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烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养

一、实验原理与实验步骤

在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

植物材料：烟草植株

药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞

仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子

二、实验方法与步骤

注意：

1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2、微量元素母液的配制

按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签

3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。

（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。

生长调节剂母液配制：

为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。

不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。

称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。

三、培养基配制和灭菌

本次实验使用

（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；

（3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。

注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。母液吸取量的计算

配制培养基的升数

公式1：母液吸取量= 母液体积（CC）×（配制培养基的升数/母液浓缩倍数）

公式2：母液吸取量= （培养基要求的含量/ 母液每CC的含量）（各种生长调节剂）

各种母液按顺序编号排列

A. 大量元素；

B.CaCl2.2H2O；

C.微量元素；

D.铁盐；

E.有机物；

F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。

配制培养基（1000ml）

1. 琼脂: 称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.

2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水

中。

3、各种母液的吸取（培养基1L）

（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml （2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml （3）用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml

（4）移取激素

将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH 和1N HCL调整。

分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。

包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。

用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。

四、培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）

具体操作步骤：

1. 高压锅放水至平把架；

2. 把包扎好的培养基装入高压锅;

3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.

4. 然后接通电源.

5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。

6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa 时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。

7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅

内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。

8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。

灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。

进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。

五、植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌

外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。

1、接种步骤：

第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌： 70%酒精浸10-30秒→→无菌水第三步：灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗

注意事项：

1.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存。

2.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次，升汞一般5-8次，每次不少于3min 。

3.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底。

4.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。

5.灭菌液要充分浸没材料。

2、无菌操作可按以下步骤进行：

（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

六、烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化

（1）于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍3min；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分

割为1-1.5cm2的小块；接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。接入（1）中培养。

（2）约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；

（3）15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%

（4）30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点（5）60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（2）上。

（6）3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。

七、诱导生根及移栽与数据记录

取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（3）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d 后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。

烟草叶片愈伤组织诱导情况

烟草叶片愈伤组织再生植株情况

烟草叶片诱导生根情况

组培苗的炼苗方法

试管苗的炼苗和移栽一、目的要求熟练掌握组培苗移栽驯化技术。二、用品 1、材料：生根组培苗； 2、器具用品：镊子；水盆；蛭石、珍珠岩、草木灰；育苗盘；喷雾器；竹签等。三、方法与步骤（一）练苗将生根的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到室外遮阴蓬或温室中进行强光闭瓶练苗5~20天左右，遮阴度宜为50%~70%。然后打开瓶口，再放置3~7天。（二）基质灭菌将蛭石、珍珠岩和草木灰分别用聚丙烯塑料袋装好，在高压灭菌锅中灭菌20分钟，或者采用高温干热灭菌法灭菌，灭菌后冷却备用。（三）育苗盘准备取干净的育苗盘，将蛭石和珍珠岩按1：1混合，然后倒入育苗盘中，用木板刮平。将育苗盘放入1－2cm深的水槽中，使水分浸透基质，然后取出备用。（四）试管苗脱瓶用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，放入干净的小盆中。（五）移栽用竹签在基质上打孔，将小苗栽入育苗穴盘中，轻轻覆盖、压实。待整个穴盘栽满后用喷雾器喷水浇平。最后将育苗盘摆入到驯化室中，正常管理。四、作业记录试管苗移栽驯化步骤，统计移栽成活率。解释： 1、闭瓶强光练苗。当生根后或根系得到基本发育后，将培养瓶移到室外遮阴蓬或温室中进行强光闭瓶练苗5~20天左右，遮阴度宜为50%~70%。 2、开瓶强光练苗。将培养容器的盖子或塞打开，在自然光下进行开瓶练苗3~7天，正午强光或南方光照较强地区要注意采取措施如用阴蓬或温室避免灼伤小苗。如果在开盖容器中培养不超过1周，一般不会引起含蔗糖培养基的污染问题。开瓶炼苗可以分阶段进行，即首先松盖（或塞）一两天，然后部分开盖一两天，最后完全揭去盖。这种方法在相对湿度十分低的屋内特别有好处。培养容器的开口大小也影响开盖的速度，开口大的瓶盖应比开口小的瓶盖除去的速度慢一些。 3、试管苗的移栽。试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。试管苗从琼脂培养基中移出时要用长镊子小心取出，彻底清洗干净根部

