重组质粒的转化14-3-24

一、连接产物的转化

（1）连接产物20μL（或重组质粒2μL）全量转化100ul感受态细菌，冰浴30min。

（2）42℃热休克90s（不要摇晃），再冰浴3分钟（或冷却5min）。

（3）每管加入900μL LB液体培养基，摇床培养1h，37℃，150r/min。

（4）取出离心6000r/min，离心3-5分钟,去上清，留100ul重悬涂布于含100μg/mL 氨苄青霉素的LB平板，室温放置20分钟后，倒置平板，37℃培养12h，观察结果。

二、SDS—PAGE 分析

（1）电泳槽的装配选择合适的玻璃片洗干净晾干，放入架子中，按要求装好模具。

（2）制备5mL12％的分离胶在干净的烧杯中依次加入去离子水1.6mL，30％丙烯酰胺 2.0mL，1.5 mol/L Tris-Cl ( PH 8.8) 1.3 mL , 10％

SDS 0.05mL， 10％过硫酸铵（PAGE，冰冻呈雪白色）0.05mL，TEMED 0.002mL，轻旋以充分混匀混合物，将混合物沿玻璃板倒入（用移1000μL的移液枪注入）胶槽中，至短玻璃板上缘约2cm处，加水以隔绝空气压平胶面。室温放置约

20-40min，待出现清晰地界面，说明分离胶已聚合好，用滤纸吸净覆盖液体（防止水的影响）。

（3）制备2mL5％的浓缩胶在干净的烧杯中依次加入去离子水1.4mL，30％丙烯酰胺0.33mL， 1.0mol/L Tris—Cl (PH 6.8) 0.25mL，10％SDS0.002mL，10％过硫酸铵0.002mL，TEMED 0.002mL( PH 8.8) 1.3 mL , 10％

SDS 0.05mL， 10％过硫酸铵0.05mL，TEMED 0.002mL，轻旋以充分混匀混合物，将混合物沿玻璃板滴入胶槽中，插入干净的梳子，室温放置约20-40min，待浓缩胶聚合好后，小心移出梳子。

（4）上样电泳取1mL菌液，在室温下以5000r/min离心5min，弃去上清，加入50μL 1×SDS样品处理液，重悬菌体，100℃加热裂解菌体5min，取15μL 上样。接通电源恒压电泳，在浓缩胶中电压为80V，时间20-30min，分离胶中电压为130V，时间30min。电泳结束后，卸板，切胶。置脱色液摇床上用考马斯亮蓝R-250染色液染色2h，取出凝胶，转入脱色液中。在脱色过程中，换液2到3次，直至背景无色。拍照并进行密度扫描，确定量。

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN ·研究报告· 2009年增刊 收稿日期:2009-04-29 基金项目:西安市科技局科技攻关项目(GG06078) 作者简介:陈洪栋(1986-),女,硕士研究生,研究方向:西北大学生命科学学院细胞生物学方向;E-mail:huijie1022110@https://www.wendangku.net/doc/082265598.html, 通讯作者:李红民,E-mail :lihm2006@https://www.wendangku.net/doc/082265598.html, 引言 质粒DNA 成功转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli )由Cohen 等首次报道[1].此后,多位研究者对 影响质粒转化E.coli 的条件如温度、离子强度和种类、质粒分子质量大小等进行了优化和改进[2] ,最 终形成一致认可的转化程序:. 细胞与DNA 在 氯化钙存在下于0~4℃作用一定时间后于42℃短暂热激2~3min,冰浴2~3min ,随后在不含抗生素 的液体培养基中于37℃恢复培养30~60min 后涂 布选择性平板[3]。该方法被称为是E.coli 细胞的标准转化方法,在世界范围内的分子生物学实验室中 广泛应用并不断被完善,最高转化效率可达107~ 109克隆/μg 质粒DNA [4]。然而,利用该方法完成质粒DNA 对大肠杆菌的转化,至少需要约2.5h ,对于一般的质粒转化实验而言,比较费时费力。文章作者尝试对这一标准转化程序进行简化,获得一种用质粒DNA 转化大肠杆菌感受态细胞的 实用操作技巧 陈洪栋董文博李红民 （西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室植物生物技术研究室西北大学生命科学学院，西安710069） 摘要:目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA 转化大肠杆菌的操作方法。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。 以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth 和植物双元表达载体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1。质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后，直接涂布含有筛选抗生素的LB 平板，于37℃培养12~16h 。结果表明，用不同大小的质粒DNA 转化不同的大肠杆菌菌株，都可以获得满足实验要求，转化效率可高达103~4阳性克隆/μg 。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。 关键词：Escherichia coli 转化方法质粒 Doohickey for the Standard Transformation Protocol of Plasmids DNA Transfer into Competent Chen Hongdong Dong Wenbo Li Hongmin (Plant Biotechnology Research Unit,Key Laboratory of Resource Biology Biotechnology in Western China,Ministry of Education School of Life Science Northwest University,Xi ’an 710069) Abstract: The aim of this study was to introduce a doohickey for the transformation of competent cells with plasmid DNA. The competent cells of Escherichia coli strains were previously made using the calcium chloride method.The plasmids,pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth and pCAMBIA1301,were employed to transform the different E.coli strains Top10,DH5α,BL21(DE3)and TB1.The mixture of plasmid and competent cell was laid on ice for definite time before being cultured at 37℃degree on selected LB plate with relevant antibiotic for 12~16h.Perfect transformation rate up to 103~4colonies/μg plasmid DNA was obtained. Key words:Escherichia coli Transformation method Plasmid

重组质粒的构建与转化

实验目的 1. 学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。 3. 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl 2制备感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。 6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7. 学习并掌握使用Omaga 试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切 方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分 子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶

