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斑点杂交

斑点杂交
斑点杂交

斑点杂交

一、基本原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。

二、器材

杂交炉,PCR 仪,Bio-Rad 紫外分光光度仪,镊子等。

三、试剂

1.尼龙膜,带阳性电荷,Roche公司产品。

2.Herring sperm DNA

3. 甲酰胺

4. Denhardt

5. Blocking reagent

6.Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (from sheep): Roche公司产品

NBT/BCIP

7.Buffer 1:50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl。

8. Buffer 2:90%Buffer 1、10% 封闭液。

9. Buffer 3:100mM Tris-HCl(pH9.5)、100mM NaCl、50 mM MgCl。

10. 显色液:25μl NBT(100mg/ml)、19μl BCIP(50mg/ml),加5ml Buffer 3。

11. 终止液:10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA。

12.杂交buffer: 50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液、25μg/ml经变性并断

裂成片段的鲑精DNA。The hybridization buffer can be stored frozen at -20℃.

13. 10% SDS (w/v)

14. 20×SSC: 3M NaCI, 0.3 M Na-citrate, pH7.0 (20℃)

15. 2×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.

16. 0.1×SSC; 0.1% SDS (w/v), sterile.

17. Buffer 4: 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH8.0 (20℃)

四、操作步骤

1.膜预处理:将膜分为若干个点样区域,两个点样区域间相距0.5cm,每个点约 3mm直径(光滑平整的吸管的直径大小)。先将膜在水中浸湿,然后浸在20×SSC中,约15min。取出膜,将膜上的溶液滴尽后平放于两层滤纸中间,于室温晾干10min,直至膜微干,不滴水。同时将probe置于沸水浴中10min,冰上骤冷

2.点样:带正电荷的尼龙膜,每个探针点样约2μl,在80℃烘烤2h。

3.预杂交: 42℃,2h.

将膜放置于封口袋或者盒子中,按每平方厘米尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。

将杂交袋放入预先加热到42℃的杂交炉或者水浴中。预杂交液:50%甲酰胺、5×SSC、2×Denhardt溶液、25 g/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA。轻轻摇晃。预杂交与杂交之间不要使膜干燥。

4.杂交:

①. PCR扩增产物纯化后然后定量,煮沸5分钟,置冰浴(热变性)。

②.弃预杂交液,换新的杂交液,加入探针,使其浓度在40-100ng/ml, 混匀,

继续于42℃杂交16h

5.100 ml 的buffer 1洗膜15min,洗2次,洗去未结合的抗体。

6.加抗体:用Buffer1 稀释anti-Dig-AP反应液(1:3000-5000),反应1hr。

弃液后,用buffer 1洗膜15min,洗2次。

7.20ml 的buffer 3平衡5min。

8.显色:加入显色液5ml,显色,避光反应30min-1hr或过夜。显色过程中不要振荡混匀。

9.50ml 的buffer 4洗膜5min,终止反应。杂交膜可以保存在封有buffer 4的袋子中。

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法) 1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程,保证检测结果的准确性。 2.应用范围: PCR实验室。 3.职责: 3.1 文件编写:实验室技术员。 3.2 文件审核:实验室主管。 3.3 文件审批:实验室主任。 3.4 执行:PCR实验室所有工作人员。 4. 参考文献: 4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》 4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书 5. 内容: 5.1 检测方法:PCR-反向斑点杂交法。 5.2 实验原理:选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域,设计特异性引物及B,C,D型特异性探针,预先将特异性探针包被在尼龙膜上,再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增,PCR产物和膜条上的特异性探针杂交,靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合,未结合的PCR 产物通过洗膜去除,最后进行显色和结果分析,可检测HBV B、C、D三种基因型DNA. 5.3 标本采集:由合作单位按照以下要求进行采集。 5.3.1 标本类型:血清。 5.3.2 标本采集:用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入无菌的干燥玻璃管,室温(22~25℃)放置30~60 min,全血标本可自发完全凝集析出血清,或直接使用水平离心机,1,500 rpm离心5min;吸取上层血清,转移至1.5ml灭菌离心管。 5.3.3 标本保存:标本采集后保存于2~8℃。 5.3.4 运送条件:标本运送采用冰壶。 5.3.5 标本拒收标准:污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。 5.4 设备和试剂: 5.4.1 设备: DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱(4℃、-20℃)、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。 5.4.2 试剂: 5.4.2.1 试剂品牌:中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒 5.5.2.2 试剂组成:DNA 浓缩液(2,000μL/管)1 管;DNA 提取液(500μL/管)1 管;HBV 基因分型突变反应管(未贴标签管)10 人份;HBV 基因分型阳性质控品(50μL/管)1管,HBV 基因分型突变阴性质控品(50μL/管)1管,杂交液Ⅰ浓缩液(50ml/瓶)1瓶,杂交液Ⅱ浓缩液(30ml/瓶)1瓶,溶液Ⅰ(100

