转基因技术

现代生物技术发展----转基因技术

摘要：转基因技术是20世纪80年代初发展起来，主要就是将外源基因或体外重组的基因结构转移到动物受精卵内组成新的融合基因。使其在动物体内整合和表达，产生具有新的遗传特征或性状的动物，并能将新的遗传信息稳定遗传给后代，获得转基因系或转基因群体，或者将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制，并在一定时间内表达外源蛋白。文章综述了体细胞核移植技术、慢病毒载体法、转座子介导的基因转移法、RNA干扰介导的基因敲除法和锌指核酸酶-基因打靶技术等近年发展起来的方法。而近来诱导多能干细胞(iPS 细胞)的成功为尚未获得ES细胞的大动物建立多能干细胞系提供了一种新的方案, 为转基因动物研究开创一片更广阔的天地。文章在前人研究的基础上重点总结了以上各种转基因技术的最新研究动态并对各种转基因技术的特点进行了探讨。

关键词: 转基因技术; RNAi; 基因打靶

1997年, Willmut等[4]通过体细胞核移植技术制备出了世界上第一头哺乳动物转基因克隆绵羊, 开创了哺乳动物体细胞核移植的先例。这项技术为转基因动物的制备开辟了崭新的天地, 转基因技术研究进入了新的发展历程。

近年来, 随着转基因技术研究的继续深入, 出现了许多动物转基因新技术、新方法。包括慢病毒载体法、RNA干扰介导的基因敲除法、锌指核酸酶-基因打靶技术。这些技术方法不仅提高了转基因动物的制备效率, 同时使转基因动物的基因表达调控更加精确。而近来诱导多能干细胞(iPS 细胞)技术在在小鼠、恒河猴、人、大鼠和猪这些物种上的成功对那些还未建立 ES 细胞的物种建立多能干细胞系提供了一种新的方案, 也将给这些物种的胚胎干细胞的建立、基因修饰动物的产生带来新的希望[5], 显示了iPS细胞技术在转基因动物研究领域的巨大前景。

1转座子介导的基因转移法

利用转座子可以在基因组内插入和切离并改变自身位置的特性, 使之能携带外源基因整合到动物基因组内, 从而制作转基因动物。1951年, McClintock在玉米中首先发现转座子, 直到 50 年之后, McClintock的工作才得到科学界的肯定, 荣获1983年的诺贝尔生理学医学奖。此后, 转座子及其相关技术得到迅速地发展, 成为生物基因功能分析的有效工具之一。Fadool等将mariner元件成功地转入了斑马鱼中, 并实现了种系传递。Sang等[7]将 mariner元件成功地对鸡进行了种系转化。Mariner元件

对斑马鱼和禽类种系转化的成功为转基因动物制备提供了新的有效基因导入方法。Ivics等[2]根据积累的系统发生数据, 将鲑鱼基因组中一个已经失活的转座系统进行分子重建, 获得了睡美人(sleeping beauty) 转座子。Dupuy等[3]将带有GFP基因的SB转座子线性化后, 与体外转录的编码SB10转座酶的mRNA一同注射入小鼠的单细胞胚胎, 转入的外源基因通过生殖细胞传递给后代。PiggyBac转座子首次在杆状病毒浸染粉纹夜蛾Trichoplusiani TN-368细胞株系中发现。利用PiggyBac转座子构成的载体-辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。丁昇等[4]首次报道PiggyBac转座子系统能在哺乳动物细胞和小鼠中高效转座, 并成功培育出带有荧光的转基因小鼠, 从而在世界上首次建立一种高效的哺乳动物转座系统, 具体图解见图 3。PiggyBac转座子属于DNA转座子。PiggyBac 转座子在转座酶作用下, 切出和插入发生在特征性(TTAA)核苷酸序列目标位点, 使其在动物体内能进行准确转座, 目前是哺乳动物中转座活性最强的DNA转座子。近年来, 利用转座子技术进行转基因动物功能研究得到了迅速的发展。Wu 等[5]利用PiggyBac与Cre-loxP系统相结合培育出大量基因突变老鼠并进行了广泛的功能基因研究。Woltjen等[6] 开展利用PiggyBac转座子对细胞进行重编程的研究, 研究人员利用来自病毒的 2A 肽序列生成一种结合重编程因子的“多顺反子载体”, 该载体被 piggyBac 转座子载体送入细胞中, 从而在人和小鼠成纤维细胞中都生成了稳定的iPS细胞。然后, 又从已经生成的iPS细胞系中除去与2A结合的重编程因子。此项研究开发了一种更安全的iPS细胞制备方法。

较之传统的基因剔除和化学诱变等方法, 转座子介导的基因转移法整合效率高, 承载容量大, 可同时携带多个基因, 且转基因以单拷贝形式整合, 易于模拟内源基因的表达, 同时易于确定整合位点。但在基因组中转座子的移动(转座)可诱导剪切和插入位点的突变, 以可移动DNA片段作为载体尚存在转移基因结果的不稳定性和与内源跳跃基因相互作用的可能性。而Klattenhoff 等[7]认为, 生殖细胞对转座子特别敏感, 为了给遗传物质向下一代的传递提供更多的忠实性, 某些多细胞真核生物进化产生了基于RNA的令生殖细胞转座子沉默的途径。这使得基于转座子介导的基因转移法又困难重重。