切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的 因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进 行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0 μg的DNA 分子时，反应体积约为15~20 μg，DNA 的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解1μg 的pBR322 DNA 分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应 总体积的10% 。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% 甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5% ，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA 的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA 片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA 和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3 ）之间，可以有效地解决DNA 多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h 。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化

重组质粒的构建经验 [技巧]

重组质粒的构建经验 [技巧] 重组质粒的构建经验~~~ 昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

完整word版重组质粒的构建转化筛选和鉴定

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定 实验目的： 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl 感受态细胞的方法。2 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。 7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。 实验原理： 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切连接导入感受态细胞中，将DNA分子限制性内切酶起来。将重组质粒的载体分子和外源选择性培养基互补筛选法酶切筛选出重组子，并可通过中培养，可以通过转化后的细胞在α电泳PCR检验的方法进行重组子的鉴定。及1.重组子的构建 酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最“先限制性内切酶在使用时应遵循在双酶切体系中，主要的因素是反应温度和缓冲液的组成， 低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。 （要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。） 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5'-磷酸和3'-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。 2.感受态细胞的制备及质粒转化 构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA

构建重组质粒基本方法

构建重组质粒基本方法 1.cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul ×2 模版 1 5‘引物 1 3‘引物 1 dNTP 1 10×buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2．PCR产物纯化 1、加5倍体积的PB 2、将Spin柱放于2ml收集管上 3、加样液，14Krpm，离心1min 4、弃去排出液 5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 3．双酶切 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）： 4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）

2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解 3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4.加样液，14Krpm，离心1min 5.弃去排出液 6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 7.弃去排出液,14Krpm,离心1min 8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 5．连接 上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下： 载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6．转化 取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。 7．菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将 细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒

氯化钙法质粒转化

氯化钙法进行质粒转化 利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。 仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴 药品试剂： 0.1 M CaCl2置冰浴中 2 M glucose： 取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。 2 M Mg2+： 取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4. SOB 液体培养基： 32 Methods in Biotechnology Vol 1 2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM. SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM. SOC/Amp 固体培养基： SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin. SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。 大肠杆菌菌株：JM109 #1~#5 接合反应液 方法步骤： 1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。 2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计 3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min. 4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

重组质粒的构建

重组质粒构建 生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切 为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。） 双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。） 二、连接反应 载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。 载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。 三、质粒转化到感受态大肠杆菌中 从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养

重组质粒的连接转化及筛选解析

第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接 酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合 的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子 则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现 象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α- 互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可 用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。 5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml， 然后摇匀后涂板。

20170803 热激法转化质粒

20170803 热激法转化质粒 武汉大学Angelo 实验原理： 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。热激法：大肠杆菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，与转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子 实验步骤： （1）从-80 ℃冰箱内取一管冻存的感受态大肠杆菌DH-5α于冰浴上融化复苏10min； （2）加入待转化的质粒0.5μL-1.5μL，轻轻吹打混匀，冰浴30 min； （3）在42 ℃恒温水浴锅中严格操作热激90 s，然后立即冰浴静置2 min； （4）在无菌操作台内，向感受态大肠杆菌中加入600 μL-1000μLLB液体培养基，在200 r/min 、37 ℃恒温摇床内摇30min-1 h 进行活化；

（5）在活化的时候，从4℃拿出含抗生素的固体细菌培养板放到37℃恒温培养箱中回温十分钟。 （6）活化结束后，在无菌操作台内，吸取菌液20μL-40μL涂板到含抗生素（50 mg/ml）的固体细菌培养板上； （7）置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养（12h-16h）。 要点： 1，固体培养板的抗生素抗性（Amp，Kana） 2，转化质粒的量根据质粒浓度进行添加 3，涂板菌液的量根据活化加培养基的量进行选择 4，注意每项工作前都要进行充分准备，比如涂板棒进行灭菌，移液枪进行消毒等。 5，对刚连接的质粒进行转化，不同之处在于活化时间为1-2h。 活化后，将菌液2500 -3500rpm离心3 min，留下沉淀和200 μL菌液，充分混匀，涂板到含抗生素的固体培养基上。

质粒的酶切、连接、与转化

质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常

重组质粒的构建与转化

实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶

切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化

构建质粒经验

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。 在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。这作的经验积累与心得。所涉及内容如下： 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题 以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII 为例。 2 设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。如NdeI就属这类。 下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数： NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4 XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4

案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。大家引以为戒啊。 现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。 二、载体酶切的问题 1单切鉴定。这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。 2 质粒双切后对照连接。实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。 案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。 案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了! 两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。 三、连接时两片段浓度比问题 一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤 【原理】 转化是将外源DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制- 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R- ，M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA 分子的细胞）。 本实验采用CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0 ～4 ℃，CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA 形成抗DNA 酶的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃90 秒热激处理，促进细胞吸收DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将人Bcl-2 重组质粒转化DH5 α扩增菌，转化后在含Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 含人Bcl-2 重组质粒的DH5 α菌用于质粒DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA 。 【试剂与器材】 1 ．LB 液体培养基10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10gNaCl 加水至1L ，高压灭菌消毒。 2 ．LB 固体培养基LB 液体培养基中加1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。 3 ．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml 溶液，置-20 ℃保存。 5 ．人Bcl-2 重组质粒它是Eco R Ⅰ单酶切的pBluescript ⅡKS(-) 载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用Eco R Ⅰ酶切则应到空载pBluescript ⅡKS(-) 载体(2.96kb) 和人Bcl-2 cDNA 片段(1.9kb) 。配制成2g/1 μl 。 6 ．大肠杆菌DH5 α此为DNA 扩增菌 7 ．恒温水浴箱