植物组培实验室配置清单

植物组培实验室建设目录 1、功能简述 (1) 1)准备室 (1) 2)灭菌室 (1) 3)缓冲间 (2) 4)无菌操作室 (2) 5)培养室 (2) 6)驯化室 (3) 7)温室 (3) 8)辅助实验室（非必要） (3) ①细胞学实验室 (3) ②生理生化分析室 (4) 2、设备及耗材清单 (4) 1)试验设备清单 (4) 2)常备试剂清单 (6) ①MS培养基必备试剂 (7) ②常备激素及辅助试剂 (7)

植物组培实验室建设 1、功能简述植物组织培养实验室一般应包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，这也是组织培养实验所必须具备的基本条件。要培养成大田苗还要有相应的驯化室、温室。 1)准备室用途：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作。完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、晾置、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、落水架、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平（0.1g、0.0001g分度各一台）、干热消毒柜（可省去）、蒸馏水器（可省去）、酸度计(又称pH计，为节约成本和减少维护可用pH试纸代替)、过滤灭菌器、培养皿、培养瓶、三角瓶、试管、电磁炉、水浴锅、漏斗、量筒、刻度移液管（为操作简便起见可购买移液枪1ml、5ml各一个代替）、玻璃棒、酒精灯、镊子、试管架、琼脂、纱布、棉塞、封口膜、大量元素、微量元素、蔗糖、有机物和植物激素的母液（详细内容见附表）、NaOH、盐酸、滤纸、脱脂棉、橡皮筋、牛皮纸等。图1 准备室图2 灭菌室 2)灭菌室用途：完成各种器具的保存、培养基的灭菌等。 1

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

烟草栽培学复习

名词解释生物产量：烟草在整个生长季节中所积累的干物质重量。经济产量：单位土地面积上所收获可用干物质的重量，对烟草来说就是烟叶的产量。烟叶品质：消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。成熟度：烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映。身分：烟叶的组织构造密度，即叶肉细胞的大小及其排列的疏密程度。物理特性：叶片的厚度、叶面密度、单叶重、平衡水含量、填充值、含梗率等。评吸：通过烟叶燃吸后的烟气在经过人的口腔、鼻腔和喉部等感官时所产生的感觉评定烟叶质量的方法。劲头：烟气中的烟碱对人体器官作用时，能够引起兴奋反应的程度。刺激性：口腔、鼻腔和喉部对烟气产生的刺激感强烈冲击的接受程度。香气：烟叶燃烧后进入烟气中所表现出来的一种令人愉快的特殊芳香。吃味：烟气反映在口腔内包括酸、甜、苦等味道感觉的总称，是烟气被口腔反映的味感。种植制度：一个地区或生产单位的作物组成、配置、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。轮作：在同一块土地上于一定年限内有计划、有顺序地轮换种植不同类型作物的种植方式。套种：在前一季作物生长后期，在其预留的行间或带间套种其他作物的种植方式。壮苗：生长发育良好，新陈代谢正常，有机物质合成积累较多，内含物丰富，碳氮比协调，抗逆性强，移栽成活率高的烟苗。格盘育苗：使用由若干苗穴组成的育苗盘培育作物秧苗的方法。漂浮育苗：在温室或塑料薄膜覆盖条件下，利用成型的膨化聚苯乙烯格盘为载体，装填上人工配置的培养基质，将格盘漂浮于含有完全矿质营养的苗池中，完成烟草种子的萌发、生长和成苗过程。烟草需水量：每生产单位重量干物质由烟株蒸腾所消耗水分的数量。水分利用效率：烟株消耗单位重量水分所生产的同化物的量。圆顶：烟株打顶10-15d后，上部叶完全展开，与中部叶大小接近，烟株呈筒形的时

