高效液相色谱法测定猪肝组织中土霉素_四环素_金霉素残留量
高效液相色谱法测定猪肝组织中
土霉素、四环素、金霉素残留量
林 玲 章程辉 程盛华 查玉兵 杨春亮
(中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001)
摘 要 建立了高效液相色谱法测定猪肝组织中四环素族抗生素留量的方法。通过对样品前处理方法进行优化,用固相萃取-高效液相色谱法同时测定了猪肝组织中土霉素、四环素、金霉素3种四环素族抗生素的残留量。该法对土霉素、四环素、金霉素的检出限分别为13、15、40
μg/kg ,相对标准偏差为3.02%～5.93%,平均回收率为83%～90%。
关键词 高效液相色谱法 猪肝组织 四环素族抗生素
作者简介:林玲,女,1978年8月出生,硕士,助理研究员,主要从事食品分析。E 2mail :linling408@https://www.wendangku.net/doc/0b1610414.html, 通讯作者:杨春亮,男,研究员。TeL :0759********
1 前 言
近年来,四环素族抗生素(TC S )作为一种饲料
添加剂大量而广泛地用于畜禽养殖业。TC S 主要起疾病防治和促进生长的作用。但是这类药物长期使用就会在动物体内累积,从而在动物性食品中残留。若长期食用这些动物性食品及其制品就会危害人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏的损害以及导致畸胎[1]。为了保证食品的卫生安全和提高我国食品在出口贸易中的竞争力,农业部对兽药中抗生素残留的最新限量为不超过0.1mg/kg [2]。目前四环素族抗生素的主要检测方法有高效液相色谱法[3-5]、微生物法[6]和分光光度法[7]。其中高效液相色谱法应用最多,但提取方法大多采用固相萃取柱净化(或双柱净化),操作步骤繁琐[4,8]。本文在文献[8]的基础上,改进了提取方法,用Waters C 18固相萃取柱取代了Oasis HLB 固相萃取柱和Carbo xylic Acid 阴离子交换柱净化,流动相用乙腈-磷酸二氢钠溶液取代了乙腈-甲醇-0.01mol/L 草酸溶液。实验表明,本法具有操作简便、检出限低、灵敏度高的优点,适于畜禽组织中四环素族类抗生素的检测。
2 实验部分
211 仪器设备
Waters 高效液相色谱仪,配有自动进样器、四
元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器;离心机
(4000r/min );旋涡混合器;氮吹仪;Waters C 18固相
萃取柱(6mL ,500mg );p H 计。212 试剂与溶液
甲醇(色谱纯),乙腈(色谱纯),超纯水,草酸(分析纯),柠檬酸(分析纯)。
McI -Vaine 溶液:称取28.41g 磷酸二氢钠和21.01g 柠檬酸,分别用水定容至1000mL ,将625mL 磷酸二氢钠和1000mL 柠檬酸溶液混合,将p H 调至4.00±0.03。
McI -Vaine -ED TA 溶液:称取60.49g 乙二胺
四乙酸二钠(Na 2ED TA ?2H 2O ),加到1625mL McI -Vaine 缓冲溶液中,使其溶解,摇匀。
草酸甲醇水溶液:称取1.50g 草酸,用甲醇定容至100mL ,混匀后,按1︰1比例用水稀释。
固相萃取洗脱液10mmol/L 草酸甲醇溶液:称取0.387g 草酸,用甲醇定容至300mL 。
标准储备液:精密称取土霉素、四环素、金霉素标准品各0.010g ,分别用甲醇溶解并定容至100
mL ,浓度均为100
μg/mL 。混合标准工作液:各取土霉素、四环素、金霉素标准储备液,用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作液。213 实验方法21311 样品前处理
样品提取:称取5～10g 搅碎的猪肝样品于50mL 聚四氟乙烯离心管中,加入McI -Vaine -ED TA
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2 分析仪器 2009年第2期
溶液15mL,在旋涡混合器上混匀2min,在离心机上离心10min,取上清液,残渣分别用15mL和10mL McI-Vaine-ED TA溶液提取两次,离心,合并上清液。
固相萃取净化:将Waters C18固相萃取柱依次用10mL甲醇、15mL水进行活化,然后将上清液过柱,用10mL超纯水洗柱,以无液滴滴下为止,用固相萃取洗脱液10mmol/L草酸甲醇溶液15mL进行洗脱,将洗脱液收集到试管中,于45℃下氮气吹干,用草酸甲醇水溶液2.0mL溶解残渣,供高效液相色谱仪分析。
21312 色谱条件
色谱柱:Symmetry C18柱(250mm×4.6mm, 5μm);流动相:乙腈︰10mmol/L磷酸二氢钠溶液(p H2.5)=30︰70;柱温:35℃;流速:1.0mL/min;进样量10μL;检测波长:355nm。
3 结果与讨论
311 样品提取液的选择
对高氯酸、甲醇、McI-Vaine-ED TA溶液作为提取液进行了比较试验。结果表明,用高氯酸作提取液时,虽然可以沉淀样品中的蛋白,减少基质的干扰,但它对四环素族抗生素有较强的氧化性,对色谱柱也有一定的腐蚀性,影响了测定结果,故不宜选用。用甲醇作提取液时,虽然四环素族抗生素在甲醇中的溶解度比较大,但甲醇的提取效率不高。用McI-Vaine-ED TA溶液的提取效果良好,回收率高,故本法选用McI-Vaine-ED TA溶液作为提取液。
312 分析波长的选择
用二极管阵列检测器对土霉素、四环素、金霉素的混合标准溶液进行扫描,结果发现土霉素、四环素和金霉素均在355nm处有最大吸收,故本法选用检测波长为355nm。
313 流动相条件的选择
对流动相的配比和p H进行了比较试验。分别对流动相配比为乙腈+磷酸二氢钠(含0.01 mol/L)=22+78、25+75、30+70、35+65进行了试验,从色谱图的分离效果看,乙腈+磷酸二氢钠=30 +70时,分离效果和效率最佳。分别配制p H= 4.0、3.0、2.5、2.0的Na H2PO4缓冲液,观察不同p H的流动相对分离效果的影响,结果表明:p H大
