L、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质
RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合
1.将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。
2.全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。
3.将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100μl 的小管置于BIAcore自动进样器架的适当位置。
4.将一个空管置于BIAcore自动进样器架上。
5.开动仪器,以5μl/min的流速流过一个流动池。
6.将75μl的NHS加入到一个空管中。
7.在同一个管中再加入75μl的EDC。
8.将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。
9.注射35μl NHS/EDC混合物使表面活化。
10.(放置一个基线报道点)注射35μlRAM Fc到活化表面与抗体结合。
11.注射35μl乙醇胺使过量的反应基团失活。
12.快速注射10μl的20 mmol/L HCL,然后用Extraclean除去非共价结合型材料。
13.通过在开始注射RAMc前放置一个基线报道点,并在注射20 mmol/L HCl 结束后2 min放置第二个报道点,来测定结合RAMc水平。
14.关闭流动液,关闭命令窗口,保存报道文件。
检测抗-TSH与RAMc表面的结合
15.开动仪器,使含有结合RAMc的流动池流速为10μl/min。
16.注射10μl的2μg/ml抗-TSH。
17.快速注射10μl的20mmol/L HCl,然后用Extraclean再生RAMc表面。
18.为了测定结合到RAMc表面的重现性,用可以与抗TSH结合引起250 Rus 所需的体积重复注射抗TSH。
19.快速注射10μl的20 mmol/L HCl,然后用Extraclean再生RAMc表面。
20.关闭流动液体,关闭命令窗口,保存报道文件。
检测TSH与捕获抗-TSH表面的结合
21.开动仪器,使含有结合RAMc的流动池的流速为10μl/min。
22.注射10μl的2μg/ml抗-TSH。
23.注射25μl的200 nmol/L TSH,限定120 s的解离时间。
24.快速注射10μl的20 mmol/L HCl,然后用Extraclean再生RAMc表面。
25.关闭流动流,关闭命令窗口,保存报道文件。
四、实验步骤
1、preconcentration (预结合试验)由于芯片表面带有负电,因此要偶联到芯片上的分子必须带上正电,才有利于分子吸附到芯片表面,以利于共价偶联反应的完成。预结合实验就是将样品溶解在不同PH值的缓冲液中,使其带上不同量的电荷。然后,将样品流过芯片表面,观察它与芯片的结合曲线,就可判断出合适的条件。如下图:两种不同条件下的吸附实验,第一个峰表明在该条件下,吸附很快达到饱和,这样吸附的量有限,第二种一直呈上升趋势,有利于在芯片上偶联较多的蛋白。实际工作中,还会碰到各种不同的吸附曲线,需要根据实际情况来判断最佳条件。将抗体用不同PH值的buffer稀释10-40倍,以5μl/m
的流速流过芯片表面,观察抗体与芯片的吸附结果。
2、偶联
a)取100μlNHS和100微升EDC混合,12000rpm离心5分钟;
b)取一定体积的偶联蛋白,按预结合的比例稀释,稀释后需要150μl,取100μl ethanolamine HCL。以上试剂平衡到室温25摄氏度左右,高速离心五分钟;
c)将上述三种试剂放在样品架上,设定加样流速为10μl/min ,inject方式进样,NHS/EDC,样品,ethanolamine-HCl分别上样100,100,和60μl。
d)结束即可得到类似下图的曲线。
3、结合
将抗原用合适的缓冲液稀释成适当浓度,离心后上样,观察抗原抗体结合过程。如果需要测量不同条件下的结合状况,可以在一次进样结束之后,对芯片进行再生。然后再上下一个样品。
4、芯片再生
抗原抗体结合的再生条件比较简单,简单地用PH2.5的10mMglycine冲洗就可以了。但实际工作中,如果偶联的是蛋白,往往情况要复杂得多。首先,再生条件要能将结合物从芯片上去掉,其次不能让结合在芯片上的蛋白变性失活。因为,万一所选条件使芯片上偶联的蛋白失活,这个通道就意味着报废。所以,芯片的再生是所有用户面临的一个比较头疼的问题。芯片再生要求再生之后,不仅要求基线要能回复到初始值,还要求再上相同的样品,结合能力不会出现明显下降。
5、如果需要得到结合与解离的动力学常数,至少需要进行五组不同浓度的结合实验。
6、分析实验结果,打印实验报告。
7、仪器维护,实验完毕,running buffer换成过滤并脱气的超纯水或HEPES缓冲液。芯片更换为维护芯片,进行至少两遍prime后,运行standby。收拾整理实验场所。