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鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定 (2)

鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

（河北大学生命科学学院2012级生物工程，河北保定，071000 ）

摘要：目的掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握离心机、分光光度计、

核酸蛋白检测仪、电泳仪等实验仪器的使用。方法先通过三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的杂蛋白，后经等电点沉淀得到类粘蛋白的粗品;然后经过层析柱的装柱，平衡，上样，洗脱，再平衡等步骤实现对类粘蛋白的纯化;下一步，用BAEE法对类粘蛋白活性进行测定，得到类粘蛋白对胰蛋白酶的抑制活性；最后，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及分子量。结果通过本实验的学习得出类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。结论试验所述方法为一种较好的提纯鸡卵类黏蛋白的方法。

关键词：鸡卵类粘蛋白纯化胰蛋白酶分子量抑制剂

中图分类号：Q5-33文献标志码：A

The purification and activity and molecular weight determination of CHOM

College of Life Hebei University 2009 Bioengineering, Hebei Baoding ,071002

Abstract: Objective The main purpose of learning this experiment is master the technology of protein extraction, isolation, purification and properties mensuration, Master the usage of centrifuge, spectrophotometer, nucleic acidprotein detector, electrophoresis apparatus and so on.Methods First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA – acetone, then get the rough protein by isoelectric precipitation.Then after chromatography column packing column, balance, Sample , elution, rebalance etc to achieve the purification of chicken ovomucoid. Next, use BAEE method to determine the vitality of chicken ovomucoid, get inhibitory activity from chicken ovomucoid with respect to trypsin. Finally, through SDS-page polyacrylamide gel electrophoresis to determine the purity and molecular weight of chicken ovomucoid.Result Through the experiment, we conclud that chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Use this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin, so can calculating the vitality of chicken ovomucoid.Conclusion Experimental methods described is a good method for purification of chicken ovomucoid.

Key words：chicken ovomucoid purification trypsin molecular weight inhibitors

鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid 简称CHOM）是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，在电泳行为上常出现不均一性，这主要与糖蛋白的分子量不均一性有关。鸡卵类粘蛋白具有强烈抑制胰蛋白酶的作用，是胰蛋白酶的天然抑制剂，胰蛋白酶抑制剂是一类具有胰蛋白酶抑制作用的物质，该类物质的来源不同 ,其活性

和作用的酶也不同，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究[1]。另外对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。另外,蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育，近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用[2]。CHOM 在中性和偏酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度，但在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。由于CHOM在PH7.8～8.0的碱性条件下具有很强的结合胰蛋白酶的活性而且这种结合是可逆的，可以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。

一．材料与试剂

仪器：紫外分光光度计电泳仪摇床离心机核酸蛋白检测仪透析袋铁架台层析柱恒温水浴锅电磁炉 4℃冰箱微量取液器

材料与试剂：鸡蛋, 0.5mol/L三氯乙酸, 丙酮, 0.2mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液, 0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液,DEAE-纤维素, 0.30mol/L氯化钠-0.02M 1.0mol/L氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液0.5mol/L PH8.0 Tris-Hcl, BAEE-0.05mol/L, 胰蛋白酶 BSA Marker 0.05%考马斯亮蓝R250染色液7%乙酸

二．方法

2.1 粗品的制备

1.取一枚鸡蛋的蛋清32mL于250mL的烧杯中，放入25℃- 30℃水浴锅中。

2.分别取4℃预冷的三氯乙酸6.4mL 和丙酮溶液25.6mL,并将其混合放于烧杯中。

3.在不断搅拌蛋清的情况下将混合液缓慢加入到蛋清中，测其PH为6.1，再用7.0mL三氯乙酸调PH 到3.3，继续搅拌30min，4℃下放置1h，4000r/min离心20min，得上清液39.0mL.

