病毒疫苗资料汇总
病毒疫苗
背景：十一世紀中国（約北宋時期）及阿拉伯的医生就知道将患有天花之病患者身上的痂取下磨成粉末，吹到健康人鼻腔以预防天花。英國医生Edward Jenner在1796年更证明了接种牛痘可预防天花。
接种病毒疫苗是预防一些由病毒引起的传染病最有效、最经济的措施。
定义：病毒疫苗是一些活的病原体或是病原体的多糖，可以激发机体的免疫反应，产生抗体和记忆细胞，用于二次免疫。专用于预防由病毒引起的症状。（不确定）
疫苗免疫的原理：动画PPT疫苗免疫原理.pptx
以下是解说
疫苗免疫是一种特异性免疫，是动物机体受到疫苗刺激所产生的应答过程，即免疫应答。所谓免疫应答是指机体内的T、B淋巴细胞对抗原(这里指疫苗的免疫原)的识别、自身活化、分化、增殖及产生效应的全过程。分为致敏阶段、反应阶段和效应阶段。致敏阶段是疫苗进入机体后，被巨噬细胞捕获或与巨噬细胞结合，经巨噬细胞加工处理后，将抗原传递给T、B淋巴细胞。反应阶段是T、B淋巴细胞接受抗原后被活化，迅速分化、增殖(其中有少数细胞中途停止分化而成为记忆细胞)为淋巴母细胞和浆细胞，浆细胞合成并分泌抗体，淋巴母细胞产生致敏淋巴细胞。效应阶段是抗体和致敏淋巴细胞进入淋巴液、血液、组织液或黏膜表面，中和进入机体的相应病原或在巨噬细胞及补体等物质的协同下，杀灭或破坏病原的抗原性物质，使病原微生物失去致病作用。
病毒疫苗的分类：病毒疫苗有两种基本类型：减毒活病毒疫苗和灭活病毒疫苗。（以下简称疫苗）活疫苗和灭活疫苗的特点是不同的，这些特点决定着使用疫苗的方式。
减毒活疫苗
减毒活疫苗是在实验室里通过改进(“野”)病毒制备。所得到的疫苗株微生物保留了复制（生长）和引起免疫的能力，但通常不致病。
减毒活疫苗的优点
1.由於其仍具有感染力，因此活毒疫苗往往能引發全面性的免疫力，包括體液性免疫
力(humoral immunity)、細胞免疫力(cell-mediated immunity)及黏膜免疫力
(mucosal immunity)，因此免疫效果較佳，且保護期較長。
2.由於其仍具有繁殖能力，可以在人或動物體內繼續增殖，因此接種劑量不需要太大，
可以減低成本。
3.接種方便，尤其在畜用疫苗的使用上，有利於適用在農場上大規模的防疫計畫。
缺点： 1、免疫保护期短，产生的抗体滴度下降快，
2、免疫应答受佐剂的影响大，免疫副反应大，
3、肌肉注射受母源抗体的干扰大，
4、弱毒疫苗毒在体内复制被抑制
5、对于研究不成熟的疫苗制作产品有很大毒力反强的风险。
减毒活疫苗的研發：
必須經過馴化或減毒(attenuation) 的過程。由於每一種病原的致病機制不同，因此馴化減毒的方法及難易程度亦不相同，有些甚至以目前的技術還無法達到減毒馴化的目的。傳統的減毒過程通常是將病原不斷的在動物體內或組織培養的細胞內繼代繁殖，直到病原對其宿主的致病力減低至最小的程度。近年來由於分子免疫學的發展，許多病原的致病因子(virulence factor)已逐漸明朗，因此也可以利用生物技術的方法，將病原致病因子的基因完全切除而達到減毒馴化的目的。
灭活疫苗
灭活疫苗既可由整个病毒或细菌组成，也可由他们的裂解片断组成。裂解疫苗既可以是蛋白质疫苗，也可以是多糖疫苗。蛋白质疫苗包括类毒素（灭活细菌毒素）和亚单位或亚毒粒制品。大多数多糖疫苗由来自细菌的纯化了的细胞壁多聚糖组成。结合多糖疫苗是将多聚糖用化学方法与蛋白质连接而得到的疫苗，这种连接使多糖成为更有效的疫苗
又分为：
1.灭活全病毒疫苗：应用物理或化学方法使病毒完全灭活而制成的疫苗
2.亚单位疫苗制备：不含有病毒核酸、仅含有能诱发中和抗体的病毒衣壳蛋白或包膜表面抗原，是最理想的疫苗。
3.合成肽病毒疫苗：人工合成与病毒保护性抗原决定簇的氨基酸序列相同的肽段，制备成免疫原后免疫动物，使机体产生保护性抗体
灭活疫苗的优缺点：
缺点：
1.免疫活性不高，
2.细胞免疫无、或者很弱，
3.需加大注射量或多次接种。
4.在污染比较严重的状况下：
–免疫保护不全，不能有效控制野毒的感染和扩散
–不能提供对健康猪的完全保护
优点：
– 1.适合病毒阴性猪场使用，
– 2.没有疫苗毒力反强的危险。
基因工程疫苗：原理是利用基因工程技术，控制病毒变异，或利用DNA重组技术，插入和定向缺失病毒基因，将保护性病毒蛋白的编码基因插入活载体中或选择性地去除病毒的某一个或几个致病基因而达到减毒作用制备的可在机体内增殖，诱发抗病毒免疫应答的疫苗。
?亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。
?重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中区大量生产。
?这样得到的亚基疫苗往往效价很高，但决无感染毒性等危险。
基因工程疫苗的优缺点：
缺点：
? 1、目前还没有很好的技术证明其安全性
?2、缺损病毒株在机体内的增值或复制不确切
优点：
? 1、为制作疫苗时的短板，提供了新的方向。
?2、制作方向的目的性强
病毒疫苗的作用途径
抗原進入的途徑可影響免疫反應的發生。灭活疫苗經由皮下注射或肌肉注射主要產生體液性免疫反應，而减毒活疫苗則同時產生體液性免疫反應及細胞性免疫反應。大部分的致病原均經過身體的黏膜系(mucosal system)而進入體內致病，然而，目前市售抗這些疾病的疫苗大部分均採皮下注射或肌肉注射進行免疫，此類疫苗雖可引發全身性免疫反应（systemic immunity），卻不能有效的引發黏膜性免疫反應(mucosal immunity)而迅速有效的清除致病原。黏膜性免疫反应除了可引發黏膜性免疫外也可引起全身性免疫反應，是目前認為較以腸胃外(parenteral)免疫如皮下注射或肌肉注射為佳的一種免疫方法。黏膜免疫以活毒疫苗用口服或噴灑到鼻腔內為較佳的選擇型式，如沙賓(sabin)口服疫苗。
理想疫苗的特性
1、使用於人、畜必須十分安全，無副作用，且能產生良好及持久的保護性免疫力。
2、價格低廉。
3、便於保存。
4、使用方便易於接種，且接種次數不須太多次。
5、對於具有造成潛伏性感染的病原(pathogen)，不但要能抑制發病，還要能預防感染。
生产病毒疫苗的方法：
生产病毒的常用方法：
1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺
2、转瓶培养法
3、罗式瓶培养
（详情请看生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法.doc）
再将病毒加工为病毒疫苗
具体的工艺流程，有两：
（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺；
|
|猴肾细胞培养
| ←接种病毒（测0%正常细胞对照）
|
收获病毒，合并，加MgCl2→ |
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无菌试验→ | ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）
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B病毒检查（兔肾细胞）→ | ←病毒效价滴定
