丙酮酸脱羧酶
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶羧化活性的测定 一、实验原理 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶是光合作用中一个关键酶，它在Calvin 循环中催化中催化CO2的固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA)，同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核桐糖-1,5-二磷酸(RuBP)上生成1分子的磷酸乙醇酸和1分子的PGA ，这两个反应的速率由O2和CO2的浓度调节[1]。分光光度酶偶联法是根据RuBP 羧化酶催化RuBP 与CO2反应产生的磷酸甘油酸与NADH 的氧化作用相偶联的原理设计的。当加入ATP 及NADH 后，NADH 在PGK 和GAPDH 的催化下氧化为NAD+，每羧化l mol RuBP 有2 mo1 NADH 被氧化，根据在波长340 nm 处光密度的变化，可测知NADH 的数量，从而算出同化CO2的值。Rubisco 羧化活性的测定可用酶偶联法将3-PGA 的变化转换为NADH 的变化来测定。 RuBP+CO2+H2O ????→?+2 M g RuBPC ，2(3-PGA) 3-PGA+ATP ?? ???→?－磷酸甘油激酶 31,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH ??????→?－磷酸脱氢酶 甘油醛－33-磷酸甘油醛 +NAD++PO43+ 二、实验仪器及材料 2.1实验仪器 研钵、分光光度计、秒表、比色杯、冷冻离心机 2.2实验材料 小麦叶片 三、实验步骤 1.核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活性额测定 1.1称取0.1 g 新鲜叶片，放于已经预冷的研钵中。 1.2加入1 mL ，4℃提取缓冲液（50 mM Tricine-NaOH pH 7.9， 0.1% PVP-40, 5 mM MgCl2）冰上研磨，（缓冲液分3次加入，第一次0.5ml ，剩下两次分别0.25ml 将研钵冲洗干净），将研好的样品装入1.5ml 的离心管中，放于冰盒中。12000 g ，4℃，离心10 min 。取上清液备用。
交替氧化酶与丙酮酸的相互作用
从产热斑叶阿若母中纯化的交替氧化酶与丙酮酸的相互作用 关键词：交替氧化酶，作用机制，丙酮酸调节，酶的稳定性，二铁羧酸盐蛋白，产热作用摘要：植物离体线粒体的交替氧化酶活性被羧酸调控，但是反应和调控机制还不清楚。我们的研究表明，从产热斑叶阿若母肉穗花序中纯化的AOX蛋白对丙酮酸和乙醛酸敏感，对琥珀酸不敏感。缺乏丙酮酸时，AOX迅速的不可逆的失活，不管杜氢酸是否开始氧化，AOX 对杜氢酸不敏感。数据表明，丙酮酸能稳定AOX的活性构象，以单独地减少底物和产物的方式增加活性蛋白的数量，这丙酮酸对酶的表观最大速率的独特作用是一致的。 1、介绍 AOX是非电子激发的醌氧化酶，它位于高等植物、真菌和某些寄生虫（包括布氏锥虫和隐孢子虫）线粒体中。虽说两个独立的电磁共振研究证明AOX的活性中心由双核的铁中心组成，AOX的结构和机制已经被全部建立。近期具有说服力的傅里叶变换红外光谱学的证据坚定地把AOX归入了膜结合二铁羧酸蛋白这类蛋白中。 一项重要的发现表明，从植物中分离得到的线粒体表明某些羧酸强烈激发AOX的活性。在非产热物种的线粒体中，例如从大豆子叶和烟草叶中提取的线粒体AOX的活性完全依赖丙酮酸的参与。乙醛酸和其他的α-酮酸能代替丙酮酸，同时，琥珀酸可以代替丙酮酸激活土豆和产热的莲中的AOX。从产热的斑叶阿若母肉穗花序中分离的不仅表现出丙酮酸可促进得活性，还在产热增加过程中表现出丙酮酸不敏感的基本AOX的活性。 据推测，AOX和丙酮酸分子间的相互作用出现在邻近的两个关键的Cys形成含硫半缩醛时，这两个关键的Cys在许多丙酮酸敏感的AOX酶中都是保守的。人们推测，这个含硫半缩醛引起点位诱导的构象变化，这种构象变化对于激活AOX是必要的。如果用Ser替代了Cys，那么这种同功酶将不会被丙酮酸激活而被琥珀酸激活。最重要的是，我们目前对于斑龙芋AOX的研究暗示，一系列保守序列元件很可能参与丙酮酸的结合作用。 尽管，AOX和丙酮酸分子间的相互作用的结构研究有一定的进展，但是，具体丙酮酸激活AOX的机制还不清楚。人们观察到，只有线粒体泛醌库高度诱导的情况下丙酮酸才激活AOX，因此断言，丙酮酸增强了AOX与其还原底物的相对亲和力。自从张等发现用丙酮酸纯化AOX，人们一直争论丙酮酸对于AOX的最大活性具有专一性。为了把这两种观察结果解释清楚Hoefnagel 和Wiskich假想了一个模型，模型中丙酮酸通过自身的氧化泛醌产物保护酶免受失活。我们认为用实验验证这条假说非常重要。 在这篇论文中我们阐明了AOX调控，我们用的是从斑叶阿若母肉穗花序中提取的活性高、稳定性好的AOX。我们研究表明，纯化的产热的AOX的杜氢醌(DQH2)的氧化活性对于丙酮酸和乙醛酸敏感，而对琥珀酸不敏感。这种敏感性是由于缺乏丙酮酸引起的不可逆的酶失活。这种失活不需要DQH2氧化，而且对DQ的形成不敏感。因此，我们的研究结果表明，丙酮酸通过单向的减少底物和产物来稳定AOX的活性，同时，也支持了a-酮酸对于AOX的表观Vmax具有独特的影响的观点。 2、材料和方法 2.1化学药品 N,N-Bis deoxycholamide是从ICN Pharmaceuticals购买的，其他的药品都由Sigma供应。 2.2AOX纯化 如上所述，AOX是从产热的阿若母线粒体中提取纯化的。简单来讲，AOX是从产热的阿若母肉穗花序中提取的，加入2 mM的丙酮酸，-20 °C冷冻，-70 °C保存。纯化时，经证实，线粒体的活性在保存过程中全部保留。通过冻融渗透震动线粒体得到亚线粒体粒子(SMPs)，然后根据上述方法提纯AOX。AOX从deoxyBIGCHAP中溶解，然后用DEAE sepharose-based色谱分离提纯。AOX用0.5% w/v deoxyBIGCHAP洗脱。值得注意的是，纯
丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC0380 规格:50T/48S 产品内容： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体1mL×1支，-20℃避光保存； 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：粉剂×1支，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 工作液的配制：临用前把试剂四、五、六、七转移到试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。 产品说明： PDH（EC4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本的处理 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃11000g离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。 2、每个样本需要900μL工作液，按样本数加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。 3、空白管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL水，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2，计算ΔA空白=A1-A2。 4、测定管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL样本，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。 三、PDH活性计算 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T =913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.828×(ΔA测定-ΔA空白) V反总：反应体系总体积，9.5×10-4L； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.05mL；
医学生物化学02任务0001
02任务_0001 试卷总分：100 测试时间：60 单项选择题多项选择题填空选择题 一、单项选择题（共 30 道试题，共 60 分。） 1. 可经脱氨基作用直接生成α酮戊二酸的氨基酸是( ) A. 谷氨酸 B. 丝氨酸 C. 天冬氨酸 D. 乳糜微粒 E. 丙氨酸 2. 激素敏感脂肪酶是指( ) A. 组织脂肪酶 B. 脂蛋白脂肪酶 C. 胰脂酶 D. 脂肪细胞中的甘油三酯脂肪酶 E. 脂肪细胞中的甘油一酯脂肪酶 3. 正常血浆脂蛋白按密度由低到高顺序的排列为（） A. CM到VLDL到IDL到LDL B. CM到VLDL 到LDL 到HDL C. VLDL 到CM到LDL 到HDL D. VLDL 到LDL 到IDL到HDL E. VLDL 到LDL 到HDL 到CM 4. 糖尿病时，机体不可能出现的代谢改变有（） A. 糖代谢紊乱 B. 脂代谢紊乱 C. 蛋白质代谢紊乱
D. 酸碱平衡紊乱 E. 核酸代谢紊乱 5. 关于低密度脂蛋白描述正确的是( ) A. 在血浆中由β-脂蛋白转变而来 B. 是在肝脏中合成的 C. 胆固醇含量最多 D. 它将胆固醇由肝外转运到肝内 E. 含量持续高于正常者时，是患动脉硬化的唯一指标 6. 下列是生酮氨基酸的有( ) A. 酪氨酸 B. 苯丙氨酸 C. 异亮氨酸 D. 鸟氨酸 E. 赖氨酸 7. 合成脑磷脂和卵磷脂的共同原料是( ) A. 3-磷酸甘油醛 B. 脂肪酸和丙酮酸 C. 丝氨酸 D. 蛋氨酸 E. GTP、UTP 8. 脂肪酸β-氧化不需要( ) A. NAD＋ B. CoA-SH C. FAD
D. NADPH+H+ E. FAD 2H 9. 调节三羧酸循环运转最主要的酶是( ) A. 琥珀酸脱氢酶 B. 丙酮酸脱氢酶 C. 柠檬酸合成酶 D. 苹果酸脱氢酶 E. 异柠檬酸脱氢酶 10. 嘌呤环中的氮原子来自( ) A. 丙氨酸 B. 乙酰天冬氨酸 C. 谷氨酰胺 D. 谷氨酸 E. cGMP 11. 分解代谢的终产物是尿酸的化合物为( ) A. CMP B. UMP C. dUTP D. TMP E. GMP 12. 脂肪动员加强是肝内生成的乙酰辅酶A主要转变为（） A. 脂酸 B. 酮体
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)试剂盒说明书