4.边搅拌边加入4倍于上清液体积的冷丙酮，4℃过夜。

5.4000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用2mL无离子水溶解。

6.取一新的透析袋，先用自来水洗，再用无离子水洗，然后煮沸15min，取出后先要试漏，然后将上面溶解好的沉淀装入透析袋透析1周。

2.2 蛋白纯化

1.样品的处理：从透析袋中取出样品后测体积为15.2mL，加入1.5mL的0.2M PH6.5的磷酸盐缓冲液溶解样品，4000r/min离心20min，取上清液侧体积为15mL，即为上样样品。

2.装柱：将层析柱垂直安装在铁架台上，打开核酸蛋白检测仪，将柱下端的硅胶管接在核酸蛋白检测仪的样品池的入口。先加入1/2-2/3柱体积的水对柱进行试漏，然后加入1/2-2/3柱体积的水，取一玻璃漏斗，使漏斗安装在柱的上端并使漏斗的外径与柱的内径吻合，避免液体溢出。将DEAE-纤维素倒入漏斗内并不断搅拌，使之自然沉降到3/4柱高。测得柱高为1

3.3cm。

3.平衡：取10mL 0.2M PH6.5的磷酸盐缓冲液稀释到100mL制的0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液，由于柱的直径为1cm，取5倍于柱床体积的0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液52.2mL平衡，平衡时需缓慢加入，保持柱床表面的平整，并调节流速大约为2mL/min。

4.上样：取2mLCHOM粗品，缓慢加入。

5.洗脱：洗脱开始时要记录时间并记录A280的值，当A280的值大于10时开始收集样品。

①取3倍于柱床体积的0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液31.3mL洗脱，由于A280的值都小于10，固没有

收集到样品。

②取0.3M Nacl-0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集样品。

③取1M Nacl-0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集样品。

④取0.02M PH6.5的磷酸盐缓冲液平衡。

6.将②中收集到的样品装入透析袋中，用蔗糖进行透析，浓缩样品。

2.3 粘蛋白活性测定

1.取0.05M PH8.0 Tris-Hcl溶液3mL作为空白对照放于石英比色皿中。

2.取预热好的BAEE2.9mL放于另一个石英比色皿中，在253nm下测定起始值

3.480。

3.在(2)中的比色皿中加入100uL预热好的胰蛋白酶，迅速颠倒混匀，再放入仪器中，每隔30s读A253的值并记录，计时5min，并计算胰蛋白酶的活性。

4.取预热好的胰蛋白酶和纯化的粘蛋白各100uL，放到管里面， 30℃下保温10min，然后取BAEE2.8mL 放于石英比色皿中，先在253nm下测定起始值为3.727。

5.在(4)中的比色皿中加入预热好的胰蛋白酶和粘蛋白的混合物，迅速颠倒混匀，再放入仪器中，每隔30s读A253的值并记录，计时5min，并计算纯品抑制后的胰蛋白酶的活性。

6.计算粘蛋白的抑制活性(U/mL)。

2.4 SDS-PAGE检测CHOM的纯度及分子量

总体积30%胶母液ph8.7缓冲液无离子水10%APS

7mL 2.3mL 1.75mL 2.95mL 60uL

表1 10%分离胶制备

总体积30%胶母液ph6.7缓冲液无离子水10%APS

表2 3.6%浓缩胶制备

3.样品的稀释：取5uL粗制粘蛋白与45uL水混匀，记作C1；粗制粘蛋白记作C；纯化的粘蛋白记作P。

4.制备样品：①取50uL稀释后的粗制粘蛋白与50uL上样液混匀，煮沸5min。②取30uL粗制粘蛋白与30uL上样液混匀，煮沸5min。③取30uL纯化的粘蛋白与30uL上样液混匀，煮沸5min。④取10uLBSA 与10uL上样液混匀，煮沸5min。

5.先加电泳液使其没过矮板，再将已灌好胶的电泳仪上的梳子小心拔出，以除去气泡。用微量取液器在样品井中加样品。加样顺序如下表：

样品# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

样品 C C C1 C1 BSA Marker P P P P

样品 5 10 15 20 10 20 5 10 15 20

量

表3 点样顺序及点样量

6.电压：打开电泳仪的电源，用电极线将电泳槽和电泳仪连接，并使红色接正极，黑色接负极，调浓缩压为150V，开始电泳，等样品进入分离胶时调电压为200V，继续电泳，直至溴酚蓝距分离胶底部1cm 时，停止电泳。从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，将凝胶放入平皿中。电极液按要求回收，将电泳槽洗干净放回原处。