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|←合并，过滤加MgCl2
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| ←无菌试验
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分亚批→ | ←柯萨奇病毒检查（乳鼠）
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病毒滴定→ | ←型特异性检查
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B病毒复检（家兔）→ | ←T特征试验
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分装病毒滴定→ | ←猴体残余致麻痹力试验
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（安全试验）病理切片 |
结核杆菌检查→ |
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分装→ | ←无菌试验
|
病毒滴定→ |
→
保存于-20℃待检定合格后
加工糖丸
2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺
地鼠肾
剪碎，胰酶消化
地鼠肾细胞悬液
37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2
单层细胞
洗涤细胞，去除牛血清
10-4～10-5浓度病毒感染细胞
32～34℃培养2～3天
收获病毒液（收二次）
按1:2000加入甲醛
22℃，8天
灭活病毒液
合并，安全及效力试验
原液
加入亚硫酸氨钠
半成品
分装
成品
检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，
防腐剂、试剂及残余牛血清含量等）
合格成品
禽流感疫苗制得图
（具体英文内容，我可不可以不翻译。。）
重要病毒疫苗的发展
上面各种疫苗的补充：
狂犬疫苗，是一个历史悠久的疫苗，最早制造狂犬疫苗的是法国的巴斯德。1882年它成功地应用连续传代减弱病毒毒力的方法，用适应毒种来制造疫苗。中国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并加氢氧化铝佐剂，经全面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。
黄热病疫苗系用黄热病毒减毒株接种于SPF级鸡胚，经研磨，离心，取上清液冻干制成。
小儿麻痹口服疫苗是在口服后发生一次相当于隐性感染的自然感染过程。疫苗病毒在肠道内繁殖，产生抗体和特异性的细胞免疫。服苗后7-10天，血清中开始有了中和抗体，1-3个月达到高峰。一旦新的脊髓灰质炎野病毒侵入，病毒抵达肠道后，体内的分泌型抗体IgA就发挥作用，抵抗病毒。血液中的中和抗体则阻止病毒从血循环向神经系统扩散，避免病毒侵入脊髓和脑神经产生麻痹症状。
日本脑炎疫苗：日本腦炎是一种经蚊子媒介传染的病毒性疾病。对人类和增幅动物做全面性的疫苗接种，是控制此病有效且实际的方法之一。目前在人体使用的日本脑炎疫苗有三种：第1 种是源自鼠脑的不活化疫苗（mouse brain-derived inactivated vaccine），第2 种是经細胞培养的不活化疫苗（cell culture-derived inactivated vaccine），第3 种是活的減毒疫苗（live attenuated vaccine）
腺病毒疫苗：腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染。有灭活疫苗、减毒活疫苗及病毒壳粒亚单位疫苗。由于腺病毒的作用机制是将腺病毒基因整合到动物染色体上，起到癌基因作用所致。同時，由於亚单位疫苗造价过高，于是20世紀80年代停用了腺病毒疫苗。使目前腺病毒疫苗的开发应用赞处于停滞階段。
（图片在资料里面也有）
麻疹疫苗系用麻疹病毒减毒株接种鸡胚细胞经培养收获病毒液后冻干制成。按瓿签所示用量加灭菌注射用水待完全溶解后使用。于上臂外侧三角肌附着处注射可起到预防麻疹的作用。
腮腺炎疫苗用腮腺炎病毒S79减毒株接种鸡胚细胞，经培养，收获病毒液并加适宜稳定剂后冻干制成。冻干疫苗为乳酪色疏松体，经溶解后为橘红色。
水痘疫苗是经水痘病毒传代毒株制备而成，是预防水痘感染的唯一手段。接种水痘疫苗不仅能预防水痘，还能预防因水痘带状疱疹而引起的并发症。
乙型肝炎疫苗系用基因工程技术将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细
胞(CHO)内，通过对细胞培养增殖，增殖分泌乙肝表面抗原(HBsAg)于培养液中，经纯
化加佐剂氢氧化铝后制成。疫苗外观有轻微乳白色沉淀。
甲肝疫苗：目前，市场上的甲肝疫苗主要有甲肝灭活疫苗和减毒活疫苗两大类。由于制备原理的不同，在有效性和安全性上存在差异。相对于减毒活疫苗，灭活疫苗具有更好的稳定性，而甲肝减毒活疫苗的价格相对便宜。
轮状病毒疫苗，属于生物制剂，该疫苗系采用轮状病毒减毒株感染新生小牛肾细胞，
经培育、收获病毒液后加入时宜的甜味保护剂制成。为橙红或粉红色澄清液体。
子宫颈癌疫苗是用病毒的外套所制造成的疫苗，成分相当单纯，以四价HPV疫苗而言，主要成分为衍生自第6,11,16,18型人类乳突病毒的非活性蛋白。另外含有氯化钠、L-组胺酸、硼化钠、注射水等。
病毒疫苗的影响因素
1.母体抗原
2.疫苗质量：疫苗质量达不到规定效价；疫苗运输、保存不当；疫苗被污染；疫苗
血清型不同
3.免疫程序：初免时间过早或过晚；加强免疫过迟；两种疫苗接种的间隔时间不够；抗原劑量對免疫反應的影響：大劑量的抗原常使專一性的T 细胞及某些 B 细胞產生忍受性(tolerance)，而大劑量的多醣類抗原常使非T細胞依賴性的B細胞(non-T cell dependent B cells)產生忍受性。唯有適量的劑量才能達到最有效的免疫效果。
4.免疫操作：疫苗稀释不规范或稀释后放置时间过长；接种剂量不准；免疫方法不正确；免疫接种前没有认真检查受体状况；消毒不当
具体参考浅谈影响疫苗免疫效果的因素及应对措施.pdf
应对措施可根据其影响措施来调节。
病毒疫苗的研发趋势
1.抗原蛋白之製備
在疫苗製造的過程中，抗原蛋白的製備是不可缺乏的。以往抗原蛋白的製備方法是將病原大量培養後，（例如：流行性感冒病毒在雞胚胎內培養，狂犬病病毒在鴨胚胎，日本腦炎病毒在小白鼠腦內繁殖，小兒痲痹病毒在培養之猴子腎臟細胞繁殖。）經過不活化處理，再將其抗原蛋白萃取純化，這種方法既費時且昂貴，有時又有安全上的顧慮，尤其是當病原無法以人工方式大量培養時（如C型肝炎病毒），抗原蛋白的製備往往成為疫苗研發的瓶頸。如今可藉由基因工程的方法將抗原蛋白的基因選殖出，再以基因表現的方式，利用微生物或其他的生物細胞大量生產抗原蛋白，如利用酵母菌生產B型肝炎表面抗原蛋白。
2.疫苗馴化