货号：MS2203 规格：100管/96样磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PEPC（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。 测定原理： 生成草酰乙酸和HPO42-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO 2 乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，计算PEPC活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体15 mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存； 试剂三：原液10μL×1支，4℃保存； 试剂三：稀释液5mL×1瓶，4℃保存； 样本的前处理： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤和加样表： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂二瓶中加入10mL试剂一和7mL蒸馏水充分混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 （2）试剂三工作液的配制：将试剂三原液：试剂三稀释液=1μL:329μL稀释，混匀，用多少配多少。 （3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、20μL试剂三、170μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 PEPC活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 第1页，共2页
丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)试剂盒说明书
货号：QS2103 规格：50管/48样丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 测定原理： PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 试剂八：粉剂×1支，4℃保存; 工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆 器或研钵匀浆。 2、将匀浆600g，4℃离心5min。 3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。 5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W， 超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PDH活性测定。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm处，蒸馏水调零。 2、工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。 3、在1mL玻璃比色皿中加入50μL样本和900μL工作液，混匀，立即记录605nm处初始吸光 第1页，共2页
神奇的维生素C
神奇的维生素C 维生素C （以下简称维C），水溶性维生素，因能防治坏血病故又名抗坏血酸，是一种高效的抗氧化剂。大多数动物体内可自行合成，但是人类、猿猴、天竺鼠等必须从食物中摄取，维C 广泛存在于新鲜水果、绿叶蔬菜和肉类中。 大量研究结果表明，维C 具有非常重要的生理作用，表现为：促进胶原的生物合成，利于组织创伤的更快愈合。胶原对于人体的组织细胞、牙龈、血管、骨骼、牙齿的发育和修复是一种重要的物质；促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命；改善铁、钙和叶酸的吸收和利用；改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血；增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。 正因为维C 这些非常重要的生理功能与作用，使得有些人对其功能加以神化，两获诺贝尔奖的美国化学家鲍林，就是最先大剂量补充维 C 的先驱。据说他自己每天至少服用12 克维C，他认为维C 可以预防和治疗感冒乃至癌症，为此他还写了两本书来推广这个观念，引起了一场关于维C 用量与作用的大论战，持续时间之久，涉及范围之广，实属罕见。 下面，我将从有关于维C 的各个方面进行阐述，以期能够确实说明维C 对人体所起到
的正面作用于过量的危害，揭开维C “万能良药”的幌子，使人们正确认识这一种维生素。 一、维C 简介 维生素C (VITAMINUMC) 化学名：L-3-氧代苏己糖醛酸内酯 英文名：Ascorbic Acid(INN) 异名：抗坏血酸 分子式：C2H8O6 分子量：176.13 性状：本品为白色结晶或结晶性粉末;无臭,味酸,久置色渐变微黄;水溶液显酸性反应.本品在水中易溶,在乙醇中略溶,在氯仿或乙醚中不溶。 二、维C 的作用机理 这里必须要提到自由基这一名词。在细胞中游荡的自由基，会威胁到蛋白质和基因的稳定，而这两类物质正是生命的根基。已经有实验证明在心脏病、中风、癌症乃至老年痴呆等严重疾病中都发现了自由基破坏的痕迹。 维C 在人体内主要作为酶的激活剂与物质还原剂而发挥作用。它是多种自由基的清除 剂，又能与体内的维生素E 自由基起作用，使其还原为维生素E，继续发挥抗氧化剂的作用。 三、维C 的生理作用 维生素C 的生理作用多种多样，在人体新陈代谢与正常活动中起着非常重也是不可或缺的作用，已经经过确证的作用有以下这些：