7.染色：将考马斯亮蓝R250染色液加入平皿，以没过凝胶为宜，脱色摇床旋转染色10min，用滴管将染色液回收到试剂瓶中。

8.脱色：先用水洗去凝胶表面的浮色，再加入脱色液，脱色摇床脱色至凝胶背景的蓝色脱去。脱色完成后对蛋白质的迁移率进行测量并且扫描。

三结果

3.1 蛋白纯化结果

1.样品处理后经一系列提取粗品方法（等点沉淀法，透析法），最后共获得黏蛋白粗品6.2mL。

2.洗脱中峰值为78nm。

粘蛋白纯品洗脱

时间A280 时间A280 时间A280 0:00:00 1 0:24:00 60 0:48:00 44

0:03:00 22 0:27:00 74 0:52:00 18

0:06:00 45 0:30:00 76 0:55:00 12

0:09:00 9 0:33:00 78 0:58:00 5

0:12:00 2 0:36:00 72 1:02:00 2

0:15:00 0 0:39:00 65 1:05:00 3

0:18:00 1 0:42:00 60 1:08:00 3

0:21:00 2 0:45:00 45 1:12:00 2

表4粘蛋白纯品洗脱时间及值

图1 3.2 粘蛋白活性测定结果

时间（s）

样品的A253值

胰蛋白酶

加入CHOM粗品的胰蛋

白酶

加入CHOM纯品的胰蛋

白酶

0 30 60 90 120 150 1800.272

0.303

0.386

0.411

0.396

0.470

0.418

0.081

0.059

0.087

0.133

0.171

0.183

0.230

-0.014

0.004

0.021

0.012

0.040

0.054

0.078

表5胰蛋白酶活性测定表

酶活力单位（BAEE单位）= 0.0017*60/0.001=102U

比活力=BAEE单位/毫克蛋白质=102/0.5=204U

CHOM粗品抑制活力计算：

黏蛋白粗品的抑制活力(U) =胰蛋白酶活力(U)－粗品抑制后的剩余活力(U)= 36U 纯品抑制活力计算

黏蛋白纯品的抑制活力(U)=胰蛋白酶活力(U)－纯品抑制后的剩余活力(U)=66U 根据数据做下图：

图3 图4

根据图2 得下表7数据

表6 粗品与纯品总数据

3.3 鸡卵类粘蛋白的相对分子质量测定

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

图5 SDS-PAGE检测粘蛋白的分子量的电泳结果

相对迁移

率0.1833 0.2667 0.3667 0.5667 0.8000 0.9000

标准蛋白

质的相对

分子质量

的对数 4.988559 4.820858 4.633468 4.491362 4.303196 4.158362

表7 相对迁移率测定结果

图6

粗品的鸡卵黏蛋白的相对分子质量是25118

纯品的鸡卵黏蛋白的相对分子质量是39810

四讨论

1.取鸡蛋清时应注意不要取出蛋黄。

2.每一步要详细记录实验数据以及各步骤必要的时间，对于较多的试剂应事先做好分类，明确每一步应该加入的试剂及试剂量，防止加错试剂对实验造成的影响。

3.做蛋白质纯化实验时，由于步骤较多应做好人员的分配和分工，洗脱平衡过程中，要观察数值的变化记录始末过程，观察峰值以便进行洗脱液的收集，此步骤是实验的关键。能否成功将影响后边SDS-PAGE测定CHOM的分子量。

4.用BAEE法测定CHOM的活性，应注意样品的预热以及预热的时间。使用分光光度计应注意分光光度计的调零，以及调零后应重新计时5min,本组就是因为因为调零后直接读数而少测得两个实验数据。

5.SDS-PAGE电泳时，剥胶时应该注意胶的脱落，防止破碎。

6.由于本实验需要经过蛋白质的粗提，蛋白质的纯化，BAEE法测活性以及SDS-PAGE测定分子量等，综合性较强且时间较长，操作方法复杂，以及使用仪器较多，要做好每次实验前的预习，操作应该谨慎小心。同时本实验需要各组员的相互配合，只有团队的相互合作才能更好的完成实验。

参考文献

[1]蔡祖花;王凤山;张天民; 胰蛋白酶抑制剂的临床研究概况[J]. 中国生化药物杂志 2000年03期

[2]柳武革; 薛庆中; 蛋白酶抑制剂及其在抗虫基因工程中的应用[J]. 生物技术通报 2000年01期

[3] 武金霞、周艳芬、张贺迎等.蛋白质免疫印迹技术.生物化学实验教程.科学出版社.2012.172-178.

鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化

鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，EC3.4.21.4。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。并设计了酶活性测定以对纯化过程进行监测和对纯化效果进行评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋白酶进行纯度和分子量的测定。关键词：鸡卵粘蛋白；胰蛋白酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。鸡卵粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的一种糖蛋白，至今还未能获得单一组分，在电泳行为上常呈现不均一性。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差别，鸡卵类蛋白N-末端基为丙氨酸。卵类粘蛋白在中性活酸性溶液中对热和高浓度的脲是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其温度较高是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度。它们的等电点有一定的范围，大致在3.9—4.5之间。鸡卵粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用，因此常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋白酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋白酶进行分离纯化。 1材料与方法 1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（ SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离子交换纤维素，离子交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋白酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-二氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，无水氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0乙酸酸化水，2.5mol/L H2S0 4 （ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/L PH2.5甲酸溶液）等。 1.2主要仪器与设备 DELTA320型酸度计，离心机，磁力加热搅拌器，恒流泵，紫外检测仪，N2000生化工作站软件，?16×400mm 层析柱，电脑，布氏漏斗、抽滤瓶，循环水真空泵，?10×200mm 层析柱，紫外可见扫描分光光度计，微量可调取液器，石英比色皿（d=1cm），恒温摇床，紫外分光光度计，循环水真空泵，DS型高速组织捣碎机，电子天平，精密试纸

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2018西综考研名词解释：粘液样变性 16. 粘液样变性(mucoid degeneration)：是指间质内有粘多糖(透明脂酸等)和蛋白质的蓄积。常见于间叶组织肿瘤、风湿病、动脉粥样硬化和营养不良时的骨髓和脂肪组织等。镜下：间质疏松，有多突起的星芒状纤维细胞散在于灰蓝色粘液样的基质中。 17.病理性色素沉着(pathologic pigmentation)：有色物质(色素)在细胞内外的异常蓄积称为病理性色素沉着。 18.脂褐素(lipofuscin)：是蓄积于胞浆内的黄褐色的微细颗粒，电镜下显示为自噬溶酶体内未被消化的细胞器碎片残体，其中50%为脂质。附睾管上皮细胞、睾丸间质细胞和神经节细胞的胞浆内正常时便含有脂褐素。 19.病理性钙化(pathologic calcification)：在骨和牙齿以外的软组织内有固体钙盐(主要是磷酸钙和碳酸钙)的沉积称为病理性钙化。 20.营养不良性钙化(dystrophic calcification)：继发于局部变性、坏死组织或其他异物(如血栓、死亡的寄生虫卵)内的钙化，称为营养不良性钙化。营养不良性钙化体内钙磷代谢正常。 21.转移性钙化(metastatic calcification)：由于钙磷代谢障碍(高血钙)所致正常肾小管、肺泡壁、胃粘膜等处的多发性钙化，称为转移性钙化，可影响细胞、组织的功能。甲状旁腺功能亢进、骨肿瘤破坏骨组织、维生素D过量摄入等可引发高钙，导致转移性钙化。 22.坏死(necrosis)：是活体内范围不等的局部细胞死亡，死亡细胞的质膜(细胞膜、细胞器膜等)崩解、结构自溶(坏死细胞被自身的溶酶体酶消化)并引发急性炎症反应。 23.核固缩(pyknosis)：表现为核缩小、凝聚，呈深蓝染，提示DNA停止转录。 24.核碎裂(karyorrhexis)：表现为染色质崩解成致密蓝染的碎屑，散在于胞浆中，核膜溶解。 25. 核溶解(karyolysis)：染色质中的DNA和核蛋白被DNA酶和蛋白酶分解，核淡染，只见或不见核的轮廓。 26. 凝固性坏死(coagulative necrosis)：坏死的细胞的蛋白质凝固，还常保持其轮廓残影。这可能是由于死死局部的酸中毒使坏死细胞的结构蛋白和酶蛋白变性，封闭了蛋白质的溶解过程。凝固性坏死好发于心肌、肝、脾、肾等。 27. 干酪性坏死(casepis necrosis)：是彻底的凝固性坏死，是结核病的特征性病变。镜下：不见坏死部位原有组织结构的残影，甚至不见核碎屑，肉眼观：坏死呈白色或微黄，细腻，形似奶酪，因而得名。 28. 坏疽(gangrene)：是身体内直接或间接地与外界大气相通部位的较大范围坏死，并因有腐败菌生长而继发腐败。坏疽分为干性、湿性和气性三种。 29. 液化性坏死(liquefactive necrosis)：是坏死组织因酶性分解而变为液态。最常发生于含可凝固的蛋白少和脂质多的脑和脊髓，又称为软化(malacia)。化脓、脂肪坏死和由细胞水肿发展而来的溶解性坏死(lytic necrosis)都属于液化性坏死。 30. 纤维素性样坏死(fibrinoid necrosis)：曾称为纤维素样变性。发生于结缔组织和血管壁，是变态反应性结缔组织病(风湿病、类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮、结节性多动脉火等)和急进性高血压的特征性病变。镜下，坏死组织成细丝、颗粒状的红染的纤维素(纤维蛋白)样，聚集成片块。纤维素样坏死物质可能是肿胀、崩解的胶原纤维(由于抗原-抗体复合物引发)，或是沉积于结缔组织中的免疫球蛋白，也可能是由血液中渗出的纤维蛋白原转变成的纤维素。