疫苗的馴化及減毒過程是活疫苗研發的關鍵，傳統以人工方法重複繼代而馴化的疫苗是根據基因自然突變而篩選出來的，這樣的疫苗除了毒性減弱以外，可能還有其他特性的改變（如免疫力降低），此外因自然突變而馴化的疫苗常是由於基因的些微改變，因此也會發生毒力恢復的現象，如沙賓小兒痲痹疫苗，造成使用上的危險。利用基因工程的方法，不但可找出致病基因，使我們對於許多疾病的致病原理有更深入的了解，且進一步可將與毒性有關的基因（例如皰疹病毒的胸腺激 基因；thymidine kinase; 簡稱TK）缺損，如此得到的基因缺損減毒疫苗不但具有較穩定的遺傳特性，同時也可充分保留病原的免疫力。
3.疫苗載體(vaccine vector)技術的建立
活疫苗研究的另一個趨勢是疫苗載體與多價疫苗技術的發展。所謂疫苗载体是將病原的基因，利用基因工程的方法殖入一個安全而且無致病能力的病毒載體，如此所得到的病毒載體感染人或動物體後能夠大量生產病原基因所轉譯的蛋白，由於所產生的病原蛋白具有較正確的三級結構，因此往往能夠引起很好的免疫效果。目前已有多種病毒被開發為疫苗載體，並已獲得不錯的成果（如：減毒活病毒，Attenuated live virus—Poxvirus:Vaccinia, Fowlpox virus, Canarypox virus;
Adenovirus; Herpesvirus, Pseudorabis virus; Poliovirus. Attenuated bacteria—BCG;
Salmonella)。疫苗載體技術的更一步應用是將不同的抗原蛋白的基因殖入疫苗載體，同時產生兩種或多種抗原蛋白而形成兩價或多價型疫苗。不過這種技術目前也仍然有許多問題需要克服，例如抗原蛋白彼此之間的相容性及重覆使用同一種疫苗載體而造成免疫失效的可能性及移行抗體(maternal antibody)中和病毒的問題。
4.合成（缩氨酸）peptide疫苗(Synthetic peptide vaccine)的發展
利用基因工程的方法生產抗原蛋白在某些情況下尚有許多的限制與不足，例如抗原蛋白在細胞內表現及生產量太低，以及抗原蛋白可能引發的不良副作用及抗原污染等問題。近年來我們已經了解抗原之引發免疫反應往往只取決於抗原蛋白中之抗原決定基(epitope)而已。由於化學反應合成peptide的技術日趨成熟，因此合成peptide是疫苗研發的新趨勢。口蹄疫的合成peptide疫苗研究已有很好的成果。合成peptide疫苗由於僅含有抗原蛋白中與免疫保護力有關的部分，因此較一般的次單元疫苗更為安全。此外由於這種疫苗為化學方法合成，不會受細胞表現量低的影響，故價格也較便宜，不過合成peptide疫苗由於其分子量小，引發免疫能力較弱，因此往往需要與其他抗原蛋白結合以增強其引發免疫反應的能力。
5.核酸疫苗(DNA vaccine)
近年來在疫苗研發上另一個新的嘗試是利用核酸，而不是傳統的抗原蛋白作為疫苗。其原理是利用基因工程技術將抗原的基因殖入表現質體(expression
plasmid)，將其作為疫苗打入人或動物體後，表現質體在細胞內表現，並產生
抗原蛋白而達到引發免疫反應的效果。以核酸為疫苗，可以省去抗原蛋白製備
的過程，而且由於其所引發之免疫反應是經由細胞本身所合成的抗原蛋白，因
此在細胞免疫的效果上，較一般次單元疫苗為佳。然而這種疫苗最大的顧慮在於進入動物體內後所引起基因突變的可能性。而由於活毒疫苗有其潛在危機及移行抗體的問題，因此有越來越多的財力及人力投入此方面的研究。將來研發的重點將放在：(1).如何將DNA送入體內；(2).何種免疫佐劑配方更能達到免疫功能；(3).研發新一代的核酸疫苗載體。
6.疫苗佐劑(Adjuvant)
佐劑能增強抗原蛋白的免疫效果，尤其是在次單元及peptide疫苗的使用上非常重要，以往使用的疫苗佐劑僅限於少數幾種油質及鋁膠佐劑，許多其他具有刺激及增強免疫效果的物質大都因為其毒性太強而無法使用於人或動物體內。近年來由於生物化學及純化技術的進展，許多新疫苗佐劑，例如RAS (Ribi adjuvant system), MPL (monophosphoryl lipid A), ISCOM (immunostimulating complex), liposome以及聚環氧乙烯與聚環氧丙烯的共同聚合體等陸續開發成功，這些新型佐劑大都具有較低的毒性或緩釋的效果，因此必較傳統的佐劑更為理想。
病毒及其疫苗的生产制备技术
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术 第一节病毒的生产制备 病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。 一、病毒生产的目的和用途 1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。 二、病毒生产制备的方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节病毒疫苗的生产制备 病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
轮状病毒疫苗
轮状病毒疫苗 WHO立场文件1 依据为各成员国提供卫生政策方面指导意见这一职责，世界卫生组织（WHO）就预防具有全球公共卫生影响的疾病的疫苗及联合疫苗问题，发布一系列定期更新的立场文件。这些文件着重关注疫苗在大规模免疫规划中的使用，归纳了各相关疾病与疫苗的基本背景信息，并就如何在全球使用这些疫苗表明了WHO目前的立场。这些文件在发布前经过WHO内部和外部众多专家的审阅，并且自2006年4月以来，得到了WHO免疫战略咨询专家组（SAGE）的审核和批准。这些文件主要供各国的公共卫生官员和免疫规划管理人员使用。不过，对这些立场文件感兴趣的还可能包括一些国际资助机构、疫苗生产企业、医学界、科学媒体和公众。 概要和结论 轮状病毒是全球婴幼儿严重腹泻病最常见的病因。2004年，估计轮状病毒感染在全球导致约52.7万婴幼儿死亡（47.5万–58.0万），这些死亡主要发生在发展中国家。尽管轮状病毒毒株在各地有很大差异，但人类的轮状病毒疾病主要是由5种血清型引起的。轮状病毒主要经粪口途径传播，全球绝大多数儿童在3岁以前都已感染过轮状病毒，而多数发展中国家儿童则在1岁以前大多已经感染。1999年，一种高效的轮状病毒疫苗RotaShield?在美国上市，但不到一年就由于与肠套叠的发生有关联而退出市场。两种新的口服减毒活疫苗于2006年获准上市：单价人轮状病毒疫苗（Rotarix?）和五价人-牛重配疫苗（RotaTeq?）。西方工业化国家和拉丁美洲开展的大规模临床试验证明两种疫苗都是安全、有效的，认真监测也未发现肠套叠的发生风险增高。目前，一些工业化国家和发展中国家已经将新的轮状病毒疫苗纳入常规接种。 这两种轮状病毒疫苗被认为具有同样的安全性和有效性，但抗原组分和免疫程序有所不同。轮状病毒疫苗效力因研究人群、免疫程序不同而有所差异，总的来说疫苗针对严重轮状病毒腹泻病的保护作用为90–100%，针对所有轮状病毒腹泻病的保护作用为74–85%。两种疫苗对严重轮状病毒感染的保护力均可持续到第二年。 迄今为止，轮状病毒疫苗的效力主要是在美国、欧洲和拉丁美洲得到证实。对于疫苗效力资料表明使用该疫苗有显著公共卫生效果、具备适宜的基础设施条件和筹资机制的国家，WHO强烈建议将轮状病毒疫苗纳入其国家免疫规划。但在所有区域（特别是非洲和亚洲）都确认目前使用的轮状病毒疫苗的效果之前，WHO不准备在全球范围内推荐将轮状病毒疫苗纳入国家免疫规划2。 1 Replaces the WHO position paper on rotavirus vaccines published by the Weekly Epidemiological Record in 1999 (see No. 5, 1999, 33–38) and the update on rotavirus vaccines published in 2003 (see No. 1, 2003, pp. 2–3). 2 Strategic Advisory Group of Experts (SAGE). WER 2006, January 1 3 ( No.1, 2006, pp. 2–11).