浙江中医药大学临床生化与检验选择题
第十一章蛋白质和含氮化合物的生 物化学检验 ▲嘧啶核苷酸补救合成途径的主要酶是： A.氨基甲酰磷酸合成酶 B.嘧啶磷酸核糖转移酶 C.胸苷激酶 D.尿苷激酶 E.胞苷激酶 ★苯丙酮尿症的发生是由于 A.苯丙氨酸羟化酶缺陷 B.酪氨酸脱羧酶缺陷 C.苯丙酮酸氧化酶的缺乏 D.酪氨酸羟化酶的缺陷 E.苯丙氨酸转氨酶缺陷 ★苯丙氨酸检测时每个血斑直径大于多少毫米 A.8 B.7 C.10 D.6 E.9 ★下列哪种蛋白质属于负性急性时相反应蛋白？ A.C3 B.TRF C.Hp D.CRP E.CER ★动物嘌呤代谢的终产物很多，但不包括： A.尿素 B.H2O2 C.NH3 D.尿酸 E.尿囊酸 ★在急性时相反应中，以下哪项蛋白不增高 A.Hp B.ALB C.AAG D.CRP E.Cp ★血浆中Alb增高可见于 A.丢失过多 B.分解增加 C.血液浓缩 D.分布异常 E.合成不足 正确答案： C ★痛风症是因为血中某种物质在关节、软组织处沉积，其成份为 A.黄嘌呤 B.尿酸 C.尿素 D.胆固醇 E.次黄嘌呤 正确答案： B ●导致嘌呤分解增加的疾病有 A.白血病 B.红细胞增多症 C.多发性骨髓瘤 D.以上都是 E.恶性肿瘤化疗 正确答案： D ▲下列属于急性时相反应蛋白的有|C 反应蛋白|β2微球蛋白|甲胎蛋白|α1抗胰蛋白酶 |α2酸性糖蛋白 A.在急性炎症性疾病如感染、手术、创伤、心肌梗死和肿瘤等情况下，AAT、AAG、Cp、CRP、Hp以及α1-抗糜蛋白酶、血红素结合蛋白、C3、C4、纤维蛋白原等血浆蛋白浓度会显著升高；而血浆PA、Alb与TRF则出现相应的降低。这些血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白。
丙酮酸合成工艺的研究进展
科技专论 丙酮酸合成工艺的研究进展 陕西国际商贸学院（陕西咸阳） 王飞娟 张爽 王燕 【摘 要】丙酮酸是药物合成与有机合成的重要中间体。本文本要阐述其化学合成法和生物技术法合成的现状、研究进展及其发展前景，并将各种方法进行对比，目的为以后的生产、研究提供参考。 【关键词】丙酮酸；化学合成；生物技术；酶催化法；生物工程；微生物发酵法 丙酮酸[1]，又称ａ-氧代丙酸，结构为CH 3 COCOOH，是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，因分子中包含活化酮和羧基基团，所以作为一种基本化工原料广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域中[2]。丙酮酸可通过化学合成和生物技术多种方法制备。 1、化学合成法 1.1 酒石酸脱水脱羧法 此法工艺简单易行：将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即得丙酮酸。此法的特点是加入导热油之后，在一个均匀体系中进行反应，降低了反应温度，减少氧化程度，可操作性大幅度提高，适合继续反应生成丙酮酸系列产品。其缺点是丙酮酸产率较底，得1g丙酮酸需消耗5g硫酸氢钾。仅原料成本就达8万元每吨，因成本过高而无法为大多数厂家所接受。 1.2 乳酸氧化法 以乳酸为原料，氧化脱氢一步法生产丙酮酸[3]。但乳酸直接制取丙酮酸非常困难,根据工艺不同必须选用合适的催化剂。可以选择的催化剂有磷酸铁、钼酸碲盐、银、钒等[4]。此法酒石酸的氧化脱羧法相比，具有能耗低、污染小、产率高等优点，适合工业化生产。其缺点是成本也较高，约6万元每吨。 2、生物技术法 生物技术法生产丙酮酸，由于成本较低、产品质量较高、对环境污染小而得到发展，主要有酶催化法和微生物发酵法。 2.1 酶催化法 用酶或微生物细胞作催化剂,使葡萄糖或三羧酸循环的某些中间代谢产物,在一定条件下,转化为丙酮酸的技术,称为酶催化法。其主要过程是先进行小规模的微生物培养,菌体收集,直接转化或用载体包埋成固定化酶,然后转化生成丙酮酸[5]。酶催化法设备投资小,能耗低,转化率高,但底物来源较窄、成本比较高约5万元每吨，因此其进一步推广受到限制。 2.2 基因工程技术 利用基因重组技术构建高表达乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶等的基因工程菌，用于生产丙酮酸的技术。这些酶能催化乳酸与氧反应生成丙酮酸。其技术是先将乙醇酸氧化酶基因和过氧化氢酶基因分别与DNA载体重组，构成重组子，并分别转入宿主细胞，分别获得两种酶高表达的基因工程酵母，按0.713mol/LL-乳酸钠溶液每100ml加湿重转化体5g,同时加一定量渗透剂,在5个大气压下,以70psig氧压通入氧气,5℃搅拌转化4小时，丙酮酸产率大97.7%[6]。本技术底物转化率高，但技术难度大。 2.3 微生物发酵法 微生物代谢过程中,利用葡萄糖积累丙酮酸的过程称为微生物发酵法。微生物发酵法生产丙酮酸研究已有50年历史，但因丙酮酸高产菌株选育十分困难，虽有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业化要求[7]。该法生产丙酮酸真正取得突破，是在1988年时,日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原辙选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母菌株,使微生物发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992年,日本开始采用微生物发酵法生产丙酮酸[8]。