些特殊的要求，配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等。分析时，选择适当的色谱柱和流动相，开启高压泵，用甲醇、水及流动相冲洗柱子，待柱子达到平衡后，进样分离，分离后的组分依次流入检测器中进行检测，所测得的信号为记录器记录下来。样品制备时，分离后的组分依次和洗脱液一起排入流出物收集器中收集。
用途：目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一
气相色谱：待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很
难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。
用途：在仪器允许的气化条件下，凡是能够汽化且热稳定的，不具腐蚀性的液体或气体，都能够用气相色谱法分析。
质谱：质谱仪主要包括三个部分，离子源、质量分析仪和离子探测器。离子化源的功能是把分析样品在真空状态下转为气相离子。离子朝向分析仪的电场加速，在到达探测器的过程中按照他们的m/z比被分离。栗子探测器的功能就是记录各个粒子的冲击力。
这些质荷比并不直接给出有关离子结构的信息，但是质核比不同的离子碎片的种类及其相对含量与试样分子的组成和结构有关。
通过对质谱的分析（试样分子可能产生的各种离子碎片分析）和根据已知的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的结构、组成及其分解历程。
用途：制作肽质量指纹图谱和从头确定蛋白质序列。
液质联仪的工作原理及用途
液相色谱/质谱联用，主要用于分析GC/MS不能分析，或热稳定性差，强极性和高分子量的物质，如生物样品（药物与其代谢产物）和生物大分子（肽、蛋白、核酸和多糖）。
简单的说，就是利用HPLC的分离技术，将混合的东西分离成单一的物质，依次进入质谱，打成碎片，然后从物质的结构分析，可以大体判断键的断裂方式，然后通过质荷比对照相应的对照图库大概判断碎片的分子结构，从而来对未知物质做定性，但是质谱并不是百分百的确定结构，要准确的确定物质结构，还要做很多其他的东西，比如核磁等。
因质谱需要离子化，所以流动相的要求比较高，常见的钠盐钾盐都不可以用
5．高效液相色谱有哪些主要特点
总体来看：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。HPLC在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有高效、快速、高灵敏度、高自动化等优点。HPLC在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱流出依靠的是本身的重力，速度极慢，而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速有较大提高。
6．怎样进行蛋白质和多肽的氨基酸序列测定
一、化学降解法
1.完全水解法：由于该法打断了蛋白质中的所有肽键，因而该方法虽然能够分析蛋白质中的氨基酸组成，但是却不能揭示蛋白质的序列。
过程步骤：蛋白质在浓盐酸中煮沸24-72小时能够完全水解为氨基酸组分。使用水和茚三酮或荧光胺等试剂标记氨基酸组分，当它们流经HPLC柱时与一套氨基酸标准品相比较从而被分离和检测。荧光标记可以检测含量少至纳克级的氨基酸，因而可以对很少量的纯化蛋白样品进行分析。酸性和极性氨基酸首先从柱上洗脱下来，而碱性氨基酸则最后从柱上洗脱下来。在每一种情况下，某一氨基酸吸收峰的高度与它在待分析蛋白质中出现的次数成比例。
2.Edman讲解法：需要选择性地从蛋白质分子的N端打断末端肽键从而使末端氨基酸依次从蛋白质分子上水解下来，该方法是确定蛋白质N端最方便的方法，具有灵敏度高。
其步骤包括：用异硫氰酸苯酯标记蛋白质的或多肽的N端氨基酸，弱酸水解使毗邻异硫氰酸苯酯修饰过的氨基酸残基末端的肽键断裂，而剩下的肽链仍然是完整的。断裂下来的氨基酸末端，可以使用色谱来鉴定，对其他的残基依次重复上述步骤，这样就测出一个较长的序列。
二、生物质谱法
1.生物质谱：质谱仪是能够测量真空中离子的质荷比的一种仪器。根据质荷比可以准确地确定待测样品的分子质量，从而确定其分子组成。蛋白质组中，分析样品通常是某蛋白质经胰酶或类似试剂的消化产生的肽段的混合物。质谱可以进行一下两种分析：
1、分析完整肽离子首先计算完整太短的质量，根据这些质量与相关数据库查询的结果鉴定样品中的蛋白质。
2、分析碎片离子首先确定肽端的质量，这些质量可用于相关数据库查询或从头推断新序列。在后一种情况，推断的新序列再以BLAST或FASTA为基础的相似性搜索中可以作为标准的查询序列。
A2测序时，先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)和SV8酶(staphylococcus aureus V8)等。各个酶解片断用HPLC等分离得到的纯肽或者简单的混合肽，可以用MS-MS测定其各组分的顺序，然后通过不同的蛋白水解酶酶解片段顺序，找到重叠部分。进而可得到整个蛋白质的顺序。