国家科技支撑计划重点项目疫苗关键生产技术研究开发课题申报指引
附件2. “十一五”国家科技支撑计划重点项目“疫苗关键生产技术研究开发”课题申报指南 一、总体目标 本项目的总体目标是着力解决制约我国疫苗产业发展的关键生产技术，完善或建立疫苗关键性技术平台，发挥其示范作用，使我国疫苗大品种生产关键技术水平迈上新台阶，大幅度缩小与发达国家之间的差距。通过项目实施，提高紧缺疫苗大品种的产量，提高优势企业疫苗的质量，为疫苗行业的进一步集约化提供科技支撑；大力推动国际化进程，促进我国疫苗产品出口，提高我国疫苗产品在国际市场的占有率。 通过项目的实施，建立3-5个技术平台，突破5-10项关键技术，力争1-2个品种获得临床研究批件、2-3个品种获准换发生产文号，大幅度提高8-10种疫苗产品的产量，实现我国疫苗产业年销售收入新增8-10亿元。 二、实施年限 项目实施年限为2008年7月～2010年12月。 三、主要内容 课题1、细菌多糖-蛋白结合关键技术及其应用研究 1、研究内容
（1）研究多糖－蛋白质结合化学的适宜方法。利用具有代表性的Hib结合疫苗优化制备条件和结合物大规模纯化技术条件；优化Hib多糖衍生及多糖蛋白结合技术；解决Hib多糖活化、衍生，与载体蛋白结合过程中的条件优化，进行规模纯化层析条件的优化，最终使多糖-蛋白结合疫苗的产量提高，结合物原液质量指标稳定；建立Hib结合物原液、成品中结合物含量、成品中游离蛋白、游离多糖的快速、稳定的测定方法游离蛋白质和游离多糖含量的质量控制方法。 （2）细菌多糖蛋白质结合疫苗质量标准研究。主要包括多价结合疫苗和多联多价联合疫苗质量标准确立（多价疫苗中各种单价疫苗抗原含量检测，游离蛋白、游离多糖含量检测、多种抗原成分剂量、配伍研究，以及最低免疫剂量的确定等）。 （3）载体蛋白多样化研究。开发TT和DT以外的新载体蛋白质；对现有载体蛋白使用风险的评价，以及对新的载体进行安全性、有效性的全面评价研究，完成H21G、64K外膜蛋白、C5a 肽酶等新型载体蛋白的特性研究；以及探索这些新型载体蛋白与细菌多糖结合的方法或工艺。 （4）细菌多糖蛋白质结合疫苗效果评价方法建立。包括： ①标准参考物质的制备； ②抗体含量检测方法建立与标准化； ③抗体功能活性检测方法建立与标准化。 2、考核指标 (1)技术指标
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
重组腺病毒常见问题解答(FAQs) ?Q1. 使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ ?Q2. 怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ ?Q3. 感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ ?Q4. 感染腺病毒时所需要的培养基的量？ ?Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ ?Q6. 病毒的滴度是如何测定的？ ?Q7. 对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？ ?Q8. 重组腺病毒的推荐存储条件是什么？ ?Q9. 腺病毒表达系统承载外源基因的容量？ ?Q10. 腺病毒有多种血清型，哪一种是基因传递中最普遍使用的？ ?Q11. 什么是RCAs？ ?Q12. 目前存在的许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统？ Q1.使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ 答：我们所提供的重组腺病毒是E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒。根据NIH官方的参考信息，重组腺病毒的生物安全等级被确定为II级，您只需要BL-II级实验设施，值得注意的是，大多数实验室都具备BL-II级的实验设施。野生型腺病毒可复制，能引起感冒和很强的免疫反应，通常不会引起很严重的疾病。要想获得更多生物安全信息，请参考网站https://www.wendangku.net/doc/025183776.html, 返回Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ 答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的
方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal 和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。 返回 Q3.感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ 答：要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV-B-gal 或者AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过B-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化病毒浓度范围。 我们已经针对多种细胞系做了预实验，加入已混合病毒的培养基，6-8小时或者过夜。对于大多数细胞系来说病毒浓度在2 x 105 - 1 x 106 IFU/PFU (infectious unit)/ml培养基都能得到10%的感染效率而且不会有副作用。我们推荐在您实验系统中用报告基因病毒重新摸索一下最适培养基用量。 返回 Q4.感染腺病毒时所需要的培养基的量？ 答：作为参考，我们推荐您按照如下的量加培养基（已混入病毒）： 10cm培养皿：8-10ml/孔6孔板：1ml/孔12孔板：0.5ml/孔24孔板：0.2ml/孔 返回 Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ 答：VP(Viral particles) 反映病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒），由于在病毒制备过程中，每次活/死病毒比率都不同，VP并不能反映有活性的病毒的数量。 PFU（plaque formation unit）代表可感染的或者活病毒的数量。能反映实验中所需要的病毒的量。 IFU（infectious unit）相当于PFU 大多数情况下所制备的病毒，VP/PFU比值在20:1到50:1范围。 应用VP（viral particles）做单位会与实际应用的活病毒的数量有很大出入。用IFU或者PFU做单位会得到比较一致的结果。 返回