产量为400吨每年,成本约为2-3万元每吨。 与化学合成法和酶转化法相比,微生物发酵法因原料来源广,能耗低,污染少,成本低而更具有优越性[9]。但微生物发酵法缺点是转化率比较低,这是因为丙酮酸是糖酵解途径的关键中间产物,在细胞中,丙酮酸作为一种重要的中间代谢产物连接了EMP和TCA中心代谢途径，又与多条分支代谢途径相关联，可转化为多种发酵产物而无法在体内积累。因此需要切断或弱化其进一步代谢,才能使其在细胞中大量积累。即加快葡萄糖向丙酮酸的转化率，减弱向TCA循环的通量，切断或减弱其分支代谢途径，促进分泌，减弱丙酮酸的再利用，最终实现丙酮酸的大量积累。为达此目的，就必须对微生物发酵法生产丙酮酸的影响因素进行研究。 微生物发酵法生产丙酮酸的影响因素有：菌种选育，营养条件，维生素水平，供氧模式，葡萄糖的质量浓度等等,其最关键的是菌种选育和营养条件[10]。 为了提高微生物发酵法生产丙酮酸的竞争力，对微生物发酵生产丙酮酸的工业化在发酵部分还需要：①进一步改善丙酮酸生产菌的产酸能力和遗传稳定性，提高糖酸转化率，缩短发酵时间；②提高生产菌对高浓度丙酮酸的耐受性，以期进一步提高丙酮酸浓度，便于下游处理；③目前原料成本中葡萄糖的费用占了很大的比例，因此，要提高生产菌株对廉价底物(如糖蜜、淀粉糖)等的利用能力。 今后的研究工作应集中在：①在保证细胞正常代谢的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化，这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件；②加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度。 随着人民生活水平的不断提高，丙酮酸的应用范围日渐扩大，需求不断增长，但丙酮酸系列产品大多需要进口且价位较高。其生产工艺的改革并实现工业化势在必行。传统工艺生产的产品质量差、成本高且对环境污染大。而生物技术法的工艺更为绿色，更为对环境友好，生物技术法新工艺取代传统工艺指日可待，前景广阔，值得进一步研究。 参考文献 [1] 胡兵，龙化云，黄光斗．丙酮酸的合成研究进展[J]．化工时刊，2003,17:18-20 [2] 刘立明，李寅，陈坚．光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸[J]．精细与专用化学品，2003,23:15-18 [3] 顾劲松，许平，李铁林，等．乳酸氧化酶转化乳酸产丙酮酸[J]．应用与环境生物学报，2001(6): 617-620 [4] 杨辉琼，易翔，郭贤烙．乳酸氧气氧化法制备丙酮酸[J]．化工世界，2002,6:307-309 [5] 穆晓清．酶促生物转化丙酮酸生产的研究[J]．工业微生物，2004,34(4),38-41 [6] Davad L A，Robert D，Vincent G W．US5,538,875[J]．1996 [7] 牟弈，诸葛健．发酵法生产丙酮酸[J]．中国酿造，2000(5): 1-3 [8] 占桂荣，高年发．不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育[J]．生物加工过程，2006,4(4): 32-36 [9] 李寅，陈坚，伦世仪．维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用[J]．微生物学报，2000,40(5): 528-534 [10] 袁辉，华子春．丙酮酸野生酵母菌的筛选及其生理生化特性研究[J]．微生物学杂志，2001,21: 12-14 192 《科技与企业》杂志 2012年1月（下）
可治性罕见病—丙酮酸脱氢酶E1-α缺乏症
可治性罕见病—丙酮酸脱氢酶E1-α缺乏症 一、疾病概述 丙酮酸脱氢酶缺乏症是一系列的较为常见的神经系统退行性病变，并伴随线粒体代谢异常的疾病，也是儿童高乳酸血症最常见的病因之一。其中，丙酮酸脱氢酶E1 -a缺乏症( pyruvate dehydrogenaseEl -a deficiency)是由于丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDH complex)中E1 -a亚基的缺陷造成的。编码El-α亚基的PDHA1基因位于Xp22.1上[1]。该病呈X染色体连锁显性遗传，其临床表现和生化缺陷存在较大的异质性。该病尚无明确的发病率和患病率报道，多为散发病例，男女发病率大致相等。 PDH复合物是细胞核基因编码的线粒体基质多酶系统，催化依赖硫胺素的丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A，将糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，在线粒体能量代谢中起重要作用。PDH复合物缺乏导致丙酮酸代谢障碍，造成乳酸堆积和能量生成不足，引起神经系统结构和功能异常。该复合物包括 3种酶：丙酮酸脱氢酶(E1酶)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2酶)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3酶)。E1酶的作用是移除丙酮酸上的羧基，并把乙酰基转给E2酶。El酶的a亚基是其活性部位，并且参与组成PDH复合物的核心结构。El-a亚基的缺陷可造成ATP生成减少和丙酮酸盐堆积，PDHA1基因突变是PDH复合物缺乏最常见的病因。ATP缺乏导致的能量供应不足对脑组织影响较大。丙酮酸盐堆积可导致丙酮酸盐、丙氨酸、乳酸之间的平衡被打破，最终引起乳酸酸中毒。ATP缺乏常引起肌张力低下、肌无力或运动不耐受等[2]。 二、临床特征 PDH复合物缺乏症患者的临床表现呈高度的异质性，发病年龄可从胎儿期至成人各年龄阶段，症状可从新生儿期的致死性乳酸酸中毒，到慢性神经功能异常伴大脑发育不全。本病一般在婴儿期和儿童早期发病，临床表现较复杂，主要累及代谢和神经系统。可有胼胝体发育不良、婴儿痉挛、Leigh病、复发性共济失调、慢性神经病变等。病情轻重及存活时间的长短取决于乳酸酸中毒的严重程度。患儿残存的酶活性越低，临床症状出现越早，血乳酸越高，死亡越早[3]。 男性患者可归纳为3类表型：一种是严重的新生儿高乳酸血症和大脑发育
