RNA提取、逆转录和PCR
总RNA的提取
一、仪器及试剂：
仪器：低温高速离心机；紫外分光光度计；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等
试剂：天根总RNA提取试剂盒；氯仿；无水乙醇等。
样品：大鼠外周血或单个核细胞等。
二、实验步骤(准备工作：RD和RW加无水乙醇)：
1、细胞悬液：离心去上清，5-10×106细胞加RZ 1ml(新鲜血液：0.25ml血
+0.75mlRZ裂解液)，室温 5min；
2、加 200ul 氯仿，震荡混匀 15s，室温 3min；
3、 4℃12000rpm 离心 10min，上层水相层转移至新管（无 RNase）中；
4、加 0.5 倍体积（500ul）无水乙醇，混匀；
5、上柱，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；
6、加 500ulRD，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；
7、加 600ulRW，室温 2min，4℃12000rpm 离心 30s,弃废液；
8、重复上一步；
9、换新收集管，4℃12000rpm 离心 2min,弃废液；
10、换新收集管，加 30-100ulRNase-free ddH2O，室温 2min，4℃12000rpm 离心 2min；
11、浓度及纯度检测；
12、保存在-70℃。
总R NA逆转录成c DNA
一、仪器及试剂：
仪器：低温高速离心机；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等
试剂：RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit。
样品：大鼠总RNA。
二、实验步骤：
1. 冰上充分溶解逆转录试剂盒中的相关试剂和R NA。
2. 取P CR 管，冰上依次加入以下试剂：
Oligo(dT) 1ul
总R NA 0.1 ng - 5 μg（1ul）
加R Nase-free 水至12ul，混匀。
。
3. 4℃微离心（5000r/min×5sec）
4. 置P CR 管与P CR仪中，65℃孵育5min，迅速置冰上，微离心。
5. 依次加入以下试剂：
5×reaction buffer 4ul
RiboLock? RNase Inhibitor (20 u/μl) 1ul
10 mM dNTP Mix 2ul
M-MLV 1ul
6. 混匀，4℃微离心。
7. 置P CR 管于P CR仪中，42℃孵育60min，再于70℃孵育5min，终止反应。
8. 合成的c DNA 于-20℃保存一周备用。
普通PCR反应和琼脂糖电泳
一、仪器及试剂：
仪器：普通离心机；PCR仪；高精度加样器及枪头：0.5-10uL、20-200uL、200-1000uL；EP管等。
试剂：DNA Marker-B、2×PCR Master Mix、Ⅰ型核酸染色剂、GAPDH或β-actin 引物、目的基因引物、上样缓冲液、1×TBE缓冲液、琼脂糖凝胶制胶板及梳齿等。
样品：cDNA、DNA。
二、实验步骤：
实验分三组：
实验组：（模板：cDNA；引物：目的基因）
阴性组：（模板：无；引物：GAPDH或β-actin）
阳性组：（模板：DNA；引物：GAPDH或β-actin）
PCR反应（25ul）：
1. 冰上依次加入以下试剂：
2×PCR Master Mix 12.5μl
模板DNA 1ul
上游引物0.5ul
下游引物0.5ul
RNase-free ddH2O 10.5ul
混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪。
2. 反应条件：
（1）94℃预变性5min。
（2）94℃变性 30sec
Tm 温度退火 30sec
72℃延伸 5min
以上步骤 35 个循环。
琼脂糖凝胶电泳（2%的凝胶）：
1. 称取0.4g琼脂糖，加入1×TBE20ml，摇匀，微波炉中加热1分钟；
2. 溶液稍冷却后至60℃，加入5ul核酸染料；
3. 胶块制作好后，向加样孔中加入DNA maker 5ul；加样孔加PCR产物10ul；
4. 电泳：电压100V，电流100mA，恒压电泳，时间45min，不跑出胶为限。
5. 将胶置于凝胶成像系统拍照保存。
荧光定量PCR 试剂：2 x Sybr Green qPCR Mix
实验步骤：
实验分三组：
实验组：（模板：cDNA；引物：目的基因）
阴性组：（模板：无；引物：GAPDH或β-actin）内参：（模板：cDNA；引物：GAPDH或β-actin）
PCR反应（50ul）：
1.冰上依次加入以下试剂：
2 x SYBR qPCR Mix 25 ul
DNA Template 2 ul
Forward Primer (10 μM) 1 ul
Reverse Primer (10 μM) 1 ul
加ddH2O至总体积50 ul
PCR 循环（三步法）
94℃ 5 min
94℃15 sec
55-65℃15 sec 40cycles
72℃35 sec
72℃5min