轮状病毒疫苗
轮状病毒疫苗 【预防的疾病】 轮状病毒疫苗可以预防由于轮状病毒感染引起的腹泻。 【种类】 轮状病毒减毒活疫苗1种。 【接种对象】 主要为≤3岁儿童。 【免疫程序】 轮状病毒疫苗属第二类疫苗，我国目前尚未推荐统一的免疫程序，具体免疫程序参考疫苗产品说明书或省级卫生行政主管部门发布的预防接种方案。 【禁忌】 参照疫苗产品说明书。 【注意事项】 (1) 接种疫苗之前，应如实向预防接种医生告知儿童身体健康状况。若有感冒、发热等症状，待恢复健康后进行补种； (2) 接种疫苗后，须在预防接种单位留观至少30分钟。若儿童出现轻度发热等一般反应，通常不需任何处理。若高烧不退或伴有其他并发症者，应及时到医院就诊。 1. 疾病概况 轮状病毒引起的婴幼儿腹泻，潜伏期一般为1～3天，秋冬季高发，故又称“秋季腹泻”，＜5岁儿童易受轮状病毒的感染。据世界卫生组织估计，全球每
年轮状病毒腹泻的儿童超过1.4亿，造成超过60万儿童死亡。轮状病毒主要通过粪-口途径传播，其次是密切接触和飞沫传播。 2. 主要症状 轮状病毒引起的婴幼儿腹泻主要临床表现为急性腹泻，常伴高热，呕吐，腹胀和肠鸣，严重者可出现脱水、器官衰竭而死亡。病程一般3～5天，可完全恢复。 3. 治疗原则 轮状病毒引起的婴幼儿腹泻中大部分患病儿童需要医疗干预或入院治疗, 但目前尚无特效的治疗方法。 4. 预防措施 接种口服轮状病毒疫苗是预防轮状病毒引起的婴幼儿腹泻的措施之一。 其他预防措施还包括： (1) 避免与患轮状病毒腹泻的人接触； (2) 鼓励早期纯母乳喂养和补充维生素A； (3) 促进个人卫生和社区环境卫生。 来源：中国疫苗与免疫网 2014-10-11 【预防的疾病】 轮状病毒疫苗可以预防由于轮状病毒感染引起的腹泻。 【种类】
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法.doc
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法 (一)制备工艺流程 （1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺 | |猴肾细胞培养 | ←接种病毒（测0%正常细胞对照） | 收获病毒，合并，加MgCl2→ | | 无菌试验→ | ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40） | B病毒检查（兔肾细胞）→ | ←病毒效价滴定 | |←合并，过滤加MgCl2 | | ←无菌试验 | 分亚批→ | ←柯萨奇病毒检查（乳鼠） | 病毒滴定→ | ←型特异性检查 | B病毒复检（家兔）→ | ←T特征试验 | 分装病毒滴定→ | ←猴体残余致麻痹力试验 | （安全试验）病理切片 | 结核杆菌检查→ | | 分装→ | ←无菌试验 | 病毒滴定→ | → 保存于-20℃待检定合格后 加工糖丸 2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺 地鼠肾 剪碎，胰酶消化
地鼠肾细胞悬液 37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2 单层细胞 洗涤细胞，去除牛血清 10-4～10-5浓度病毒感染细胞 32～34℃培养2～3天 收获病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛 22℃，8天 灭活病毒液 合并，安全及效力试验 原液 加入亚硫酸氨钠 半成品 分装 成品 检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验， 防腐剂、试剂及残余牛血清含量等） 合格成品 (二)生产方法： 病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。 1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺 作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。 ①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。 ②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。 微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，
第3章病毒习题
第三章病毒习题 填空题： 1．病毒的存在范围是病毒能够感染并在其中复制的___宿主种类和组织细胞种类___。 2．从原核生物中分离的病毒统称噬菌体，它们包括___噬菌体___、___噬蓝(绿)藻体___和___支原体噬菌体___等。 3．病毒属名的词尾是___virus___、科名的词尾是___viridae___、亚科名的词尾是___virinae___，目名的词尾是___virales___。 4．纯化的病毒制备物应保持其___感染性___和___理化性质的均一性___。 5．血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制___病毒的血细胞凝集___性质设计的。 6．螺旋对称病毒体的直径是由___蛋白质亚基的大小___决定的，而其长度则是由___病毒核酸分子的长度___所决定的。 7．病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为___结构蛋白___和___非结构蛋白___两类。 8．病毒包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过___β-N-糖苷键___将糖链的___N-乙酰葡萄糖胺___与肽链的___天冬酰胺残基___—连接形成。 9．由一步生长曲线可获得病毒繁殖的两个特征性数据，即潜伏期和裂解量。前者为___病毒吸附于细胞到子代病毒释放___所需的最短的时间，后者为___每个受染细胞释放的子代病毒___的平均数目。 10．病毒的复制过程依其发生事件顺序分为以下___吸附___、___侵入___、___脱壳___、___病毒大分子合成___和___装配与释放___5个阶段。 11．动物病毒进入细胞的方式包括___移位___、___内吞___、___病毒包膜与细胞质膜融合___、___依赖抗体的增强作用___等。 12．动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括___5’末端加帽___、___3’末端聚腺苷化___、___甲基化___和___拼接___等修饰才能成熟为功能性mRNA。 