7．基因组文库和cDNA文库的构建各有哪些基本步骤
基因文库(gene library)，也称基因组文库（genomic library）：这是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。即用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将这些片段与适当的载体进行体外重组，在引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA分子的群体。从理论上讲，这些重组子应包含整个基因组DNA序列，即包含某种生物细胞的全部基因。因此，称之为基因组文库，或基因文库。
基因组文库的构建
如图所示，一般包括下列基本步骤：
（1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；
（2）载体DNA的制备；
（3）载体与外源大片段连接；
（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；
（5）重组DNA的筛选和鉴定。
cDNA文库的构建
cDNA：利用纯化的总mRNA在逆转录酶作用下合成的互补DNA.。
cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称为cDNA文库。构建cDNA文库通常包括
（1）mRNA的提取及其完整性的确定；
（2）cDNA的合成和克隆；
（1）cDNA第一链的合成
（2）双链cDNA的合成
（3）cDNA基因与载体的重组
（4）转化
（5）目的cDNA克隆的鉴定
（6）特定cDNA的克隆
（3）目的cDNA的鉴定等步骤。
8．简述基因芯片操作流程
一、DNA微阵列的制备—制备流程和操作
1.在片架上放置好经过表面处理的醛基载玻片
2.取每个DNA样品溶液5μl，溶于5μl 3? SSC中，然后依次放置到96孔板（或
384孔板）的相应孔中，放在架上
3.启动点样控制程序，设置好各个参数，开始点样；机器手将一组点样针浸入
盛有样品的96孔板（或384孔板）的孔内，使点样针的储液槽缝中吸满样
品，每针约1 l溶液，然后机器手移位，使点样针轻轻接触载玻片上一定位
置，于是在载玻片留下一小滴溶液
4.每点完一个样品后都要清洗、干燥点样针。新的斑点与先前的斑点应有一个
小的距离，以点成高密度的阵列芯片。
DNA微阵列的制备－靶DNA的制备
对于全基因序列已测定的生物来说，可将所有已知和预测的基因组中的开放阅读框（ORF）直接用PCR扩增，纯化PCR产物，然后点印到芯片上
对于未测序或只有部分序列测定资料的基因组，或带有大量内含子的基因组，可用来自cDNA 文库的克隆作靶标。
DNA微阵列的制备－点样
玻片的处理
通常在玻片上接上活性基团如氨基、醛基、巯基等，使DNA分子通过共价键牢固地固定在玻片上
点样针的选择
点玻片用空心针，点膜用实心针
点样缓冲液
有利于形成均匀的小圆点，使DNA均匀分散，促进DNA结合到微阵列表面，容易洗脱
一般用高盐缓冲液（磷酸钠或3 SSC）或50％DMSO
DNA微阵列的制备－点样后处理
再水合和快速干燥
再水合使DNA呈均匀的分布，将玻片干燥是为了提高DNA的吸附并降低背景
紫外线交联
通常将玻片置于70 mj紫外交联仪中交联
封闭
在25℃0.2%SDS中洗2次，每次5min；25℃纯水中洗2次，每次5min；95℃纯水中洗1次，洗2min，凉至室温；后迅速将玻片放入25℃0.2%SDS中洗3次，每次1min；25℃纯水中洗2次，每次1min，玻片自然干燥。目的是将玻片上剩余的醛基进行修饰，以降低它们结合标记探针DNA的能力
变性
将载玻片架放入沸水中，上下提放3 5次，静置2min，立即将玻片转移到盛有95％乙醇的槽中，上下提放片架3 5次，后将玻片用离心机甩干。
DNA微阵列的制备－探针的制备和纯化
理想的探针长度应在200 500 bp，过长会降低杂交效率
mRNA的分离
用热酚抽提法、异硫氰酸胍盐稳定法或其他方法。对基因表达研究来说，用纯化的PolyA－RNA作为反转录的模板结果最佳。
cDNA的合成
标记
多数情况下用直接掺入法在逆转录时标记cDNA。如有可能，可在以Poly(dT)为引物的逆转录反应中，用随机引物法将荧光标记的核苷酸标记cDNA。
荧光染料：用Cy3-和Cy5-dUTP可取得满意的结果
杂交
在微型台式离心机中高速离心探针样品，使小颗粒物沉积下来
吸取含探针上清液点到芯片的中心（注意避免气泡产生）
放一盖玻片置于探针之上（注意避免气泡产生）
在载玻片的其它部位加5μl 3? SSC（保持杂交室中的湿度）
将载玻片放在一密封的室中，浸没在42~65℃水浴中6~24hr
杂交后处理
1.制备3种洗涤溶液
洗液1：325 mlMQ水，17.5 ml 20?SSC，7 ml 10％SDS（最后加）
洗液2：340 mlMQ水，1.75 ml 20?SSC，7 ml 10％SDS
洗液3：350 mlMQ水，1.75 ml 20?SSC
