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花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达

698植物生理学通讯第43卷第4期,2007年8月

(大连)生物工程有限公司,稻瘟霉素购自Invitrogen公司,酸洗玻璃珠、鲑鱼精DNA购自Sigma公司,培养基、聚乙二醇(PEG3350)等生化试剂购自上海生物工程有限公司。

根据HO.A序列设计简并引物,在其两端各加1个特异酶切位点EcDRI、曰口mHI,以花生总RNA为模板进行RT—RCR扩增,目的片段连接入克隆载体pMDl8一T,转化大肠杆菌DH5,挑取阳性克隆交宝生物(大连)生物工程有限公司测序,验证为正确的克隆命名为pMD/HO.A。将pMD/HDA和表达载体pYES6/CT分别用砌Ⅺ、&聊m双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收l140bp目的条带和表达载体5800bp片段,将其按5:1比例16℃连接过夜后,取10肛L转化大肠杆菌DH50【,次日PCR检菌,鉴定为阳性克隆的单菌落用质粒提取l(it提取质粒,酶切鉴定正确的质粒由宝生物(大连)生物工程有限公司测序,确定目的基因在pYES6中正确的读码框和插入方向。重组质粒命名为pYES/HO.A。感受态细胞制备采用Sangon高效感受态细胞转化Kit,重组质粒的转化、酶切鉴定及阳性克隆的筛选按常规分子生物技术进行。质粒DNA转化酵母采用改进的醋酸锂法。

重组质粒在酿酒酵母中诱导表达时,挑1个转化重组子单菌落,接入15mL含有稻瘟霉素及2%葡萄糖的SC选择性培养基中,30℃振荡过夜培养;测定过夜培养物的OD㈣值。将适量过夜培养物4000×P离心5min(4℃),弃去上清液。将细胞重悬在50mL诱导培养基中,于22℃下继续振荡培养。细胞加入诱导培养基中后于0、4、8、l2、18、24、28、32、36、42h分别从三角瓶中取5mL培养物于4℃下4000×g离心5min,弃上清液,收集的培养细胞用无菌水冲洗1次后,将细胞沉淀保存在一80℃中备用。在细胞培养过程中,每隔24h补加1次半乳糖至终浓度为2%。重组蛋白检测中必需制备的细胞裂解物用酸洗玻璃珠小规模制备酵母细胞裂解物的方法较为方便。

分析酵母油脂的脂肪酸时,取上述收集的酵母沉淀,加入适量裂解缓冲液和等体积的酸洗玻璃珠,涡旋30s,然后放在冰上30s;4min

内重复4次以裂解细胞。然后加入等体积的氯仿:甲醇:水(2:l:2)抽提,取氯仿层,加入等体积1%H:S0。一甲醇进行甲基化处理,于55℃水浴中放置

6h后,加入正已烷回溶,具体方法参见寇秀颖和于国萍(2005)一文并略有改动。脂肪酸分析用

日本岛津GC一9A和GCMA.QP5000仪器分析。

实验结果

l重组表达质粒pYES俎oIA的构建和酶切鉴定用EcDRI、B口mHI双酶切将HO.A基因从质粒pMD/HO.A上切下连入pYES6.0/CT,经质粒的

快速检测法筛选得到重组表达质粒pYES/HO.A,重组质粒经砌RI、口删HI双酶切产生1140bp和

5800bp两条片段,表明外源片段已经插入表达载体pYEs6/CT中(图1)。测序结果表明外源片段HO.A插入方向正确、插入顺序合适。

图1重组质粒pYES/HO—A的酶切电泳图谱

Fig.1Elcctropherogr锄ofrestrictionenzymes

iden衄cationofreconlbinantplas血d

M:DNAMarker;A、B:£c口RI和曰口埘HI双酶切重组质粒pMD/HO—A;C;重组质粒pMD,HO—A。

2油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

将重组质粒pYES/HO.A转化到酿酒酵母营养缺陷型INVScI,在SC固体培养基上筛选转化子,经质粒检测得到重组酵母工程菌,按前述方法进行诱导表达。从诱导后开始,每间隔4巧h取样,离心收集发酵液,用于相同条件下培养的酿酒酵母上清液作为对照。在诱导442h期间的工程菌发酵液中均可检测出重组蛋白,说明HO.A在酿酒酵母中已获得表达,以诱导36

h时的发酵液中

花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达

作者:殷冬梅, 崔党群, YIN Dong-Mei, CUI Dang-Qun

作者单位:河南农业大学农学院,郑州,450002

刊名:

植物生理学通讯

英文刊名:PLANT PHYSIOLOGY COMMUNICATIONS

年,卷(期):2007,43(4)

参考文献(17条)

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