影响PCR的因素

影响PCR反应的条件

(1) 引物: 引物就是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C 含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0、1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

(2)酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种就是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2、5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

(3)dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH 或1M Tris、HCL的缓冲液将其PH调节到7、0～7、5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其就是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

(4)模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,就是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS与蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能就是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与

蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别就是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质与其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNase降解RNA。

(5)Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性与产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1、5～2、0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

(6)温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应

中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全就是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR 失败。

②退火(复性)温度与时间:退火温度就是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物与模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:

70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子

70℃ 60 核苷酸/S/酶分子

55℃ 24 核苷酸/S/酶分子

高于90℃时, DNA 合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA 片段,延伸时间1min就是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min;扩增10Kb 需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

(7)循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

影响pcr特异性的因素

通过上述内容,可以瞧出有许多因素可以影响pcr的特异性,在此我们作一归纳,供大家参考:①退火步骤的严格性:提高退火温度可以减少不匹配的杂交,从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体就是最常见的副产品,降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发,尤其就是引物的二聚化。④改变mgcl2(有时kcl)浓度可以改进特异性,这可能就是提高反应严格性或者对taq酶的直接作用。

一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失。

Trouble shooting guide

1.假阴性,不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别就是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶与引物质量好时,不出现扩增带,极有可能就是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了

毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因为酶的活性丧失或不够而导致

假阴性。需注意的就是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,

造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要瞧OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应与引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl或100μl,应用多大体积进行PCR扩增,就是根据科研与临床检测不同目的而设定,在做小体积如20μl后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败。

物理原因:温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火与延伸温度,这也就是PCR失败的原因之一。

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使

引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功的。

2.假阳性

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其她不耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管与试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二就是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二就是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次,就是酶的质与量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时,重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度

点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸,也叫两步法)。

4.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶的量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数