DNA与蛋白质分离与鉴定巩固习题

DNA与蛋白质分离鉴定巩固练习姓名：_______________ 学号：________ 成绩：________________ 一、选择题。 1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是 ( ) A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的升高而增大 B.DNA对洗涤剂的耐受性差，对高温的耐受性强 C.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色 D.可以选择新鲜的猪血、花椰菜等作为实验材料 2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些物质溶于酒精溶液。下图为“DNA的粗提取”实验的相关操作步骤，其操作目的错误的是（） A.①是洗涤红细胞、去除红细胞表面的杂质 B.②是稀释NaCl溶液至0.14mol/L，析出DNA C.③是选用2mol/LNaCl溶液，溶解粘稠物中的DNA D.④是纯化DNA，去除溶于95%酒精的杂质 3.在利用洋葱进行DNA粗提取的实验中，加入洗涤剂和食盐的作用分别是 ( ) A.破坏细胞壁；溶解DNA B.破坏细胞膜；溶解DNA C.破坏细胞壁；溶解蛋白质 D.破坏细胞膜；溶解蛋白质 4.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是 ( ) A.析出DNA时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水 B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐 C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色 D.将含有DNA的滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质 5.去除DNA杂质时，可直接在滤液中加入（），反应10－15min A.嫩肉粉 B.蒸馏水 C.2mol/lNaCl D.酒精 6.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（） A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出 7.下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（） A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，发出DNA等核物质 B.搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C.在析出DNA粘稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多 D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 8.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（） A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质 D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯 9.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理与方法的叙述，错误的是 ( ) A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随着溶液浓度的减小而减小 B.向鸡血细胞中加入蒸馏水的目的是使其吸水涨破，释放出其中的DNA C.向滤液中加入冷却的酒精的目的是除去DNA中的杂质，纯化DNA D.向初步纯化的DNA中加入二苯胺溶液，沸水浴后可观察到溶液显蓝色 10.与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 ( ) A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白的初步研究

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白 2 摘要：鸡蛋清原液用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液稀释5倍，4℃下静置至少6 h，采用30%～80%不同饱和度的硫酸铵分离卵白蛋白，采用Bradford法测定盐析后蛋白含量，SDS-PAGE检测其纯度，结果表明，60%饱和度的硫酸铵分离鸡蛋清卵白蛋白效果较好。关键词：盐析法；鸡蛋清；卵白蛋白鸡蛋中含有丰富的生命必需元素，营养价值较高。随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶段，趋向于开发具有较高附加值的生理活性物质[1-2]。蛋清是一种以水为分散介质，以蛋白质为分散相的典型胶体物质，鸡蛋清中的蛋白质含量约为总量的11%，除不溶性的卵黏蛋白外，均为可溶性蛋白质。卵白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶是其中3种主要的生物活性蛋白质。卵白蛋白是蛋清中主要的活性蛋白，约占蛋清蛋白质含量的54%。卵白蛋白具有许多功能特性[3]，例如，卵白蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用，能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性[4]；Fujita用胃蛋白酶水解卵白蛋白，并用RP-HPLC分离出具有血管舒张活性的物质OA358-365[5]；Davalos和Xu等研究发现，卵白蛋白酶降解物具有强抗氧化活性的多肽[6-7]。卵白蛋白是生物化学中一种重要的参考蛋白质，包含所有的必需氨基酸，而且比例合理。高度纯化和结晶的卵白蛋白可以作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等，也可作为营养添加剂应用于食品工业。虽然许多学者对卵白蛋白进行了大量研究，但对其生物学特性和功能的了解仍不够全面，本文采用硫酸铵盐析的方法，对鸡蛋清中的卵白蛋白进行了快速初步分离，为其进一步开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料新鲜鸡蛋，购自超市；卵白蛋白标准品，Sigma公司；硫酸铵分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；透析袋，Amersham Bioscicnccs(SF)Corp。 1.2 试验方法 1.2.1 鸡蛋清原液的制备取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min（搅拌剧烈程度以不起泡沫为准）。为了降低鸡蛋清粘度以利于后续试验，取5 mL鸡蛋清用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（50 mL 0.1M Tris-base 溶液与5.7 mL 0.1M HCl溶液混匀后，冷却到室温，加水定容到100 mL）进行5倍稀释，4℃下静置至少6 h。 1.2.2 鸡蛋清卵白蛋白盐析法分离将静置蛋清4℃、10000 rpm离心10 min，取上清液，缓慢多次加入烘干研磨成粉末的硫酸铵，磁力搅拌，使加入粉末溶解，并参考硫酸铵溶液饱和度计算表，使其饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%和80%。4℃静置过夜，于4℃、12000rpm离心10 min，不同饱和度离心所得沉淀均用pH 9.0的Tris-HCl 缓冲液溶解，并在4℃、0.05 M的Tris-HCl缓冲液中进行透析。期间更换透析液2~4次，透析过夜。 1.2.3 蛋白质检测蛋清盐析蛋白质含量采用Bradford法测定[8-9]：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色，蛋白与考马斯亮蓝反应后，溶液在分光光度计波长595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比。用BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光值绘制标准曲线（见表1），不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm波长测得的吸光值，通过标准曲线得到蛋白含量。采用SDS-PAGE检测盐析后卵白蛋白的纯度。表1 标准曲线配比表处理序号0.01%BSA标准液（μL）蒸馏水（μL）考马斯亮蓝（μL）蛋白质含量（μg/mL） 1 0 200 1000 0 2 40 160 1000 20 3 80 120 1000 40 4 120 80 1000 60 5 160 40 1000 80