大樱桃组培苗炼苗技术

大樱桃组培苗炼苗技术摘要:根据大樱桃的生物学特性,通过多年大樱桃组培试管苗炼苗的试验,总结出了大樱桃组培试管苗炼苗前后的一系列管理技术。结果表明,试管苗炼苗基质的选择、试管苗温室驯化生根壮苗与开瓶炼苗这3个阶段的工作非常重要。基质选用细沙与蛭石6:4混合为宜,试管苗温室训化生根壮苗与开瓶炼苗时间以10～15d为宜,移入沙床后定期喷洒营养液和杀菌液,按照此方法进行试管苗炼苗可获得很高的成活率。关键词:大樱桃;组培;炼苗;技术方法试管苗的炼苗移栽是组织培养过程中重要的环节,这个环节最需要的是操心和细心,即对大棚温湿度操心,对瓶苗移栽各管理环节的细心,若稍有疏忽,则会造成大批幼苗死亡,使整个组培工作前功尽弃,造成巨大的损失。通过几年的实践,总结出了大樱桃试管苗炼苗的关键技术,从试管苗炼苗基质的选择、试管苗温室驯化生根壮苗与开瓶炼苗这3个阶段进行了详细介绍,为天水市优良大樱桃品种的工厂化生产提供了科学依据和技术支持。 1苗床及基质的选择 1.1苗床的制作苗床在日光温室内要做成凹畦,长6m,宽2m,畦深15~20cm为宜,将畦整平拍实后,喷洒杀虫剂500倍液,在畦内将细砂、蛭石混匀后用木板刮平,并用800倍液多菌灵液将沙床洒透,在畦上搭建小拱棚,可用扁竹或圆竹搭建,高度保持在1.50m 左右,上遮盖遮阳网。 1.2栽种试管苗的基质栽种试管苗的基质要具备透气、保湿、容易灭菌处理、不利于杂菌滋生的特点,选用珍珠岩、炉渣、蛭石、锯末、草炭土等多种基质进行试验,结果表明,最适合大樱桃组培苗生长的基质为:细沙与蛭石6:4混合,细砂为颗粒为0.10~0.20mm 的面砂。 2试管苗的移栽方法 2.1试管苗的驯化试管苗从培养架上长好后,将试管苗小心从培养架上取下,要轻取轻放,迅速转移到日光温室中,在日光温室中将瓶苗均匀地摆在地上,温度控制在15~25℃,光照强度为3 000Lx,每天中午在瓶苗周围喷洒多次雾水,达到保湿降温的效果,移到

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。三、培养基配制和灭菌本次实验使用（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

《作物栽培学》作业试题及答案

单项选择题 1、作物产量中常说的经济系数是指 1.生物产量与经济产量之比 2.经济产量与生物产量之比 3.生物产量与经济产量的百分比 4.经济产量与生物产量的百分比 2、作物品质的评价指标中，下述属于形态指标的是 1.蛋白质 2.氨基酸 3.脂肪 4.颜色 3、作物生长的“营养三要素”是指 1. C、H、O 2. N、P、K 3. S、N、P 4. N、P、S 4、下列哪种根属于产品器官 1.气生根 2.须根 3.块根

4.不定根 5、下列属于喜钾作物的是 1.水稻 2.玉米 3.马铃薯 4.小麦多项选择题 6、影响复种的条件包括 1.热量 2.水分 3.地力与肥料 4.劳畜力与机械化等 7、下列哪些作物需经过一定时期的低温诱导才能正常开花结实。 1.大麦 2.小麦 3.黑麦 4.油菜 8、作物的播种方式包括 1.插播

2.条播 3.点播 4.重播 9、下面哪些材料可用于繁殖下一代 1.颖果 2.块茎 3.块根 4.鳞茎 10、按照土壤质地进行分类，一般可以把土壤区分为下列几大类 1.砂土类 2.黑土类 3.壤土类 4.黏土类 11、根据作物对二氧化碳同化途径的特点，下列哪些作物属于C3作物 1.小麦 2.大豆 3.玉米 4.棉花 12、间作与套作不相同点在于 1.共生期长短不一样 2.熟制不一样 3.复种指数不一样

4.前者是成行种植，后者是成带种植 13、关于土壤质地下列表述正确的是 1.沙质土壤结构良好，保水保肥。 2.壤质土耐旱耐涝，适耕期长。 3.黏质土吸附作用强，保肥性好。 4.沙质土壤保水不保肥。 14、下列属于长日照作物的是 1.小麦 2.烟草 3.大麦 4.油菜 15、种子萌发必不可少的因素包括 1.光照 2.温度 3.水分 4.氧气 16、从引种角度看，短日照作物由北方向南方引种，下列表述正确的是 1.生育期缩短 2.生育期延长 3.生育期不变 4.营养生长期缩短 17、按照作物“S”生长进程，下列说法正确的是