13．病毒的非增殖性感染有___流产感染___、___限制性感染___和___潜伏感染___3种类型。 14．流产感染的发生或是由于病毒感染的细胞是___非允许细胞___或是由于感染的病毒是___缺损病毒___。 15．有生物活性的缺损病毒包括___干扰缺损病毒___、___卫星病毒___、___条件缺损病毒___和___整合的病毒基因组___4类。 16．溶源性转变是指原噬菌体所引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表型的改变，包括___细胞表面性质的改变___和___致病性转变___。 17．根据病毒感染机体所引起症状的明显程度，可分为___显性感染___和___隐性感染___o 18．毒力是特定的病毒___致病性的强弱___，它是___病毒株___的特征。 19．亚病毒包括___类病毒___、___卫星病毒___、___卫星RNA ___和___朊病毒___。 20．动物病毒感染抑制宿主细胞DNA复制的原因是___为病毒DNA合成提供前体___、___为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和／或复制蛋白___和___细胞蛋白质合成被抑制的次级效应___。 选择题（4个答案选一）： 1．病毒显著区别于其他生物的特征是( (2) )。 (1)具有感染性 (2)独特的繁殖方式 (3)体积微小 (4)细胞内寄生 2．病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的，包括( (2) )。 (1)病毒的核酸是DNA或是RNA (2)病毒的主要化学组成是蛋白质 (3)病毒含有脂类和糖类 (4)病毒体积微小 3．病毒物理颗粒计数方法测定的是( (3) )。 (1)有活力的病毒数量 (2)无活力的病毒数量 (3)有活力的病毒与无活力病毒数量的总和 (4)致病性的病毒数量 4．描述螺旋对称壳体特征的参数有( (2) )。 (1)核酸的相对分子质量 (2)螺旋长度与直径 (3)螺旋的外观 (4)蛋白质亚基大小 5．ssRNA能够按照它的极性或意义分为( (2) )。 (1)感染性核酸和非感性核酸 (2)正链RNA、负链RNA和双意RNA (3)反意RNA和正意RNA (4)基因组RNA 和非基因组RNA 6．以下病毒中在细胞核内复制的有( (1) )。 (1)腺病毒 (2)痘病毒 (3)小RNA病毒 (4)嗜肝DNA病毒 7．T4噬菌体的的装配包括的亚装配过程有( (3) )。 (1)2个 (2)3个 (3)4个 (4)5个 8．构成机体病毒感染的因素包括( (2) )。
腺病毒的制备by王晶晶
腺病毒的制备 简介： 腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。 腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。 基本概念： RCA： 在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。这就导致目的基因丢失而被E1区代替。具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。要避免RCA出现，以下两点非常必要： 1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化； 2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。） 各种常用病毒单位的含义： VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。 IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。 VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。
轮状病毒疫苗知情同意书
冬季，可引起患儿脱水、电解质紊乱、严重者可导致死亡。 接种轮状病毒疫苗是预防轮状病毒感染性腹泻的有效手段。 【接种对象】2月龄～3周岁儿童。 【接种程序】2月龄～3周岁儿童每年接种1次即可。 【常见不良反应】个别人偶有低热、呕吐、腹泻等轻微反应，多为一过性，一般无需特殊处理。 【禁忌】本品禁用于已知对疫苗的任何组份过敏者；身体不适，发热，腋温37.5℃以上者；急性传染病或其它严重疾患者；免疫缺陷和接受免疫抑制治疗者。 【注意事项】使用本疫苗前、后须与使用其他疫苗或免疫球蛋白间隔2周以上；请勿使用热开水送服以免影响疫苗免疫效果。 –––––––––––––––- ––––––––––––––––––––– 轮状病毒疫苗（第1剂）接种服务单（接种单位留存）以下内容由儿童家长或监护人填写： “免疫金卡”卡号：□□□□□□□□□□ 儿童姓名：；性别： 出生日期：年月日；联系电话： 详细住址： 本人已阅读该疫苗接种告知书，该儿童（有□、无□）接种禁忌症； 儿童家长或监护人（签名：）同意接种该疫苗。 以下内容由接种人员填写： 疫苗厂家：；疫苗批号：； 接种日期：年月日；接种人员签名：冬季，可引起患儿脱水、电解质紊乱、严重者可导致死亡。 接种轮状病毒疫苗是预防轮状病毒感染性腹泻的有效手段。 【接种对象】2月龄～3周岁儿童。 【接种程序】2月龄～3周岁儿童每年接种1次即可。 【常见不良反应】个别人偶有低热、呕吐、腹泻等轻微反应，多为一过性，一般无需特殊处理。 【禁忌】本品禁用于已知对疫苗的任何组份过敏者；身体不适，发热，腋温37.5℃以上者；急性传染病或其它严重疾患者；免疫缺陷和接受免疫抑制治疗者。 【注意事项】使用本疫苗前、后须与使用其他疫苗或免疫球蛋白间隔2周以上；请勿使用热开水送服以免影响疫苗免疫效果。 –––––––––––––––- ––––––––––––––––––––– 轮状病毒疫苗（第1剂）接种服务单（接种单位留存）以下内容由儿童家长或监护人填写： “免疫金卡”卡号：□□□□□□□□□□ 儿童姓名：；性别： 出生日期：年月日；联系电话： 详细住址： 本人已阅读该疫苗接种告知书，该儿童（有□、无□）接种禁忌症； 儿童家长或监护人（签名：）同意接种该疫苗。 以下内容由接种人员填写： 疫苗厂家：；疫苗批号：； 接种日期：年月日；接种人员签名：
细菌性疫苗制造技术
细菌性疫苗制造技术 任务一灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活 ↓ ↓ 配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ← 浓缩 工序一菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。 实例大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。 (3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计