DNA实验技术:原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry,ISHH)简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是: (1)保持细胞结构; (2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平; (3)使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性: (1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。 (2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化(简称原位杂交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)属于分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前,大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中,常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位

检测试剂盒反向斑点杂交法

人乳头瘤病毒基因分型(32型)检测试剂盒使用说明书 (PCR-反向斑点杂交法) 【产品名称】 通用名称:人乳头瘤病毒基因分型(32型)检测试剂盒(PCR-反向斑点杂交法)英文名称:Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types(PCR-RDB) 【包装规格】25人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)并加以分型,对宫颈癌的早期诊断有重要意义。 【检测原理】反向斑点杂交法 本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物,PCR扩增各基因型HPV的目的片段。将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。根据生物素-亲和素系统(Biotin-avidin system,BAS)原理,将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交,洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素(POD),与PCR产物上的生物素结合。加入显色液(TMB,H2O2),辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解,TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。 本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型,其中包括19种高危亚型:HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、 68、73、82、83型;13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、 69、70、72、81型。

【主要组成成分】 【自备试剂】 1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水,用800mL双蒸水溶解,浓 HCl调节pH值至7.0,定容至1000mL,高压灭菌,室温保存。2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中,浓HCl调节pH值至7.0,定容 至200mL,高压灭菌,室温保存。 3、1M柠檬酸钠:294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解,用浓HCl调pH值至5.0, 定容至1000mL,室温保存。 4、A液:(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC,10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 5、B液:(0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC,10mL 10%SDS用双蒸水定容到 1000mL。 6、C液:100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。 【储存条件及有效期】 核酸扩增组分(试剂盒I)于-20℃以下冷冻保存;杂交组分(试剂盒II)和核酸提取组分于2~8℃冷藏保存;TMB应避光保存。试剂有效期6个月。 【适用仪器】 核酸扩增仪:ABI-Veriti(USA);Ependorf Gradient(German);MJPTC-100(USA);AB9700(USA)等。