烟草栽培学烟草生物学特性

第二章烟草生物学特性我国的烤烟、晒烟和晾烟，绝大多数属于普通烟草，只有花色呈黄色的烟草属于黄花种。还有少数种如异香烟草（N. alatalioketotto）、美花烟草（N. sylverstris spegetcomes）和香花烟草（N. suaveolens Lehn）等，因其花色美丽作为观赏植物栽培。对红花烟草较全面的分类方法是Wilson和Loomis提出的以下分类，界：植物界；亚界：有胚植物亚界；门：维管植物门；亚门：羽叶亚门；纲：被子植物纲；亚纲：双子叶亚纲；目：茄目；科：茄科；属：烟草属；种：红花烟草种。第一节烟草的植物学特征特性烟草是多年生植物，在120~130天的大田生育期中，生长成为比种子大3000万倍的庞大植株，平均每小时增长约为种子的万倍。烟草株高叶大，需水肥很多。因此，根系在烟草一生中就显得更重要。一．根（一）根的形态 1．根的分布烟草的根属圆锥根系，由主根、侧根和不定根三部分组成(见图)。烟草种子萌发时，胚根突破种皮后直接生长而成主根，主根产生的各级大小分支都叫侧根，由茎上发生的根都叫不定根。根系的密集范围比分布范围小得多，根系密集深度约在地表以下40cm，密集宽度在距茎周40cm范围，打顶以后有根系伸长到40cm以下或40cm以外。烟草的发根能力很强，采用培土的方法可使茎秆上长出很多不定根，起到充分吸收表土营养的作用。 2．烟根的初生构造根尖由根冠、生长点、伸长区和根毛区组成，从横切面看，烤烟根的初生结构由表皮、皮层和中柱三部分组成。 3．烟根的次生构造主根和侧根在完成了初生生长后，还会进一步进行次生生长，使根的直径增粗，并形成次生维管组织和周皮等次生结构。次生构造是由维管形成层和木栓形成层分化而成，在根毛区上方开始出现。维管形成层向内产生次生木质部，向外产生次生韧皮部，形成根的次生维管组织；木栓形成层向外产生木栓层，向内产生栓内层，形成根的周皮。（二）根的发生烟草种子由种皮、胚和胚乳三部分组成。胚根正对着种孔。在适宜的温、湿度和气体交换条件下，种子吸收水分开始萌动，胚根突破种皮伸长出来，胚根突出种皮后即向地弯曲并垂直向下生长，就形成了主根。主根入土之后可以不断地形成侧根，侧根起源于中柱鞘，在根毛区的上部开始出现。不定根是由移栽时埋于土层下方的茎上产生的，数量充足但分布较浅。在幼苗生长的中后期，根系水平生长速度大于垂直生长，7叶期比5叶期根深增长了1.5倍，水平生长增长了1.8倍，9叶期比5叶期根深增长了1.6倍，而水平生长增长了2.6倍。烟苗移栽到大田后，由于主根被切断，主根停止伸长，侧根大量发生，活力很强。在适

亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

烤烟栽培学(题库)