微生物 第三章 病毒和亚病毒
第三章病毒和亚病毒 一、名词解释 噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。 噬菌体：原核生物的病毒。 病毒：是微生物中最小的生命实体，组成简单，由核酸（DNA或RNA）和一种或少数多种蛋白质组成的非细胞生物。 是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非 细胞生物。 溶源细胞：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动。 温和噬菌体：能导致溶源性发生的噬菌体。 烈性噬菌体：噬菌体在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖（复制与生物合成）→成熟（装配）→裂解（释放）五个阶段而实现其繁殖的噬菌 体，称为烈性噬菌体。 原噬菌体：某些温和噬菌体侵染细菌后，其核酸整合到宿主细菌染色体中。 处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体。 类病毒：是一类只含RNA一种成分、专性寄生在活体的分子病原体。 一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 逆转录病毒：能编码逆转录酶的RNA病毒。病毒RNA基因组可逆转录为病毒DNA，并整合在宿主染色体中一同复制。 裂解量：平均每个宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数。 双层平板法：先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计 算噬菌斑的数量。 效价：每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。 壳体：包在髓核外面的一层蛋白质膜。
阮病毒：不含核酸的传染性蛋白分子，能引起宿主体内的同类蛋白分子发生与其形似的构象变化，而使寄主致病。 壳粒：组成壳体的形态结构单位。 核壳：病毒核酸加上包围的蛋白质衣壳。 包膜：大多数动物病毒，核衣壳外由蛋白或糖蛋白与脂肪所形成类脂（来自寄主）双层外膜，称为包膜。 刺突：糖蛋白在膜上形成各种形状的突起，称刺突。 潜伏期：指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子释放前的一段时间。 卫星病毒：是一类存在于某专一病毒粒（辅助病毒）的衣壳内，并完全依赖后者才能复制自己的小分子RNA病毒。 溶源性：当温和噬菌体侵入宿主细胞后，DNA整合到宿主基因组上，随着宿主DNA 复制而复制，但不合成蛋白质，宿主细胞不裂解，继续进行正常 的分裂现象。 自发裂解：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动，进行大量的复制成为营养噬菌体核酸，并接着成 熟为噬菌体粒子，引起宿主细胞裂解。 溶源转变：当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状 的现象，称为溶源转变。 包涵体：表达外源基因的宿主细胞。 二、填空题 1.病毒分为真病毒（简称病毒）和亚病毒分子，后者又分为类病毒、拟 病毒、卫星病毒、卫星RNA 和朊病毒。 2.病毒直径很小，通常用nm 作为度量单位，最大的病毒为似菌病毒和一 种海洋原生病毒，最小的病毒为猪圆环病毒（PCV）和长尾鹦鹉喙羽病 毒（PBFDV），病毒、细菌和真菌个体直径比约1：10：100 。
疫苗生产用Vero细胞的控制
加强疫苗生产用Vero细胞的控制 洪小栩李琦涵 摘要：目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系、二倍体细胞系和传代细胞系。近年来，Vero细胞作为连续细胞系在我国越来越多地用于人用疫苗的生产。由于Vero细胞具有污染内源性或外源性感染因子以及细胞残留蛋白和DNA 具有潜在致瘤性和致癌性的风险，因此， Vero细胞系作为疫苗生产用细胞基质的安全问题备受关注，加强生产用Vero细胞库的管理和控制；优化疫苗生产工艺，提高对细胞残余蛋白和DNA的去除能力；执行严格的残留量限定标准，对保证Vero细胞生产疫苗的安全性具有重要意义。 关键词： Vero细胞、病毒性疫苗、致瘤性、致癌性 Strengthening the Control on the Vero Cell Used for the Production of Viral Vaccines Hong Xiaoxu Li Qihan Abstract: At present, the major cell substrates used for the traditional production of viral vaccines including the primary cell lines, diploid cell lines and continuous cell lines. The safety of the Vero cell strain is the main concerned on the potential risks of the endogenous and exogenous virus contamination, as well as the tumorigenicity and oncogenicity properties induced by the residual cellular protein and DNA. As this result, it will play very important role on improving the safety of viral vaccines by strengthening the management and control of the Vero cell bank, improving the production process, enhancing the ability of the removing the residual cellular protein and DNA, and carrying out the strict limit standard. Key words: Vero cell, viral vaccine，tumorgenicity, oncogenicity 作者单位：100060.北京. 国家药典委员会（洪小栩）；650118 昆明，中国医学科学院医学生物学研究所（李琦涵） 通信作者：洪小栩， Email： hongxiaoxu@https://www.wendangku.net/doc/025183776.html,
病毒毒性疫苗制造技术