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶检测试剂盒(PEP比色法)
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP比色法)简介： 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是C4植物和CAM植物固定CO2的关键酶，为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。大肠杆菌中的酶分子量约36万的四聚体，可受很多因素的影响，例如可为乙酰辅酶A活化，可受天门冬氨酸抑制。此酶是变构酶，主要功能为供给三羧酸循环以草酰乙酸，另外也与C4植物光合二氧化碳固定反应(C4二羧酸循环)及景天科植物的苹果酸形成(景天酸代谢)等有关。 Leagene磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP比色法)检测原理是利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为一种的酶显色底物，在弱碱条件下，PEPC催化PEP，形成草酰乙酸(OAA)，OAA在MDH催化下被NADH还原为苹果酸(Mal)。在碱性条件下每吸收1分子CO2伴随1分子NADH氧化，通过分光光度比色法(分光光度计)测定处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、研钵或匀浆器 2、离心管或试管 3、低温离心机 4、恒温箱或水浴锅 5、比色杯编号 名称TE0453 50T Storage 试剂(A): PEPC Lysis buffer 500ml 4℃避光试剂(B): PEPC Assay buffer40ml 4℃ 试剂(C): PEP Solution 3.5ml -20℃ 试剂(D): MDH Solution 3.5ml -20℃ 试剂(E): NADH 2支-20℃ 使用说明书1份
丙氨酸氨基转移酶(ALT GPT)测定试剂盒(丙氨酸底物-丙酮酸氧化酶比色法)产品技术要求瑞尔达
丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)测定试剂盒（丙氨酸底物-丙酮酸氧化酶比色法）适用范围：该试剂用于体外定量测定人血清中丙氨酸氨基转移酶的活性。 1.1型号 试剂1（R1）：50ml×1，试剂2（R2）： 2.5ml×1，试剂3（R3）：50ml×1 (500测试)； 试剂1（R1）：25ml×1，试剂2（R2）：1.25ml×1，试剂3（R3）：25ml×1 (250测试)。 1. 产品型号/规格及其划分说明 1.1试剂1（R1）：50ml×1，试剂2（R2）： 2.5ml×1，试剂3（R3）：50ml ×1 (500测试)； 试剂1（R1）：25ml×1，试剂2（R2）：1.25ml×1，试剂3（R3）：25ml×1 (250测试)。 2. 性能指标 【产品性能指标】 1、试剂空白：用蒸馏水调零，试剂空白吸光度值≤0.15。 2、线性区间 a)测量范围[10,100]KarU,相关系数r≥0.99； b)[10,20）KarU,测量浓度值绝对线性偏差不超过±5KarU； 3、准确度：回收率90%～110% 4、分析灵敏度：丙氨酸氨基转移酶25KarU时测定吸光度差值（△A）≥0.200。 5、精密度 a）重复性：变异系数≤10%。 b）批间差 1. 产品型号/ 规格及其划分说明 1.1 试剂 1（R1）：50ml×1，试剂 2（R2）： 2.5ml×1，试剂 3（R3）：50ml ×1 (500 测试)； 试剂 1（R1）：25ml×1，试剂 2（R2）：1.25ml×1，试剂 3（R3）：25ml ×1 (250 测试)。校准 品：1ml×1（选配）；质控品：1ml×1（选配）
丙酮酸脱氢酶复合体
丙酮酸脱氢酶复合体 成都医学院?检验医学院检验一队4班任亮 摘要：丙酮酸脱氢复合体广泛存在于动物、植物和微生物体内。主要是附着于线粒体上。丙 酮酸脱氢酶复合体是2-氧（代）酸脱氢酶复合体中的一种。丙酮酸脱氢酶复合体是一种限 速酶。主要作用是催化丙酮酸不可逆的转变为乙酰辅酶A，同时将NAD+还原成NADH，后 者进入呼吸链产生ATP。丙酮酸脱氢酶复合体还使得糖的有氧氧化中的糖酵解途径和三羧 酸循环联系了起来。 关键词：丙酮酸脱氢酶复合体；调控机制；蛋白质的结构和功能 一、丙酮酸脱氢酶复合体的组成 丙酮酸脱氢酶复合体是由三种酶以及相应的辅助因子形成，因物种的不同其各种成分的所占比例不同。丙酮酸脱氢酶复合体的分子量为7×106kDa。 第一种酶为丙酮酸脱氢酶（E1），它的辅助因子是焦磷酸硫胺素（ThDP），所以这种酶是ThDP依赖型酶。它是以α2β2四聚体的形式存在。α、β亚单位的分子量分别是41和36kDa。 