名词解释 1、烟叶品质 2、外观质量 3、成熟度 4、种植制度： 5、轮作制度 6、壮苗： 7．烟草漂浮育苗8．早花9、烤烟产量10、外观质量： 11、身份12、油分13、弹性：14、物理特性： 15、评吸： 16、劲头： 1 7、刺激性： 1 8、苦味和辣味： 1 9、香气： 20、杂气21、吃味： 22、燃烧性： 23、阴燃性： 24、连作： 25、轮作： 26、间作： 27、套种： 28、格盘育苗： 29、托盘育苗30、需水量： 31、耗水量： 32、水分利用效率： 33、团棵： 34、旺长： 35、圆顶： 36、底烘：37．烟叶的吸湿性38．烟草的弹性39．烟草湿润育苗40．烟叶的外观质量41．晒烟42．包衣种子43．烟草优质适产44．烟草的内在质量45．烟草漂浮育苗46．早花简答题 1.简述烟草根的初生构造和次生构造。 2.简述烟草根的生理机能。 3.简述烟草叶的构造及其生理机能。 4.简述烟草种子的萌发过程及其需要的条件。 5.简述环境条件对烟草生长发育的影响。 6.如何进行烟叶质量评价? 7.如何统一烟叶产量与质量的矛盾? 8.简述烟草产量与质量的关系。 9.烟草轮作、倒茬的意义。 10.烟草连作的危害有哪些？轮作有哪些优点？ 11.简述确定烟草移栽期的依据？ 12.简述育苗的要求及壮苗的标准。 13.如何正确决定大田期施肥量和氮、磷、钾搭配比例？ 14.简述烤烟测土配方施肥方法？ 15.简述烤烟大田需水规律和需肥规律？ 16.试述烟草大田期生长特点与管理要点。 17.烟草为什么要中耕培土，中耕培土的主要技术有哪些？ 18.试述烟田深耕的作用和技术。 19.烤烟生产时中如何划分生育期？ 20.如何确定烟草的移栽期。 21.试述打顶抹杈作用？ 22.如何决定烤烟打顶高度和留叶数？ 23.早花发生的原因及弥补措施，生产上如何避免早花的发生？ 24.如何预防烟叶底烘。 25.简述烟草地膜覆盖栽培技术。 26.分析烟田地膜覆盖栽培的优点和缺点。 27、请你根据田间烟株长势和土壤肥力情况，说明如何进行封顶打杈？（7分） 28、试论影响烟叶烟碱含量的主要因素。（5分） 29、试述烤烟进行中耕有什么作用？中耕的技术及要求有哪些？（6分） 30、请你说出硝态氮和氨态氮对烤烟生长发育的影响。（5分） 31.简述烟草的类型及其特点。 32简述烟草的生产特点。 33.简述烤烟烟区划分的依据。 34.全国烤烟种植最适宜和不适宜类型的条件？ 35.我国主栽的烤烟品种有哪些？ 36.简述烟草花的构造及其开花习性。 37.简述根、茎、叶生长的相关性。 38.简述烟草群体与个体的关系。 39.在轮作周期中确定烟草前作的原则。 40.烟稻轮作制和烟草三年五熟轮作制的优点。 41.简述烟草必需营养元素的营养作用。 42.为什么说氮素是烟草最重要的营养元素？ 43.根据烟草的需肥规律如何进行烟田施肥？ 44.如何确定烟草的施肥量？ 45.影响烟草养分吸收的因素有那些？ 46.比较烟草硝态氮和铵态氮营养的异同。 47.根据有机肥的特点，烟田应如何施用？ 48.简述烟田施用饼肥的优点及其使用方法。 49.简述优质烤烟生产的土壤条件有哪些？ 50.试述烟草对干旱胁迫的反应。 51.根据烟草的需水规律如何进行合理灌溉？ 52.简述烟田整地的方法和作用。 53.简述影响烤烟种植密度的因素。 54、试论影响烟叶烟碱含量的主要因素。（5分） 55、请你根据烤烟品种红花大金元的的品种特性谈谈其栽培和烘烤技术要点。 56、简述优质烤烟生产的土壤条件有哪些? （5分） 57、.简述烤烟大田需水规律和需肥规律。（5分） 58、优质烤烟生产所需的光照条件及云南烟区在这方面的自然优势有哪些? 59、试述优质香料烟生产的生态环境条件以及主要栽培措施（7分）。 60、概述烟叶品质评定的内容。（5分） 61、试述烟草漂浮育苗技术体系构成。（7分） 1、烟叶品质：是消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。通常包括外观质量和内在质量两个方面， 2、外观质量：指烟叶的商品等级质量，如烟叶的成熟度、身份、结构、部位、颜色等表现出的优劣程度。 3、成熟度：是烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映，成熟度好的烟叶颜色均匀一致，叶片正反面颜色差异小，油份足，色度浓，香气质好量足，吃味醇和，杂气和刺激性小。 4、种植制度：是指一个地区或生产单位的作物组成、配臵、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。 