杂交鳢杭鳢1号胚胎发育过程的观察

江西农业学报2010,22(11):133~135 A ct a A鲥cul t urae J i an gxi 杂交鳢杭鳢1号胚胎发育过程的观察 姚桂桂,刘新轶,谢楠,王宇希,冯晓宇,郭水荣 (浙江省杭州市农业科学研究院水产研究所,浙江杭州310024) 摘要:通过尼康显微镜观察了杂交鳢杭鳢l号子一代的胚胎发育,并拍摄了其发育特征,描述了各发育时期的发育时序和形态特征。杭鳢1号的胚胎发育可分为卵裂期、爱胚期、原肠胚期、神经胚期、尾芽出现期、肌肉效应期、心跳期、出膜期等几个主要阶段。在22~25℃的水温条件下,杭鳢1号鱼卵孵化约需50h才能破膜而出。 关键词:杂交鳢;杭鳢l号;胚胎发育;形态观察 中图分类号:$917.4文献标识码:A文章编号:11301—8581(2010)l l一0133—03 O bser vat i on on E m br yoni c D evel opm ent of H ybr i d Snakehe ad f r om C hanna m acul at us(早)×C hanna ar gus(6) Y A O G ui—gui,LI U X i n—yi。X I E N a n,W A N G Y u—xi,F E N G X i ao—yu.G U O S h ui—r on g (I n s t i t u t e of F i she r y,H a ngz hou A c ade m y of A gri cul t ural S c i en ces,H ang zho u310024,Chi na) A b st r ac t: B y t he m i c r osco pe N I K O N E400,t he em br yoni c de vel opm ent pr oces s of hybr i d snakehea d“H a ngl i1”pr oduc ed by C h a nn a m acul at u s(早)x C h a nn a ar gus(6)w as obse r ved a nd r ec or ded,and t he m or ph ol ogi ca l charact er is t i cs a nd de vel o pm e nt al pr ocess of t he em bryo a t dif f erent de vel o pm e nt al s ta ges w e r e des cr i bed.B as ed on t he t yp i cal charact er is t i cs,t he em br yoni c devel op-m e nt pr ocess of“H a ngl i1”w a s di vi de d i n t o8s t ages:cl eavage st age,b l ast ul a s t age,gas t r ul a s t age,n eur ul a s t age,t ai l bud st age,m u scul a r cont r act i on st age,hear t beat i ng s t age,hat chi ng st age.Fr o m f ert i l i z e d egg t o hat ching,i t t o ok ar o und50hour s at t he t em per—at ur ef r om22℃t o25oC. K e y w o r ds:H yb r i d s nakeh ead(C m acul at us×C ar gus);Hangl i 1;Em bryoni c dev el op m ent;M or phol ogi c al char act er i s ti c 胚胎学不仅涉及个体发育、细胞分化等各方面研究的重大基础理论问题,也涉及很多具重大实践意义的应用科学方面的问题。如生殖工程中的诸多方法,可通过改变鱼类的遗传性来培育优良鱼种,像性别诱变、核的移植等手段的实现,都需以胚胎学的工作为基础¨l。 乌鳢C hanna ar gus C ant or,属鲈形目、攀鲈亚目、鳢科、鳢属,俗称黑鱼,是一种颇受欢迎的经济鱼类,因其蛋白含量高、含肉率高、肉质细嫩、味道鲜美,有“鱼中珍品”的美称悼1。乌鳢作为优质淡水鱼类,在浙江省已具有相当规模的养殖面积并形成了优势产业,尤其杭州余杭的黑鱼养殖在全国闻名。然而,随着乌鳢养殖业的迅速发展,种质退化、面源污染、疾病暴发等问题凸现,又尤以环境污染问题为甚。浙江省杭州市农业科学研究院水产研究所经多年的选育,开发出乌鳢新品种——杂交鳢杭鳢1号,该品种具有明显的杂交优势:生长快,最主要的是经驯食后能摄食浮性饲料,从根本上减少了乌鳢养殖过程中污染物的产生及对环境的影响,杂交鳢养殖的产量和效益均远高于传统的乌鳢养殖。 杂交鳢杭鳢1号是斑鳢Channa m acul at us(辛)×乌鳢(6)种间杂交获得的F,代。笔者在杂交鳢的人工繁殖过程中,对其受精卵进行了连续观察,现将其胚胎发育过程初步报道如下,以期为杂交鳢胚胎发育的相关后续研究工作提供一些参考。l材料与方法 1.1受精卵的采集杂交鳢父本来自杭州苕溪水域,为野生乌鳢经养殖而成的本地乌鳢,母本为从珠江水系引进的纯种斑鳢。于2009年5月,在杭州市农业科学研究院水产研究所内,对成熟亲鱼进行人工催产获得受精卵,斑鳢平均规格约0.5kg,乌鳢平均规格约1.25kg。选择父母亲本性腺发育良好的组别随机捞取部分受精卵,置于烧杯内孵化,水温控制在22~25℃,进行连续观察。1.2受精卵及胚胎的观察在尼康显微镜E400下对受精卵进行重复多批次连续观察,并根据形态特征的变化,以便于养殖工作的需要为依据,将胚胎发育进行大致分期,对典型阶段进行显微摄像。 2结果与分析 2.1受精卵杂交鳢的卵属浮性卵,成熟卵圆球形,卵质透明,内含一较大油球,产后借油球的浮力漂浮于水面上。入水后卵径为1.2—1.4nl m。在显微镜下看,卵质均匀。受精后,在受精膜与卵子质膜间形成围卵周隙,并在动物极一端形成胚盘(见图1—1)。 2.2胚胎发育第一次卵裂发生在排卵2h后,受精卵径裂为2个大小相等的分裂球(见图l一2)。之后通过不断地一分为二,在分别经历了四细胞、八细胞、十六细胞期后,细胞继续分裂,分裂球越来越小,到产后约4h 收稿日期:2010—08—29 基金项目:浙江省杭州市科技重大创新项目(20083212A04)。 作者简介:姚桂桂(1983~),女,硕士,主要从事水产动物繁殖生理学、繁殖营养学面的研究。