于2.5时,柱效明显降低,拖尾加剧。这是因为四环素容易与金属离子形成螯合物,并在反相色谱柱的硅醇基上吸附。为了避免上述问题,常在流动相中加入各种酸,如磷酸、草酸、ED TA等,本实验选用磷酸调节,在p H为2.5时,色谱峰的分离效果最好,若p H太低,则易损坏色谱柱。
314 线性范围和检出限
用混合标准工作液配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0μg/mL五种浓度的混合标准液。将不同浓度的混合标准溶液在上述选定的色谱条件下分别进行测定,进样量均为10μL。以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。实验结果表明,土霉素、四环素和金霉素的质量浓度在0.1～2.0μg/mL范围内,浓度与其峰面积呈良好线性关系。取标准谱图中一段比较平稳的基线以3倍信噪比计算各组分的最低检出限。土霉素、四环素、金霉素的线性回归方程、相关系数及检出限见表1。土霉素、四环素、金霉素的标准色谱图见图1。
表1 线性回归方程、相关系数和检出限化合物回归方程
相关系数
(r)
检出限
(μg/kg)土霉素y=34516x-4565.20.99950.03
四环素y=20575x-5421.60.99970.05
金霉素y=10499x+125.70.99930.
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图1 土霉素、四环素、金霉素的标准色谱图
11 土霉素 21四环素 31金霉素
315 方法的精密度和准确度
精确吸取1.6μg/mL的混合标准液10μL,按2.3.2色谱条件平行测定5次,三种抗生素色谱峰的保留时间波动均小于0.1min,根据峰面积计算土霉素、四环素、金霉素的相对标准偏差RSD分别为
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3.02%、
4.82%、
5.93%,表明方法的精密度良好,实验结果准确可靠。
在未检出四环素族抗生素残留的猪肝样品中加入一定量的四环素族抗生素,按样品测定方法平行测定3次,由测定结果计算回收率,结果见表2。土霉素、四环素、金霉素的回收率均在83%～90%之间,说明方法的准确度良好。
表2 样品加标回收率
(n=3)
化合物样品含量
(μg/kg)
添加量
(μg/kg)
测定含量
(μg/kg)
回收率
(%)
土霉素0.0060054090
四环素0.0060053088
金霉素0.0060050083
4 结 论
本文建立了高效液相色谱法同时测定猪肝组织中土霉素、四环素和金霉素3种四环素族抗生素残留量的方法。实验结果表明,以0.01mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈(体积比70︰30)作为流动相,在p H =2.5的条件下,3种组分均可达到基线完全分离。此方法灵敏度高,稳定性好,检出限低,重现性好,操作简便易行。
参考文献
1 叶树德,高世年.食品中兽药残留卫生技术.天津:天津科学技术出版社,1998:319
2 吉彩霓,岳振峰,谢丽琪等.中国兽医科技,2005,35
(10):820-826
3 王蕾,张孝松,徐智秀等.色谱,2002,20(1):49-51
4 乔坤云.中国卫生检验杂志,2003,13(5):610-611
5 SN0179-1992.出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法.中华人民共和国进出口商品检验局
6 杨惠芬,李明元,沈文等.食品卫生理化检验标准手册.
北京:中国标准出版社,1997.267-268
7 陈毓芳.分析测试学报,2003,22(3):97-99
8 庞国芳,曹彦忠,张进杰等.分析测试学报,2005,24
(4):61-63
收稿日期:2008-10-10
HPLC determination of residues of oxytetracycline,tetracycline,and chlortetracycline in pig liver.L i n L i ng,Zhang Cheng hui,Cheng S heng hua,Zha Yubi n,Yang Chunli ang(A g ricult ure Prod ucts Processi ng Research I nstit ute,Chi nese A ca dem y of T ropical A g ricult ure S cience,Zhanj i ang,524001)
A sensitive met hod was established for simultaneously determining residues of oxytet racycline, tet racycline,and chlortetracycline in pig liver by solid p hase extraction2high performance liquid chromatograp hy.The experimental conditions were optimized.Under t he selected conditions,t he detection limit s were0.03mg/kg,0.05mg/kg,and0.07mg/kg for oxytet racycline,tet racycline,and chlortet racycline,respectively.The RSDs were3.02%～5.93%,and t he average recoveries were83%～90%.
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