2.将玻片放入玻片架上，加入洗液1，将玻片上下提放2~3次，使盖玻片脱落，玻片
在洗液中轻轻振摇5 min（洗液架用箔包住，下同）
3.将玻片放入洗液2中，轻轻搅动5 min
4.将玻片移入另外的玻片架中，加入洗液3 ，轻轻搅动5 min
5.重复第4步骤
6.用电吹风或玻片离心机(1 000 g 10 min)将玻片迅速风干
7.将玻片存于暗下、干燥的环境中（加干燥剂），2周内扫描。
以上操作均在室温下进行
结果读取和数据分析
将玻片置于激光共聚焦扫描显微镜（扫描仪）中进行扫描
每一点的杂交信号由Cy3和Cy5两种荧光标记的强度表示，Cy3和Cy5分别标记正常组和实验组
荧光强度比值< 0.5，则基因表达下降
荧光强度比值在0.5 2，则基因表达没有变化
荧光强度比值> 2，则基因表达上升
（可登陆https://www.wendangku.net/doc/0112722149.html,/seidel/protocols/percent inc.html计算）
用RNA印迹验证芯片结果的可靠性
9、酵母双杂交技术具有哪些用途
酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid)，简称双杂交系统(Two-Hybrid System)，又称相互作用陷阱(InteractionTrap)，是1989年由Stanley Fields和Song等在验证两个蛋白质间相互作用的亲和力时初步建立的，并在Nature杂志上首先描述了这一系统，该系统是以酿酒酵（S.cerevisiae）为宿主，在酵母菌内研究蛋白质－蛋白质相互作用的一种分子生物学方法。酵母双杂交正成为探索蛋白质相互作用最常用和最有力的工具。
目前已被广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞黏合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究及药物开发。
应用：
1 检验－对功能已知蛋白间的相互作用
优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反应，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。
2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域
可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进行缺失实验而找到相互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋
白做点突变或缺失突变的处理。
3发现新的作用蛋白质
用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。
4 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是药物设计的目标，则有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。
5分析新基因的生物学功能
即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD载体上，而把将要筛选的cDNA文库克隆在AD载体上，利用双杂交技术可以找到一个新的结合蛋白，这个结合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所编码，然后根据调到的已知基因的功能推测该新基因的功能。
6寻找调控蛋白相互作用的蛋白，在恢复转录活性的双杂交系统中加入某一分子化合物后再检测报告基因的表达强度，可用来寻找抑制蛋白质之间相互作用的小分子化合物。
7 蛋白质相互作用图谱的构建
随着基因组研究计划的开展，及mRNA在不同组织器官的不同发育阶段表达图谱的构建，蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。酵母蛋白质相互作用的横向研究是近年来双杂交系统最引人注目的应用，用以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系。
10、请试图阐述蛋白质结晶中的悬滴法（hanging drop）
悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封。
悬滴法长晶体包括以下四个步骤：
第一步, 在作结晶实验之前，最好对蛋白质样品进行离心，以除去不溶解的蛋白和杂质,
以减少不必要的成核中心, 此外，对蛋白质样品进行超滤，也是值得推荐的。
第二步, 采用“吹气法”除去培养晶体用的组织培养板和盖玻片上可能带有的灰尘。
第三步，在组织培养板的孔中加入0.2 - 0.5ml经过超滤的含沉淀剂及添加剂的缓冲液,作
为池液, 孔边缘涂上真空脂。
第四步, 吸1ul或2ul池液放到硅化后的盖玻片上, 加等体积蛋白溶液至此池液上(这个体