斑点杂交实验

斑点杂交实验 探针的标记: 取DNA 2ug于20ul 水中,于沸水中煮沸变性10分钟,迅速放入冰中,5分钟。加入4ul prime混合物,37°C过夜,加0.5M EDTA 1ul终止反应,保存于-20°C冰箱中备用。 点膜: 样品DNA:50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA:50ng/dot 2ul/dot(浓度5mg/ml 1:200稀释) 变性:1N NaOH 30分钟 中和:0.6M NaCl、1M Tris-HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗:2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中,120°C烤30分钟。用保鲜膜包好,于4°C冰箱备用。 预杂交: 预杂交液 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA(变性)0.4ml(5mg/ml)

膜于杂交管中,加入预杂交液,于杂交仪中42°C 3-5小时。 杂交: 杂交液的配制: 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性,置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA(变性)0.4ml(5mg/ml) 双蒸水补4ml 探针DNA(变性)20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗:62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl-0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭:封闭液1ml (5% 脱脂奶粉)0.5-1小时 漂洗:用0.05M Tris.HCl-0.12M NaCl 1ml 漂洗1×10’

原位杂交技术步骤

1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键: 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5¢(反义核酸探针)或3¢(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点:把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键:膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键:离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量

斑点杂交实验服务

斑点杂交实验服务 一、实验技术简介: 斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。【晶莱生物】 二、实验技术原理: 斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜(或尼龙膜、NC膜)上,用已标记的探针进行杂交,洗膜(除去未接合的探针),放射自显影,判断是否有杂交及其杂交强度,主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。 慢病毒,腺病毒,RNAi类,分子生物实验,病理实验,免疫学实验,细胞实验,动物实验, 蛋白组学实验,芯片类实验,并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、 核心期刊等服务。 三、实验操作流程: 1、DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿,再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干,密封保存备用。 2、RNA斑点杂交 与上法类似、,每个样品至多加10μg总RNA(经酚/氯0仿或异硫氰酸胍提取纯化),方法是将RNA溶于5μl DEPC水,加5μl甲醛/SSC缓冲液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA变性,然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上,烘干。 3、完整细胞斑点杂交 应用类似检测细菌菌落的方法,可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测,将整个细胞点到膜上,经NaOH处理,使DNA暴露、变性和固定,再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本,因为它使细胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法还高,又不影响与32P标记的探针杂交,但它不适用于非放射性标记探针,因为DNA纯度不够,会产生高本底。 四、实验注意事项: 客户提供: TotalRNA(DNA)≥20ug,浓度>1ug/ul,A260/A280>1.8;提供标记后的探针,需同时告知标记后探针的浓度及活性,待检测目的基因的Genbank 序列号。 交付标准: 1、图片

原位杂交技术的操作详解及小贴士

原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法,如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验,以及荧光分子易于衰减,其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针,报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛,生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年,由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分,检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶,及荧光分子和胶体金等,根据不同的应用需求,呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意,由于引入了免疫检测反应,在放大检测灵敏度的同时,应注意样品内源性酶的灭活,以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用,还可在同一样本中实现染色体不同区域或细

胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短,因此避免了探针内部退火的问题,在杂交时的渗透能力也更好,探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度,通常300-1000bp左右,能覆盖到较长片段的靶核酸序列,增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较,DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能,也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体,从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用,将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips:RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性,其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法,可以更方便地进行RNA探针的制备;RNA探针合成后,还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章:A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法文档