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化

生物技术制药

1. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。 2. 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 3.疫苗：是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。 4.反义核酸：包括反义DNA分子，或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。 5.载体分为：质粒载体和λ噬菌体载体。①质粒载体涉及三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体（克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体）②λ噬菌体载体：常用于构建基因组文库和cDNA 文库。λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体，插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入，置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。 6.目的基因常用的制备方法：化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。 7.基因工程药物制造程序：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。 8.基因工程菌的培养过程:（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。（2）培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。基因工程菌的培养方式:（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2)连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性(5）分批培养:DO-Stat 法：调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat 法：控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）（7）诱

卵菌的研究进展

卵菌的研究进展草业科学---林艳艳---20104033107 【摘要】卵菌是一类重要的病原生物，可以侵染人类、动物和植物，尽管形态上与真菌类似，但是卵菌在进化上与硅藻和蓝藻亲缘关系更近；多种植物病原菌属于卵菌。卵菌是多分枝的群体,包括60 多种疫霉菌多个活体营养的霜霉菌和100 多种腐霉菌,其中许多是植物病原菌。卵菌在系统进化上有别于其它植物病原真菌,形成一个独立的群体,所致病害给许多农作物和花卉植物造成毁灭性危害。近年来，随着基因组学理论和技术的发展，大量的卵菌基因组相关的数据库被建立。【关键词】卵菌，独立群体，基因，致病一、卵菌的独立性： 1.过去很长时间以来，人们都认为卵菌是真菌，因为卵菌也是丝状体，获得营养的方式也是吸收。但卵菌有很多其独特的特征（表1），其单倍体的卵子接合产生二倍体的卵孢子，而真真菌不产生卵孢子；细胞壁成分是b-葡聚糖和纤维素，而真真菌则是几丁质。卵孢子产生游动孢子，游动孢子的鞭毛有二种类型，一种是以鞭动形式，后导向；而另一种则是茸鞭毛，前导向。所以，又称该群生物为异鞭毛生物。尽管真真菌中的壶菌也产生游动孢子，但其游动孢子的鞭毛只有一种鞭动后导向鞭毛。第四个显著的不同是卵菌的营养细胞一般是多核菌丝，无隔膜，核是二倍体，其生活史中主要是二倍体。而真真菌绝大多数的菌丝有隔膜，一个细胞中含有一个、二个或多个单倍体核。但一些卵菌也能够产生单细胞的菌丝。电镜观察卵菌和真真菌的超显微结构也有明显不同。卵菌的线粒体是管状脊，与异鞭毛藻类相似，而真真菌的线粒体是板片状脊。因此，卵菌应属于无色的藻类而不是真真菌。推测卵菌可能是管藻失去叶绿体后改变为腐生型，但有待进一步的证据。————————文献: ●林奈《自然系统》，贝塞（1950）的分类系统， ●安斯沃思（Ainsworth，1971、1973）的分类系统， ●阿尔克斯（1981）的近代分类系统 ●余永年;卵菌的系统学和分类学[J];武汉植物学研究;1986年04期 2. rDNA序列分析表明，卵菌和异鞭毛藻类或藻类具有共同的祖先，尤其是卵菌中的丝壶菌门（Hyphochytridiomycota）和网黏菌门（Labyrinthulomycota）与藻类的关系更为紧密。藻类中的异鞭毛藻与其他藻类明显不同，其具有和卵菌相同的线粒体管状脊和其他超显微结构。能够进行光合作用的藻类含有叶绿素c和其他色素，这些色素在其他生物中没有。二、卵菌的近代研究进展： 1.卵菌的基因组学研究进展 1.1由于卵菌与真菌以及其他物种不同，尽管其引起的病害十分严重，但其治理，不同行为的生物学机制以及不同发育阶段的分化机制在分子水平上却远未得到研究。近年来，随着生命科学其他领域的理论和科技的发展与渗透，很多研究方法与技术引入到卵菌研究中，如线性DNA转化技术、报告基因的使用、基因沉默及RNAi【3】，随着大豆疫霉（Phytophthorasojae）、橡树疫霉（P.ramorun）全部