积比将决定平衡后的蛋白质浓度)，混合均匀，应避免气泡出现。第五步, 翻转盖玻片盖在孔上, 检查密封是否良好。
蛋白质组学与分析技术1
名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
蛋白质组学研究方法选择及比较
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质组学研究的完整解决方案
蛋白质组学研究的完整解决方案 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。 为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System） 该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征： * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃ * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统 * 提供超纯的相关化学试剂和药品
蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.wendangku.net/doc/0112722149.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
蛋白质组学技术在各领域的解决方案
蛋白质组学技术在农业生物科研领域、疾病机理机制研究、药物研究、海洋环境、植物胁迫机制研究等方面具有广泛应用。蛋白组学的研究通常遵循以下思路： 蛋白质组学研究思路 图 1 蛋白质组学研究思路 一、蛋白质组学在农业生物科研领域的应用 蛋白质组学技术在农业生物科研领域的应用为作物生长发育、病虫害防治、遗传育种、畜牧兽医学疾病诊断和治疗等方面发挥重要的作用，为现代农业发展开辟新途径。 1 .蛋白质组学在农作物研究中的应用 农业是我国人口赖以生存的基础，而提高粮食产量和品质则是农业发展的关键。蛋白质组学关键技术在作物遗传育种、品系鉴定、品质改良、逆境胁迫应答等关键环节的应用，为农业作物的进一步开发利用提供巨大的参考价值。蛋白质组学可系统研究农作物在特定环境或某个发育阶段的组织和器官中蛋白质的表达变化，有助于作物发育过程机制的理解。 Jia等人利用SWATH等技术对四种玉米组织中的蛋白质进行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日龄幼苗的根。在玉米的4种组织中总共鉴定到4551个蛋白质，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分别鉴定到3916、3707、3702和2871种蛋白质。利用生物信息学技术将蛋白质组和转录组进行关联分析，并且进一步分析组织特异性高表达的基因和蛋白，以了解玉米组织结构和器官发生的调节机制，为研究玉米发育生物学研究提供了新的线索。相关成果2017年发表在Journal of Proteome Research上。
图 2 实验流程图 文献来源：Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017. 2.蛋白质组学在食品科学中的应用 在食品安全研究中，蛋白组学的出现为食品科学的研究指明了方向，同时也为食品科学的研究奠定了良好的发展平台。蛋白质组学在粮油食品、肉类食品、水产食品、乳品食品等方面的应用，不仅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及储存条件的同时，还可以提高食品的口感以及营养程度。 在热处理过程中，肉类的主要成分蛋白质会发生结构性变形，如氧化、降解、变性和聚集。蛋白质的这些变化对最终肉制品的质量、颜色、嫩度和风味有重要影响，并最终影响适口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技术手段研究了在加热中心温度为72℃时用不同的烹饪方法，例如水浴烹饪-WB、短时欧姆烹饪-STOH和长时间欧姆烹饪-LTOH，对牛肉的颜色、烹饪损失、剪切值和蛋白质组变化的影响。蛋白质组学分析表明，欧姆烹饪的烹饪损失、剪切值显著低于水浴烹饪（P<0.05）。利用2-DE蛋白组学技术成功鉴定到STOH和WB烹饪样品之间的17个差异蛋白质，并鉴定出LTOH和WB样品之间的13个差异蛋白质。大多数差异蛋白是肌原纤维和肌浆蛋白，可能与肉质的变化相关。WB烹饪可改变蛋白质溶解度并降低2-DE图像中的蛋白质斑点强度。应用欧姆烹饪会产生更高质量的牛肉产品，并减少烹饪时间。相关成果2016年发表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。
蛋白质组学与分析技术课复习思1考
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复