DNA斑点杂交系列(一)-实验方法 点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybr i-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。 (1)DNA斑点杂交: ①先将膜在水中浸湿,再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2-10μg DNA)。 ④将膜烘干,密封保存备用。 (2)RNA斑点杂交: 与上法类似,每个样品至多加10μg总RNA(经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化),方法是将RNA 溶于5μl DEPC水,加5μl甲醛/SSC缓冲液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA变性,然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上,烘干。 (3)完整细胞斑点杂交: 应用类似检测细菌菌落的方法,可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测,将整个细胞点到膜上,经NaOH处理,使DNA暴露、变性和固定,再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA.完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本,因为它使

细胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法还高,又不影响与32P标记的探针杂交,但它不适用于非放射性标记探针,因为DNA纯度不够,会产生高本底。 DNA斑点杂交系列(二)-实验举例 一、实验原理 用地高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。 二、实验步骤 1. 处理: 将尼龙膜浸泡于20×SSC中吸足液体后,夹在两层滤纸中37℃烘烤20-30 min。(将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作) 2. 变性: 【原理】使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA。 将待测DNA样品(HCV经RT-PCR扩增产物;HBV的PCR扩增产物作为阴性对照,每组两种样品各10μL)置于PCR仪中100℃加热10min,立即置冰中,并置于-20℃冰箱中骤冷5min。(每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上。) 3. 点样: 【原理】使样品中的DNA与膜结合牢固。 将上述变性后的样品各2μL点在尼龙膜的毛面上,室温下风干后,于烤箱中120℃烘烤30 min。

分子生物学检验完整版

1病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染与病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测与分子流行病学调查 2什么就是原癌基因,原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见得激活机制有哪些? 原癌基因就是指人类或其她动物细胞(以及致癌病毒)固有得一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征得基因总称。 特性:进化上高度保守,负责调控正常细胞生命活动,可以转化为癌基因。 功能分类:生长因子,生长因子受体,信号转导蛋白,核调节蛋白,细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白激活机制:插入激活,基因重排,基因点突变,基因扩增,基因转录改变 3试述Down综合征(21三体综合征)得主要临床特征及核型。 临床特征:生长发育障碍,智力低。呆滞面容,又称伸舌样痴呆.40%患者有先天性心脏畸形.肌张力低,50%患者有贯通手,男患者无生育能力,女患者少数有生育能力,遗传风险高。 核型:92、5%患者游离型:核型为47,XX(XY),+21 2、5%患者为嵌合型:46,XX(XY)/47,XX(XY),+21 5%患者为易位型:46,XX(XY),—14,+t(14q21q) 4简述淋球菌感染得主要传统实验室诊断方法及其主要特点,对比分析分子生物学方法得优势 1直接涂片染镜检:敏感度与特异性差,不能用于确诊。 2分离培养法:诊断NG感染得金标准,但就是其对标本与培养及营养要求高,培养周期长,出报告慢,难以满足临床要求。 3免疫学法:分泌物标本中得非特异性反应严重以及抗体法间得稳定性与条件限制,推广受限. 分子生物学得优点:敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低得病原菌,适应于快速检测 5、在单基因遗传病得分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些? 1异源双链分析法(HA)2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌得分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸(DNA RNA)得检测、基因分型与耐药基因分析等。 1PCR技术:选择高度特异性得天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术:正向杂交与反向杂交,后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术:RFLPRAPD电泳核型分析 AP—PCR技术:定义方法简便,快速,特别适合临床应用 DNA序列分析:可测定rDNA序列也适用于基因突变引起得耐药 基因芯片技术:适用于病原体得耐药研究 7、FVIII基因倒位导致血友病A,DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良,珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 (第11章,P197,P203,P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了) 答:F VIII基因倒位就是导致得血友病A得主要原因(占50%)其它基因突变,如点突变,缺失,插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失就是迪谢内肌营养不良(杜氏肌营养不良)发生得主要原因(60%-70%)。珠蛋白合成障碍性贫血有六种,主要得两种就是α珠蛋白生成障碍性贫血与β珠蛋白生成障碍性贫血,基因突变就是主要发病原因。 8、基因多态性有哪些得临床应用?(P4)