第二种酶为二氢硫辛酰胺转乙酰酶（E2），它的辅助因子是硫辛酸，所以这种酶是硫辛酸依赖型酶，它的分子量是52kDa。 第三种为二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3），它的辅助因子是FAD，所以这种酶是FAD依赖型酶，它的分子量是55kDa，是以二聚体的形式存在。 此外，在高等生物的体内还有丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）、E3蛋白结合酶（E3BP）和NAD+、CoA-SH。 二、丙酮酸脱氢酶复合体的结构 每个丙酮酸脱氢酶复合体是由30个E1、60个E2和12个E3构成的，其中60个E2相互紧密连接但是以非共价键的形式形成的核心部分，而每个E2的亚单位都是由形成核心部分的内部区域和形成外部延伸部分的“Super arm”构成的，所以一个丙酮酸脱氢酶复合体就会有60个外部延伸部分。E1是以非共价键的形式连接在E2的外部延伸部分的E1结构区域。E3则是通过E3连接蛋白与E2的核心部分相连的。 三、丙酮酸脱氢酶复合体的作用机制 在丙酮酸脱氢酶复合体总的催化反应中。首先是丙酮酸在Mg2+( Mg2+结合在 ThDP 的磷酸基团上)存在下脱去的羧基与丙酮酸脱氢酶的辅助因子ThDP 形成羟乙基OThDP, 丙酮酸脱氢酶与 ThDP在α、β亚单位之间的深沟内结合。然后，羟乙基被氧化并将乙酰基转移到 E2,，即二氢硫辛酸乙酰转移酶的硫辛酰基形成中间产物乙酸硫酰胺，同时释放出ThDP，接下来在二氢硫辛酸乙酰转移酶催化下，乙酰硫酰胺上的乙酰基从乙酰硫辛酰基转移给辅酶A ，形成乙酰辅酶A。最后二氢硫辛酸脱氢酶E3 与二硫化物结合，被还原的硫辛酸重新氧化并将氢递给它的辅基FAD。在氧化和脱羧过程中硫辛酸充当乙酰基载体和电子传递体。
第7章 氨基酸代谢习题
第七章蛋白质分解代谢 复习测试 （一）名词解释 1．腐败作用 2．联合脱氨基作用 3．鸟氨酸循环 4．一碳单位 5．生糖氨基酸 （二）选择题 A型题： 1．生物体内氨基酸脱氨基的主要方式为： A．氧化脱氨基 B．还原脱氨基 C．直接脱氨基 D．转氨基 E．联合脱氨基 2．人体内氨的最主要代谢去路为： A．合成非必需氨基酸 B．合成必需氨基酸 +随尿排出 C．合成NH 4 D．合成尿素随尿排出 E．合成嘌呤、嘧啶、核苷酸等 3．转氨酶的辅酶组分含有： A．泛酸 B．吡哆醛 C．尼克酸 D．核黄素 E．硫胺素 4．可经脱氨基作用直接生成α-酮戊二酸的氨基酸是： A．谷氨酸 B．甘氨酸 C．丝氨酸 D．苏氨酸 E．天冬氨酸 5．经转氨基作用可生成草酰乙酸的氨基酸是： A．甘氨酸 B．天冬氨酸 C．蛋氨酸 D．苏氨酸 E．丝氨酸 6．ALT（GPT）活性最高的组织是： A．心肌 B．脑 C．骨骼肌 D．肝 E．肾7．AST（GOT）活性最高的组织是： A．心肌 B．脑 C．骨骼肌 D．肝 E．肾8．能直接进行氧化脱氨基作用的氨基酸是：
A．天冬氨酸 B．缬氨酸 C．谷氨酸 D．丝氨酸 E．丙氨酸 9．嘌呤核苷酸循环脱氨基作用主要在哪种组织中进行： A．肝 B．肾 C．脑 D．肌肉 E．肺 10．嘌呤核苷酸循环中由IMP生成AMP时的氨基来自： A．天冬氨酸的α-氨基 B．氨基甲酰磷酸 C．谷氨酸的α-氨基 D．谷氨酰胺的酰胺基 E．赖氨酸的α-氨基 11．在尿素合成过程中下列哪步反应需要ATP： A．鸟氨酸+氨基甲酰磷酸→瓜氨酸+磷酸 B．瓜氨酸+天冬氨酸→精氨酸代琥珀酸 C．精氨酸代琥珀酸→精氨酸+延胡索酸 D．精氨酸→鸟氨酸+尿素 E．草酰乙酸+谷氨酸→天冬氨酸+α-酮戊二酸 12．肾产生的氨主要来自： A．氨基酸的联合脱氨基作用 B．谷氨酰胺的水解 C．尿素的水解 D．氨基酸的非氧化脱氨基作用 E．胺的氧化 13．下列哪组反应在线粒体中进行： A. 鸟氨酸与氨基甲酰磷酸反应 B. 瓜氨酸与天冬氨酸反应 C．精氨酸生成反应 D．延胡索酸生成反应 E．精氨酸分解成尿素反应 14．鸟氨酸循环的限速酶是： A．氨基甲酰磷酸合成酶 B．鸟氨酸氨基甲酰转移酶 C．精氨酸代琥珀酸合成酶 D．精氨酸代琥珀酸裂解酶 E．精氨酸酶 15．氨基酸分解产生的NH 在体内主要的存在形式是： 3 A．尿素 B．天冬氨酸 C．谷氨酰胺
HPPD抑制剂的研究进展
V ol.3农药学学报N o.3 2001年9月CHI NESE JOU RN A L O F PEST ICID E SCI EN CE1～10 HPPD抑制剂的研究进展 吴彦超 胡方中 杨华铮* (南开大学元素有机化学国家重点实验室,元素有机化学研究所,天津 300071) 摘 要 对新型除草剂对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPP D)抑制剂的发现过程、作用机制、结构特征、构效关系以及合成方法作了较为详细的综述。 关键词 对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPP D);除草剂;抑制剂;靶标;构效关系;合成方法 发现作用机理独特的新农药品种一直是新农药创制者的主要目标之一。因为作用机理独特的化合物不仅与现有农药品种无交互抗性,而且往往具有优异的活性,更适宜于有害生物综合治理策略和持续农业发展的要求,对环境安全[1]。除草剂是通过干扰植物的生理生化作用而使杂草死亡的,如:光合作用、细胞分裂、蛋白质及脂肪合成等。这些代谢过程往往由不同的酶系统诱导[2]。