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抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化

一.P roteinA柱子的制备

1.配制溶液;

结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4,20mM ;PH8.0。

配制500ml的方法:

称取NaCl 4.383g,Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。

2. 制备空柱子

(1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。

(2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。

(3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。

(4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。

(5)加入5ml的ProteinA到柱子中。

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二.纯化步骤

1.样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。

2.平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。

3.上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。

4.洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。

5.收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。

测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活)

6.柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。

7.PBS透析收集的抗体。

三.试剂的制备

1. 结合缓冲液1000ml 500ml

甘氨酸112.6g 56.3g

氯化钠175.2g 87.6g

氢氧化钠调PH至9.0

2. 洗脱缓冲液500ml

甘氨酸7.507g

用盐酸调PH至3.0

3. 再生缓冲液500ml

甘氨酸7.507g

酸调PH至2.0

4.称取12.1gTris碱,加80毫升的双蒸水,溶解后用盐酸调节PH8.0,补加到水100毫升,