5、轮作制度：是指在一个轮作周期中，各种作物合理的安排顺序和田块布局。 6、壮苗：是指生长发育良好，新陈代谢正常，有机物质合成、积累较多，内含物丰富，碳氮比协调，抗逆性强，栽后成活率高的烟苗。 7．烟草漂浮育苗——所谓漂浮育苗，即采用质地很轻的泡沫塑料制成育苗盘，育苗盘的空穴中装上基质(人造土壤)，种子播种在基质内，然后将育苗盘移到育苗池中漂浮在营养液表面完成整个育苗过程。 8．早花——烟株未达到正常栽培条件下应有的叶数和高度，就提前现蕾开花，称为早花。它是营养生长受阻，生殖生长加速的结果。早花烟株矮小，叶数锐减，叶窄而薄，对产质影响很大。 2、烟制品的主要类型有卷烟，斗烟，水烟，雪茄，嚼烟，鼻烟。 3、确定烤烟移栽期的依据有气候条件、种植制度、品种特性、育苗技术、成苗因素。 4、烟草幼苗生长的最适温度是25-28℃，育苗期间低于2℃的低温和高于35℃的高温会引起冻害和灼伤幼苗。 5、优质烤烟生产所需的光照条件是和熙的光照。日照时数是500-700小时，日照百分率是40%；其中成熟期日照时数是280-300小时，日照百分率是30 %。 6、随着烟草种植密度的增加，烟田小气候中风速变小、地温降低、相对湿度增大。 7、全国烤烟适宜生态类型划分中，最适宜区的条件是1、无霜期≥120天；2、≥10°C积温＞2600°C；3、日均温≥20°C持续日数≥70天；4、0-60厘米土壤含CL量＜30mg/kg; 5、土壤PH5.5-6.5；6、地貌类型：中低山、低山、丘陵、高原；7、烟叶内在质量：香气质好，香气量足，吃味纯净。 10、影响烟草种子出苗的外界环境因素主要温度、水分和氧气（空气）。 11、烟草生产有产量与品质并重、生产工序复杂、对环境条件敏感、技术性强、烟叶的经济价值高的特点。 13、烟叶的产量是由单位面积上的株数，单株留叶数，单片叶的重量三部分所构成的。 14、烤烟的优质适产是指产量最高点与品质最高点既经济又合理地统一在一个水平上。 15、烟草适宜的前作有水稻，小麦，油菜等。 17、按调制方法分类，白肋烟属于晾烟，香料烟属于晒烟，黄花烟属于晒烟。 18、按调制方法和主要用途，烟草类型有烤烟、晾烟、晒烟、熏烟。 21、烟叶腺毛分泌物的主要成分是芳香油，树脂，蜡质。 25、烟田管理的“三一致”是指烟苗大小一致，烟株高矮一致，同部位烟叶成熟一致。 29、烟草种子萌发的三个过程是物理吸水阶段，营养物质转化的生化阶段，生理活动的生长阶段。 30、烟草根系生长的最低温度是7oC，最适温度是31oC，最高温度是43oC。 44、理想型烟株的特征为下部叶阳光充足，上部叶叶片开展，整株叶厚薄适中。 47、红花烟草属于植物界维管植物门被子植物纲双子叶亚纲茄科，烟草属。人工栽培的是红花烟草和黄花烟草。 48、烟草的根由主根、侧根、不定根三部分组成。 52、烟草的苗床期指从出苗到成苗。可分为小十字期、大十字期、猫耳期、成苗期四个生育时期。 53、烟草育苗中锻苗的方式主要有断水炼苗、揭膜锻苗和剪叶锻苗。 54、烟叶育苗的要求是苗壮、适时、量足、整齐和大小适宜。 55、生产中主要采用的育苗方式有漂浮育苗、水旱两段育苗和常规育苗等。 56、烟草漂浮育苗的壮苗的标准是根系发达、茎粗壮而柔韧、有一定的叶片数，叶色正常、抗逆性强。 57、烟草大田施氮量的确定是根据理论产量、土壤速效养分和土壤养分利用率和所用肥料利用率来确定的。 58、应变施肥主要是指看天施肥、看地施肥和看烟施肥。 59、按照烤烟大田施肥的时期分为基肥、前期追肥和叶面追肥等。施肥方法分为撒施、条施、穴施、肥料溶液灌根和肥料溶液喷施等。 61、移栽期的确定要依据气候条件、种植制度、品种特性和播种期综合考虑。 62、烟草对水分的消耗包括地表蒸发和叶面蒸腾两个方面，前者指土壤水分通过地表面蒸发散失，称为生态耗水；后者指水分通过烟株表面（主要是叶片）而散失，称为生理耗水。 64、烟田灌溉方法有穴灌、沟灌、滴灌和喷灌等。 65、烟草的早花是指烟株未达到正常栽培条件下本品种应有的高度和叶数就提前现蕾、开花的异常现象。 66、早花产生的原因是生理特性、品种特性、气候条件、栽培条件等四方面的原因。 67、烟草的底烘的指烟株下部叶为达到正常成熟时期就提前发黄或枯萎的现象。 68、底烘发生的原因有光照不足、土壤水分不足和水分过多等。 69、打顶技术包括打顶的时期、打顶的高度和留叶多少等。 73、香料烟具有特殊的浓香的特点，植株上部部位烟叶品质最好。 1、评定烟叶品质包括外观质量、内在质量、烟叶的化学成分、烟叶的物理特性、烟叶的安全性五个方面内容。 2、“两烟”是指烤烟和卷烟。