病毒性疫苗制造技术 任务一灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活 ↓ ↓ 配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩 工序一菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。 实例大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。 工序三菌数计算 采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的细菌总数。 工序四灭活与浓缩 对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌的目的。灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓缩1倍以上。 工序五配苗与分装
第三章DNA的复制
第三章DNA的复制 蒋毅水产本101班 1012405101 3.1DNA复制的基本特征 3.1.1DNA的半保留复制 DNA复制过程中亲代DNA的双链分子彼此分离，作为模板，按AT配对，CG配对的原则，合成两条新生子链，并称这种方式为半保留复制。 3.1.2DNA复制按5＇→3＇延伸方向 3.1.3DNA的半不连续复制 双链DNA分子的复制是分别以两条极性相反的单链分子为模板，按5’→3’的延伸方向合成新生单链DNA分子。 3.1.4DNA复制的起点、方向 DNA复制的起点，方向和模式等有关的研究是利用条件型复制突变体展开的。 3.1.5DNA复制的引物 M13噬菌体是一直单链DNA病毒，利用寄主细胞内的各种酶类和底物，复制一条负链DNA，形成复制型（RF），再按双链DNA复制模式进行DNA分子的复制。 3.1.6DNA复制的转录激活 双链DNA分子复制起始时从复制远点处双链DNA分子解链，前导链在一段RNA引物的发动下按连续合成的模式完成合成过程，而后随链是按不连续合成的模式不断地完成冈崎片段的合成，而每一个冈崎片段都需要有RNA引物的发动过程。 3.1.7DNA复制的模式 3.1.7.1新起始方式或复制叉式 每次复制的起始均从一个固定复制起点开始，转录激活作用使双链DNA开链，启动前导链的联想复制并在两个方向形成复制叉，后随链按不连续方式合成冈崎片段。 3.1.7.2滚环方式或共价延伸方式 单链环状DNA病毒的复制主要以滚环方式或共价延伸方式进行DNA分子的复制。噬菌体和真核生物的rDNA的扩增是采用滚环复制的方式。 3.1.7.3置换式或D环方式 真核生物线粒体源于原核生物，其DNA也是环形的，但其复制却采用置换式进行。 3.1.8DNA复制体的结构与复制的回环模型 DNA的复制是由多种酶类共同参与的一个复杂的酶促反应过程，而且包括DNA聚合酶，引物的引发酶，DNA解旋酶，单链结合蛋白，链接酶等在内的如此众多的酶分子均集中在复制叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程。 3.1.9线形DNA复制避免5’端短缩的方式 共联体假说认为在线状DNA分子的两端具有丰足末端，从而保证了合成的两条子代DNA分子在5’末端的单链缺口处互补，形成共联体。
轮状病毒疫苗有效性试验
轮状病毒疫苗有效性试验 *导读：轮状病毒疫苗的免疫接种对象为2个月以上的儿童，主要为6个月至3岁的婴幼儿。接种方式为口服；免疫程序为每次一剂，每年免疫一次。发烧、患严重疾病、胃肠疾患、严重营养不良、有免疫缺陷和接受免疫抑制剂治疗者不要接种或暂缓接种。…… 在10个拉美国家进行的一项儿童轮状病毒疫苗试验表明，在儿童处于最容易出现轮状病毒肠胃炎的年龄，它能起到效果。 该研究发表在4月5日出版的爱思唯尔期刊《柳叶刀》（The Lancet）杂志上，共有超过1。5万名6到13周的新生儿参与试验。参与者在大约两个月和四个月的时候随机接种了两剂Rotarix或者安慰剂，并进行了两年的随访。Rotarix是葛兰素史克公司开发的一种口服轮状病毒减毒活疫苗。 来自阿根廷、巴西、智利、哥伦比亚、多米尼加共和国、洪都拉斯、墨西哥、尼加拉瓜、巴拿马和委内瑞拉的儿童参与了该试验。试验证明该疫苗可以在这两年内防止大约80%的严重轮状病毒肠胃炎和83%的住院治疗。 此前的研究使用了同种疫苗和另一种墨克公司开发的名为RotaTeq的疫苗，它们也表明了疫苗在出生后的头一年具有保护作用。但是在每年有1。5万人死于轮状病毒的拉丁美洲，轮状病毒肠胃炎的发病高峰出现在6到24个月的年龄段——这意味
着至少要在出生后的头两年提供保护。 来自智利大学的研究参与者之一Miguel O'Ryan说：“在其它拥有中等收入人口和与拉美国家文化背景类似的发展中国家可能也会得到相似的结果。”但是Miguel O'Ryan还说：“还需要在严重营养不良和卫生设施薄弱的国家进行类似的实验，从而对这些结果加以补充。” 这种疫苗是根据最常见的轮状病毒毒株制成的，而且在两年的时间里也能很好地保护人体不受其它一些毒株的感染。但是它对一种更罕见的毒株的防御作用较低。科学家说对这种毒株需要更多的研究。 在同期杂志的一篇评论中，来自澳大利亚昆士兰儿科传染病实验室的Keith Grimwood 和Carl Kirkwood写道，在非洲和亚洲的轮状病毒毒株具有更高的多样性，每年有41。3万人死于轮状病毒，在这些地区的试验结果对于评估这种疫苗的有效性具有更加重要的意义。
第三章 病毒的复制.
第三章病毒的复制 第一节研究病毒复制的一般性方法 1.1建立病毒复制的实验研究系统 研究病毒的常用培养系统 ①噬菌体——细胞培养系统 用该系统研究噬菌体复制的优点： 敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制； 噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察； 噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。 噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。 ②动物病毒—动物细胞培养系统 目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。 在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。 ③植物病毒—原生质体培养系统 高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。 植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。 采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。 无论是哪种培养系统，都要考虑： ①宿主细胞的敏感性与生理状态 ②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。 感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律） 以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期) 潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间