实验 2 大肠杆菌质粒DNA的提取

实验 2 大肠杆菌质粒DNA的提取

1.实验目的

学习提取质粒DNA的方法，并掌握提取质粒DNA的原理。

2.实验材料、主要仪器及试剂

材料：

pUC系列质粒

主要仪器：

超净工作台、低温离心机、恒温水浴锅、微量移液器、培养箱、摇床、紫外观测仪和琼脂糖凝胶电泳系统等。

主要试剂：

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L Tris·HCl（pH8.0）

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

灭菌后4℃保存

（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（现用现配）

1% SDS（pH值12.6）

（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml（pH4.8）

（5）LB培养基

4.质粒DNA提取与回收

（1）菌体的培养与收集

从LB平板上挑细菌单菌落，接种于5ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，37℃250r/min，过夜培养，用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的OD620=0.2～0.6时为对数期的菌液。也可取1/100的过夜菌液，继续摇瓶培养2.5h，此时菌液达对数期。

取1.2ml菌液，5000r/min 4℃离心10min，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用STE或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集细菌后可选择以下方法提取质粒。

（2）质粒DNA的提取（碱裂解法）

①将收集的细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中，强烈振荡混匀；

②加入200ul新配的溶液Ⅱ于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min或冰上放置3min

③加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5～10次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上5～10min。

④12 000r/min离心10min，取上清。用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。

⑤12 000r/min 4℃离心5min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇，室温30min。

⑥12 000r/min4℃离心10min，弃上清，吸净管壁上的水。

⑦加入500μl 75% 乙醇洗2次，气干。

⑧溶于50μl TE中（含RNase 20μg/ml），-20℃保存中使RNA逐渐降解。

交实验报告

作业

（1）提取的质粒DNA的质量与产量与哪些因素有关？为什么要用对数期的菌液提取质粒？

（2）碱法提取质粒DNA过程中，加入的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的各有何作用？（3）为何要纯化质粒DNA？

（4）碱裂解法的原理是什么？

（5）碱裂解法中溶液Ⅱ变性时间为什么不易过长？