对除草剂抑制植物体内生物化学反应过程中的一系列酶的研究表明,诱导植物体内许多生物合成的酶是除草剂开发的重要靶标,其中许多酶只存在于植物体内,因此开发的除草剂对人和动物的毒性很低,其环境相容性好,如乙酰乳酸合成酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)以及原卟啉原氧化酶(Pr otox)等都是除草剂的重要靶标[3]。对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)是其后发现的又一类新除草剂靶标酶。该酶抑制剂具有广谱的除草活性,能同时防除阔叶作物中的阔叶杂草,可以在芽前使用,也可以在芽后使用,具有活性高、残留低、环境相容性好、使用安全的特点,尚未发现有关其抗性的报道[4]。这引起了人们浓厚的兴趣,从而使其成为化学农药研究的一个热点。为了对HPPD抑制剂的发现过程、作用机制、结构特征、构效关系以及合成方法有一个更全面的了解,本文对近年来这方面的研究作了综述。 1 HPPD抑制剂的发现过程 HPPD抑制剂的发现起源于稀禾啶(setho xy dim)。稀禾啶是一种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂,具有较好的除草活性。人们很想合成另一功能上类似其肟基部分的化合物,制备的第一个化合物(1)具有令人鼓舞的除草活性。但采用同样方法制备其苯基衍生物时,得到了产物(3)而不是预想的产物(2)。三酮类化合物(3)没有除草活性。由于当时正在筛选能够减除硫代氨基甲酸酯类农药对大豆药害的解毒剂,经试验发现化合物(3)具有解毒剂特性。为了优化其解毒效果,开始了一系列衍生物的合成计划。作为这些研究工作的一部分,合成了邻氯取代的衍生物,意外地发现其具有很强的除草活性,由此发现了三酮类除草剂。 1982年,捷利康公司在进行三酮类除草剂的研究时,首先发现对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)是这类除草剂的靶标。该研究最终导致了欧洲玉米田苗后防除阔叶杂草除草剂磺草酮(sulco trio ne)的商品化,同时在美国也开发出一种苗前、苗后防治玉米田阔叶杂草的除草剂meso tr io ne(ZA1296)并进行销售[5]。罗纳?普朗克公司最新研制生产的一种芽前除草剂百农 *通讯联系人 国家自然科学基金(批准号:29832050)资助项目
丙酮酸羧化酶(PC)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号:BC0730 规格:50T/48S 产品内容： 提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融； 试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂六：液体10μL×1支，4℃保存； 试剂六稀释液：液体10mL×1支，4℃保存。 产品简介： 丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。 和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO 2 和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。操作步骤： 一、粗酶液提取： 1称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 24℃1000g离心10min。 3将上清液移至另一离心管中，4℃11000g离心15min。
4上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。 5在沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复12次），用于PC活性测定，并且用于蛋白含量测定。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、试剂一用前37℃孵育15min。 3、临用前按试剂六：试剂六稀释液=1:660（V:V）的比例稀释试剂六备用，现用现配。 4、工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀，现用现配。 5、操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂： 试剂名称（μL）空白管测定管 试剂一450450 工作液320320 试剂五8080 试剂六100100 样本50 蒸馏水50 在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）水浴2min，拿出迅速擦干测定130s时的吸光值A2，计算△A测定管=A1测定-A2测定，△A空白管=A1空白-A2空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 PC活性计算 单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 PC酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T=1607×△A÷Cpr ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间：2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，△A大于0.8时，建议将粗酶液用提取液稀释后 再进行测定。当△A小于0.01时，可以延长反应时间（5min或10min）来测定。