烟草栽培学复习

◆名词解释生物产量：烟草在整个生长季节中所积累的干物质重量。经济产量：单位土地面积上所收获可用干物质的重量，对烟草来说就是烟叶的产量。烟叶品质：消费者对烟叶燃吸过程中所产生的香气、劲头、吃味、刺激性等几个主要因素的综合感受和吸烟安全性的综合评价。成熟度：烟叶在田间发育过程中形成质量水平的反映。身分：烟叶的组织构造密度，即叶肉细胞的大小及其排列的疏密程度。物理特性：叶片的厚度、叶面密度、单叶重、平衡水含量、填充值、含梗率等。评吸：通过烟叶燃吸后的烟气在经过人的口腔、鼻腔和喉部等感官时所产生的感觉评定烟叶质量的方法。劲头：烟气中的烟碱对人体器官作用时，能够引起兴奋反应的程度。刺激性：口腔、鼻腔和喉部对烟气产生的刺激感强烈冲击的接受程度。香气：烟叶燃烧后进入烟气中所表现出来的一种令人愉快的特殊芳香。吃味：烟气反映在口腔内包括酸、甜、苦等味道感觉的总称，是烟气被口腔反映的味感。种植制度：一个地区或生产单位的作物组成、配置、熟制与种植方式的总称，包括因地种植、轮作倒茬、间作套种、混作和复种等内容。轮作：在同一块土地上于一定年限内有计划、有顺序地轮换种植不同类型作物的种植方式。套种：在前一季作物生长后期，在其预留的行间或带间套种其他作物的种植方式。壮苗：生长发育良好，新陈代谢正常，有机物质合成积累较多，内含物丰富，碳氮比协调，抗逆性强，移栽成活率高的烟苗。格盘育苗：使用由若干苗穴组成的育苗盘培育作物秧苗的方法。漂浮育苗：在温室或塑料薄膜覆盖条件下，利用成型的膨化聚苯乙烯格盘为载体，装填上人工配置的培养基质，将格盘漂浮于含有完全矿质营养的苗池中，完成烟草种子的萌发、生长和成苗过程。烟草需水量：每生产单位重量干物质由烟株蒸腾所消耗水分的数量。水分利用效率：烟株消耗单位重量水分所生产的同化物的量。圆顶：烟株打顶10-15d后，上部叶完全展开，与中部叶大小接近，烟株呈筒形的时期。底烘：烟株下部叶未达到正常成熟时期就提前发黄或枯萎的现象。早花：烟株未达到正常栽培条件下本品种应有的高度和叶数就提前现蕾、开花的异常现象。有效积温：作物某个发育时期或全部生育期内有效温度的总和。 ◆简答题 1.简述苗床期烟草的生长发育特点和管理要点。烟草苗床期可划分为4个阶段，根据各阶段烟苗的生长特点进行管理。出苗期：主要是种子萌发和幼苗出土过程，烟苗由异养向自养过渡。应密封薄膜保温保湿。十字期：烟苗生长缓慢，要求较高的温度和湿度条件，应密封薄膜保温保湿，当膜内温度超过30℃时应及时通风降温，防止烧苗。生根期：烟苗根系生长活跃，茎叶生长速度较慢，应控水促根，及时间苗、定苗，加强通风，揭膜晒苗。成苗期：烟苗地上部分生长速度较快，应加强练苗，及时修剪，锻苗健壮。 2.简述以烟为主耕作制度建立的原则。（1）为烟草选择一个好前作：前作氮素的残留量不能过多；前作与烟草不能有同源病虫害。（2）烟田生态条件要良性循环：秸秆还田改良土壤；种植豆科等调节矿质营养的作物；陪伴绿肥种植改良土壤。（3）优化布局，相对集中：以村民组为单位安排轮作布局；交通、水利建设配套；烤房群落布局合理。（4）轮作周期时间3年以上：缓解消除病害的需要；作物间营养调节的需要。 3.简述烟草中耕培土的作用和方法。（1）破除土壤板结，疏松土壤，增大土壤通透性。（2）提高地温，促进土壤养分释放。

