大鼠脊髓损伤后碱性成纤维细胞生长因子的变化
大鼠脊髓损伤后碱性成纤维细胞生长因子的变化
2009-12-16
常楚 王星铎 吕刚 原银栋 朱悦
笔者利用免疫组织化学染色及图像分析技术，研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)在大鼠脊髓中的分布及其在脊髓损伤后的变化，为进一步探讨bFGF在脊髓损伤(spinal cord injury， SCI)后的治疗作用提供一定的理论和实验基础。
一、材料与方法
1.实验动物和取材方法：Wister大鼠24只，体重180～220g，雌雄不限，随机分成四组：正常组、伤后2天组、5天组、12天组，每组6只。损伤组大鼠以1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，暴露T8脊髓，以锐刀片横行切叮瞥杉顾韬岫仙硕锬P汀：各组物于取材日期重新麻醉，以1%多聚甲醛灌流固定，分别取出损伤上、下距断端0.4～0.7cm两段脊髓，液氮速 冻后连续冰冻切片(20μm)，以备HE及免疫组化染色。
2.免疫组织化学染色：采用链菌素亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法免疫组化染色，bFGF单克隆抗体为抗人工重组单克隆抗体，由日本金泽医科大学生化Ⅱ教室提供。试剂盒由ZYZED公司生产。主要步骤如下：切片在50mmol/L Tris-HCL buffer pH7.4)中过夜，以0.5% Trtion x-100/DBS通透细胞膜，再以0.1% Tripsin/Tris-HCL消化抗原，用3%H2O2/甲醛灭活内源性过氧化物酶，10%HS抑制非特异性吸收，bFGF(4.1μg/ml)单抗中孵育1小时，加第二抗体及SP液各30分钟，DAB显色，苏木素复染。
3.判定标准及统计分析：应用日本产Luzex-F型彩色图谱分析仪，以细胞内呈棕黄色颗粒者为阳性，对各组切片单位面积阳性细胞数及阳性细胞灰度进行定量分析。各组数据用SPSS/PC+软件包进行方差分析及组间比较。
二、结果
1.SCI后组织病理学改变：脊髓损伤后2天，灰、白质中出现片状出血，神经轴索肿胀，髓鞘破裂，神经细胞坏死。此种病理改变随距损伤处距离的延长而逐渐减轻，蔓延至距损伤处0.4～0.5cm处。损伤后5天，损伤坏死区有胶质细胞、内皮细胞、淋巴细胞增生，伤后12天增生更加明显。
2.bFGF在正常脊髓中的分布及其在SCI后的变化：bFGF定位于灰质中星形细胞核和一些灰质神经元胞浆中。脊髓损伤后含bFGF的星形细胞比正常时明显增多，而且着色明显加深。含bFGF的细胞数及阳性细胞灰度各组间比较如附表。从表看出，表达bFGF的细胞在SCI后明显增多(P<0.01)，并随伤后时间的延长进行性增多(P<0.01)，灰度值逐渐减小也就是说阳性细胞bFGF的含量随伤后时间的延长进行性增高。
附表 各组间含bFGF细胞数及阳性
细胞灰度比较
组别 阳性细胞数 细胞灰度 P值
正常组 6.3±0.6 125.9±7.3 <0.01
伤后2天组 10.8±0.5 8
8.0±4.8 <0.01
伤后5天组 13.5±0.7 74.8±6.2 <0.01
伤后12天组 16.0±1.4 67.2±5.8 <0.01
三、讨论
本实验显示，bFGF存在于灰质星形细胞核及一些灰质神经元胞浆中。此结果与文献报道一致。实验结果表明，灰质中含bFGF的细胞数及细胞中bFGF的含量在SCI后进行性增高，说明增多的bFGF可能对SCI后的神经保护及再生起重要作用。这种因损伤而触发神经细胞选择性地合成再生急需蛋白的机制正为人们所认识，一般认为是电、神经肽、递质、损伤等生理和病理刺激激活早反应基因所致。本实验显示bFGF在SCI后呈进行性增高样改变，与Koshinaga报告的bFGF伤后5天开始增高、伤后5天与伤后12天无明显差异的变化规律不完全一致［1］，产生这种差异的原因可能是采用的动物损伤模型不同引起的。本实验中的脊髓横断伤模型比Koshinaga采用的光化学损伤模型损伤严重，反应剧烈，胶质细胞增生明显。所以有人认为，早反应基因一旦活化，其反应程序与刺激强度和作用时间呈平行关系。本实验中可以明确看到SCI后胶质细胞增生。Finklestain［1］在研究脑损伤后bFGF的变化时也观察到胶质细胞增生，并认为这与bFGF增多有关。过去认为胶质细胞增生是轴突再生的障碍，随着认识的不断深入，人们倾向于认为胶质增殖可能是一种保护机制，它可以防止损伤的脊髓进一步溃保星形细胞有引导神经元迁移到目的地的作用。适当增殖有利于再生轴突的生长与延伸［2］，过度增殖所形成的瘢痕则阻碍再生轴突的生长和延桑理地控制其增殖程度是今后需要解决的问题。
bFGF在SCI后呈持续性增高这一结果表明，SCI后出现损害因素的同时，也有自身保护机制在起作用。受损伤的神经元或者变性坏死，或者存活再生，这取决于损害因素与保护作用之间的平衡。体外实验已证明，bFGF可促进神经元的存活与再生，改变一些神经递质的合成，拮抗兴奋性氨基酸对神经元的毒害作用［3］。笔者认为bFGF在SCI后也可能起这些作用。
作者单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院骨科
参 考 文 献
1 Finklestain SP. Increased basic fibroblast growth factor (bFGF) immunoreactivity at the site of focal brain wounds. Brain Research， 1988， 460∶253-259.
2 郭畹华.胶质细胞与神经再生.解剖学报， 1993， 24∶424.
3 Hatten M. In Vitro neurite extension by granule neurons is dependent upon astroglica-derived fibroblast growth factor. Dev Biol， 1988， 125∶280-289.