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理：（一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。（二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

人卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析试剂盒使用说明

人卵清蛋白特异性IgE（OVA sIgE）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用特异性：本试剂盒可同时检测人OVA sIgE，且与其他抗体无交叉反应。有效期：6个月预期应用：ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中OVA sIgE含量。说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。实验原理用OVA包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体进行反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的OVA sIgE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中OVA sIgE的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。 2.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。 3.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体稀释液（HRP-anti-guinea IgE Diluent）：1×10ml/瓶。 4.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体（HRP-anti-guinea IgE）：1×120μl/瓶（1：100）。 5.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 6.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 7.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

生化分离《生物分离与纯化技术》实验题目

2009生化分离工程实验（闭卷考试） 2012生化工艺实验简答题（23选6题，每个实验选一题） 1.在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO？ 2.索氏提取装置由哪几部分组成（画图）？工作原理？ 3.咖啡因升华过程中用到了什么装置？咖啡因的升华结晶应注意哪些操作？ 4.茶叶咖啡因的提取实验中，浓缩去除乙醇的过程中用到了哪些设备？ 5.动物脏器DNA提取实验中，蛋白质是如何去除的？ 6.动物脏器DNA提取实验中，如何鉴定DNA的纯度？ 7.动物脏器DNA提取实验中，RNA是怎样去除的？ 8.动物脏器DNA提取实验中，氯仿-异戊醇的作用是什么？离心后分哪几层？ 9.动物脏器DNA提取实验中，为什么用0.1M NaCl-SSC间歇式的搅拌猪肝？ 10.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上半部），粗提过程中用哪种试剂去除杂蛋白？用哪种试剂沉淀得到粗黏蛋白？ 11.鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中，所用树脂是哪种？树脂为什么预处理，如何预处理？ 12.DEAE-纤维素是哪种类型离子交换剂，如何预处理DEAE-纤维素？ 13.在鸡卵黏蛋白离子交换层析实验中固定相、流动相分别是什么？ 14.简要画出离子交换层析系统中所用设备组成图。 15.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（上），为什么提取液的pH在3.5左右？ 16.离子交换层析分离鸡卵黏蛋白实验（下），pH6.5的用意何在？ 17.简述反胶团萃取甘薯中淀粉酶的实验原理 18.栀子黄提取实验中，栀子苷是如何去除的？为什么用此方法去除？ 19.栀子黄提取实验中，如何鉴定藏花红素中栀子苷的去除情况？ 20.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液稀释至240mL乙醇？ 21.栀子黄提取实验中，吸附前为什么将滤液pH调至3 22.大蒜SOD提取实验中，是如何去除杂蛋白的？PBS与丙酮的作用分别是什么？ 23.大蒜SOD提取实验中，用哪种方法测定SOD活性？其原理是什么？ 1. 在咖啡因的提取实验中，为什么加CaO? 答:吸取水分，防止咖啡因蒸汽溶于水；中和鞣酸； 2. 索氏提取装置有哪几部分组成？（画图）