组培苗的炼苗方法图文稿

组培苗的炼苗方法集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

试管苗的炼苗和移栽一、目的要求熟练掌握组培苗移栽驯化技术。二、用品 1、材料：生根组培苗； 2、器具用品：镊子；水盆；蛭石、珍珠岩、草木灰；育苗盘；喷雾器；竹签等。三、方法与步骤（一）练苗将生根的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到室外遮阴蓬或温室中进行强光闭瓶练苗5~20天左右，遮阴度宜为50%~70%。然后打开瓶口，再放置3~7天。（二）基质灭菌将蛭石、珍珠岩和草木灰分别用聚丙烯塑料袋装好，在高压灭菌锅中灭菌20分钟，或者采用高温干热灭菌法灭菌，灭菌后冷却备用。（三）育苗盘准备取干净的育苗盘，将蛭石和珍珠岩按1：1混合，然后倒入育苗盘中，用木板刮平。将育苗盘放入1－2cm深的水槽中，使水分浸透基质，然后取出备用。（四）试管苗脱瓶用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，放入干净的小盆中。（五）移栽用竹签在基质上打孔，将小苗栽入育苗穴盘中，轻轻覆盖、压实。待整个穴盘栽满后用喷雾器喷水浇平。最后将育苗盘摆入到驯化室中，正常管理。四、作业记录试管苗移栽驯化步骤，统计移栽成活率。解释： 1、闭瓶强光练苗。当生根后或根系得到基本发育后，将培养瓶移到室外遮阴蓬或温室中进行强光闭瓶练苗5~20天左右，遮阴度宜为 50%~70%。 2、开瓶强光练苗。将培养容器的盖子或塞打开，在自然光下进行开瓶练苗3~7天，正午强光或南方光照较强地区要注意采取措施如用阴蓬

或温室避免灼伤小苗。如果在开盖容器中培养不超过1周，一般不会引起含蔗糖培养基的污染问题。开瓶炼苗可以分阶段进行，即首先松盖（或塞）一两天，然后部分开盖一两天，最后完全揭去盖。这种方法在相对湿度十分低的屋内特别有好处。培养容器的开口大小也影响开盖的速度，开口大的瓶盖应比开口小的瓶盖除去的速度慢一些。 3、试管苗的移栽。试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。试管苗从琼脂培养基中移出时要用长镊子小心取出，彻底清洗干净根部（因为残留的蔗糖和营养会成为潜在的致病微生物的生长培养基，洗不净容易引起移栽苗烂根死亡），并且避免损坏根系。之后直接移栽或使用0.1%~0.3%的高锰酸钾或多菌灵等杀菌剂溶液中清洗，然后用清水清洗后移入苗床或盆钵，也可用水清洗后用多菌灵溶液浸泡10~30分钟后移栽，栽后淋足定根水。炼苗在塑料薄膜（或玻璃）温室内或遮阴网室内进行，使用温室或温棚时应注意设置通风口，防止浇水后高温引起萎蔫及高湿引起烂苗。生长基质应当具有适合的pH值、多空隙、良好的排水和通气性能，如一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些基质在使用前应高压灭菌，或用至少小时烘烤来消灭其中的微生物。由于移出的试管小植株极容易感染病，所以生长环境的卫生状况和病害防治对移栽能否成功十分关键。通常对生长基质、培养容器和苗床进行消毒处理，采用新的培养容器或聚乙烯薄膜效果都很好，必要时可喷施稀的杀菌剂。 4、移栽后的管理。移出的试管苗一般在炼苗前4周遮阴要达到50%~90%，并采用喷雾洒水保持一定的湿度（85%左右），之后逐渐降低湿度和增强光照。湿度降低幅度及光照增加量依不同植物而定，总体上应促使老叶缓慢衰退并同时产生新叶。如果降低或增加过快，会使叶片褪绿和灼伤，缓苗期延长，甚至导致移栽苗死亡。但是，只要小植株能够忍受，尽可能高的光照水平是有利的。温度不应低于20℃，最好达到25~30℃。但温度湿度过高易于滋生杂菌，造成苗霉烂或根茎处腐烂，因此应对温度加以控制。遮阴和调节湿度（喷雾或塑料薄膜覆盖）也有助于控制温度。在炼苗时可适当施用大量和微量元素，如采用1/4或

烟草瞬时转化相关文献

Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y

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