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化(简称原位杂交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)属于分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前,大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中,常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。 原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。 (一)探针的选择 根据不同的杂交实验要求,应选择不同的核酸探针。在大多数情况下,可以选择克隆的DNA 或cDNA双链探针。但是在有些情况下,必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如,在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针,在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针(通过克隆人M13噬菌体DNA获得)或RNA探针,寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强,适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体,但不适宜于组织原位杂交,因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下,寡核苷酸探针和短的PCR标记探针(80~150bp)具有较大的优越性。 在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时,手头没有筛选特定基因的克隆探针,这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白,并测定6个以上的末端氨基酸序列,通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆,因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性,因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时,可采用PCR方法扩增某段基因序列,并克隆人合适的质粒载体中,

斑点杂交法检测

斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨 作者:陆文英作者单位:江苏省盐城市慈航医院,江苏盐城224001 【摘要】目的:探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。结果:46例肺结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%;30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性,PCR法有3例阳性。结论:斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便,结果可靠,可用于结核病的快速诊断。 【关键词】结核分枝杆菌点杂交酸染色L-J培养 The Clinical V alue of Detection Mycobacterium Tuberculosis by Dot Blot Hybridization LU Wen-ying, et al (Cihang Hospital of Y ancheng City, Jiangsu Y ancheng 224001,China) Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis . Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It can be uesd to rapid diagnosis of TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J culture 近年来结核病的发病率大幅提高,为早期、快速、准确诊断结核病,我们建立了斑点杂交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌,并应用于临床,同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J 培养法、PCR法进行平行观察,以探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所,9种非分枝杆菌来自中国科学院微生物研究所。 1.2 标本来源:46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人,所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核,30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检查,首先集菌涂片镜检,余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、斑点杂交法进行检测。 1.3 试剂和仪器:斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成,其5'端以地高辛标记,探针序列:5'-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3'。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供,扩增仪为罗氏公司light cycle型。 1.4 方法

原位杂交

原位杂交技术(ISHH) 一、核酸分子杂交技术 原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链。按其作用方式可大致分为两种: 液相杂交——指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中;有吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等; 固相杂交——将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 有菌落原位杂交、斑点杂交法(Dot blot)、Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交(Northern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织(或细胞)化学技术。 二、原位杂交组织化学技术由来 菌落杂交是将细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交。 Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段。 Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。 原位杂交可以显示该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。 核酸探针根据标记方法的不同可分为放射性探针(如同位素标记的探针)和非放射性探针两类。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交; 荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。 2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。 磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法,其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶磺基化,利用单克隆抗体识别磺基化探针,再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体,从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便,不需作缺口平移标记,敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后,已有取而代之的趋势。 生物素标记探针技术是Brigat(1983)首先建立的,它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用,特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。 地高辛(Digoxigonin)标记技术,和其它非放射性标记物一样,地高辛较放射性标记系统安全,方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越,可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统),有较好的反差背景。 根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。 DNA探针还有单链DNA(Single stranded, ssDNA)和双链DNA(Double stranded, dsDNA)之分(详见十九章)。早期应用的主要是DNA探针,继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针(complementary DNA),其基本原理是以RNA为模板,经逆转录酶(reverse transcriptase)又称为RNA 指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板,按照RNA的核苷酸顺序合成DNA,这一途径与一般遗传信息流的方向相反,故称逆转录。CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。 RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括pSP64和pSP65,它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶,可以控制RNA的转录方向,即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(Sense probe)和与mRNA互补的反义RNA探针(antisense probe),又称互补RNA探针(complementary RNA probe , cRNA)。通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。由于RNA探针是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。 三、位杂交组织化学技术(ISHH)的基本方法 大致步骤:①杂交前准备:固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等; ②杂交; ③杂交后处理; ④显示(visual-ization):包括放射性自显影和非放射性标记的显色。

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