生化技能大赛

鸡卵类粘蛋白的分离与纯化一．前言鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid 简称CHOM）是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，在电泳行为上常出现不均一性，这主要与糖蛋白的分子量不均一性有关。鸡卵类粘蛋白具有强烈抑制胰蛋白酶的作用，是胰蛋白酶的天然抑制剂，胰蛋白酶抑制剂是一类具有胰蛋白酶抑制作用的物质，该类物质的来源不同 ,其活性和作用的酶也不同，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究[1]。另外对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。另外,蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育，近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用[2]。CHOM在中性和偏酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度，但在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。由于CHOM在PH7.8～8.0的碱性条件下具有很强的结合胰蛋白酶的活性而且这种结合是可逆的，可以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。二．实验目的：了解并熟悉鸡卵类黏蛋白的提取、分离、纯化的方法,掌握凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法分离纯化鸡卵类黏蛋白的原理及操作方法。三．实验原理鸡卵类黏蛋白的提取【基本原理】鸡卵黏蛋白是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化【基本原理】蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。鸡卵类黏蛋白纯品的制备【基本原理】初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。得到鸡卵类粘蛋白的纯溶液。然后经透析、丙酮沉淀、抽真空干燥即可获得鸡卵类粘蛋白纯品。四．材料与试剂仪器：紫外分光光度计电泳仪摇床离心机核酸蛋白检测仪透析袋铁架台层析柱恒温水浴锅电磁炉 4℃冰箱微量取液器材料与试剂：鸡蛋尺子三氯乙酸丙酮磷酸盐缓冲液 DEAE-纤维素 0.3M氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液 1M 氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液 0.05M PH8.0 Tris-Hcl BAEE 胰蛋白酶 BSA Marker 0.05%考马斯亮蓝R250染色液7%乙酸

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

兔(Rabbit)卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)-NEWA

上海笃玛生物科技有限公司本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断兔（Rabbit）卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG） ELISA 检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgG （OVA-sIgG）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱操作注意事项1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

湖南省株洲市2018届高三年级教学质量统一检测理综生物部分(word)

株洲市2018届高三年级教学质量统一检测(二) 理科综合能力测试一、选择题：本题共13小题，每小题6分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。 1.下列关于细胞的叙述正确的是 A.小分子物质和离子可通过被动运输或主动运输进入细胞 B.细胞分裂的方式有三种：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂 C.所有细胞正常代谢都离不开其生活的稳定的内环境 D.癌细胞是动物细胞内具有自养能力并能快速增殖的细胞 2.精卵识别后，精子头部的顶体释放顶体酶使卵子外部结构溶出一条孔道，以利于精卵融合成受精卵。下列叙述正确的是 A.顶体内储存的顶体酶是在精子的溶酶体中合成的 B.精卵细胞的识别、结合与膜表面蛋白质的结构特异性有关精子游冋卵子所需的能量来自线粒体内葡萄糖的氧化分解 D.卵子既供质基因又供核基因，所以受精卵中遗传物质的嘧啶和嘌呤数目不相等 3.下列关于实验的叙述正确的是 A.观察人体口腔上皮细胞的线粒体时，用健那绿染色前需要先用盐酸处理 B.在“生物体维持PH稳定的机制”的实验中，清水组和缓冲液组都可作为对照组 C.不可用绿色植物成熟叶肉细胞进行细胞失水和吸水的观察实验 D.可用澄清的石灰水检验CO2的生成，来探究酵母菌的呼吸方式 4.下列关于植物生长素及其类似物的叙述，不正确的是 A.豌豆幼苗切段中乙烯的合成受生长素浓度的影响 B.生长素是色氨酸在植物体内经过一系列反应转变而来的 C.去掉顶芽，侧芽附近的生长素来源暂时受阻，浓度降低 D.生长素浓度超过最适浓度，随其浓度升高对植物生长抑制作用增强 5.乳头瘤病毒(HPⅤ)是一种球形DNA病毒，人感染可诱发宫颈癌等恶性肿瘤。研究机构为评估某种HPV疫苗的效果，在志愿者中进行接种。一段时间后，统计宫颈癌出现癌前病变(癌变前病理变化，可发展为恶性肿瘤)的人数，结果见表。下列分析错误的是 A.Bl组人群中出现癌前病变比例显著高于A1组，可推测HPV是诱发癌前病变因素

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二）一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相