2体细胞核移植技术

1997年, Wilmut等[4]利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体, 然后将其移植到去核的卵母细胞中, 重构胚胎经过激活和培养后, 移植到代孕动物中, 成功获得了体细胞克隆绵羊多莉(Dolly), 具体图解见图 1。此项成果拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。随后, Schnieke等[6]通过体细胞核移植, 率先在世界上培育了表达人凝血因子的转基因克隆绵羊。Cibelli等[7]获得了转基因牛, Macháty等[8]得到了转基因猪。在国内, 此研究领域也得到了快速地发展并达到了国际领先水平。龚国春等[9]成功地获得了我国首例转基因体细胞克隆牛。张运海等[1]获得我国第一头体细胞克隆猪。杨鹏华等[1]首次成功培育出第一批乳铁蛋白转基因奶牛。Yang等[2]构建亨廷顿蛋白转基因载体, 运用体细胞核移植技术, 成功获

得6头亨廷顿舞蹈症转基因猪。该研究成果表明运用转基因技术建立人类遗传性疾病的转基因大动物模型的重要性。

体细胞核移植许多环节, 从而减少受体动物的数目, 不需要用受技术的突出优点是可以在细胞水平上早期验证修饰事件, 简化了转基因动物生产的体母畜来承担那些非转基因的胚胎, 表现了强大的生命力。且产生的转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致, 不需选配即可建立转基因群体, 具有很大的优越性。但由于体细胞核移植技术涉及核质互作核重编程等复杂过程, 产生的转基因后代部分个体表现出生理或免疫缺陷。且传统核移植操作程序复杂, 对设备和技术要求较高。

3慢病毒载体法

慢病毒属于逆转录病毒科。慢病毒感染宿主细胞后, 病毒RNA反转录为DNA后可以整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表达。慢病毒能感染分裂细胞和静止细胞, 不易诱发宿主免疫反应, 因此成为有效的基因转移载体。近年来, 慢病毒载体法, 制备转基因动物被广泛应用。Pfeifer等[3]用重组绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒感染小鼠ES细胞和桑椹胚, 发现早期胚胎和出生后仔鼠稳定表达 GFP, 具体图解见图2。同年, Lois等[4]利用慢病毒载体法成功制备转基因小鼠和大鼠。他们在GFP基因下游连接旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WRE), 以提高GFP基因的转录水平。将病毒液进行受精卵卵周隙注射, 注射后胚胎移植到假孕母鼠体内, 所产仔鼠 86%携带1个以上GFP转基因拷贝。Hofrnann等[5]利用慢病毒载体法首次成功制备绿色荧光蛋白转基因猪, McGrew等[6]报道利用该方法高效制备了转基因鸡, 效率比以往任何方法高出100倍。Sasaki等[7]通过自我失活的慢病毒液进行受精卵卵周隙注射, 首次培育出了带有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)转基因的非人类转基因灵长类动物—普通狨猴, 在国际上引起了巨大轰动。张敬之等[1]也利用慢病毒载体法成功制备GFP转基因小鼠。Niu等[6]利用基于猿猴免疫缺损病毒的慢病毒载体成功获得转基因猕猴。

慢病毒载体法的优点是外源基因的整合率较高; 外源基因多属单拷贝整合; 宿主范围广。但是慢病毒载体容量有限, 外源基因片断长度通常小于10 kb, 因而转入的基因很容易缺少其邻近的调控序列, 同时慢病毒 DNA 序列可能会干扰外源基因的表达, 以致整合后的表达率低。且外源基因难以植入生殖系统, 所得转基因家畜大多为嵌合体, 需要广泛的杂交, 以建立转基因系。携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组过程中有可能激活基因组DNA序列上的原癌基因或其他有害基因, 安全性令人担忧。

4 RNAi介导的基因敲除法

RNA 干涉(RNAi)是一种普遍存在于绝大多数生物体内序列特异性的转录后基因沉默机制(PTGS), 它通过一段双链siRNA或单链miRNA导致同源靶mRNA降解, 从而阻断目的基因的表达。Fire等[8] 首次阐明此现象为转录后沉默机制, 通过注射与秀丽新小杆线虫机体同源基因(靶基因)的双链RNA阻断了靶基因的表达, 并将其命名为 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)。Elbashir等[9]首次报道哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默, RNAi技术成功地从植物研究发展到哺乳动物的相关研究上。Hasuwa等[30]首次报道成功建立了RNAi 转基因小鼠, 其利用RFP作为RNAi载体导入的报告基因, 向表达GFP小鼠中导入表达siRNA 的shRNA质粒, 获得没有GFP表达而有RFP表达的转基因小鼠, 具体图解见图4。Jagdeece等[3]利用核移植克隆法与RNAi技术相结合, 成功获得体内不繁殖猪内源性逆转录病毒(PERV)的转基因猪。杨志峰等[3]构建了针对IKKα基因RNAi (敲低)的慢病毒载体, 并将载体导入小鼠受精卵卵周隙, 获得携带该载体的转基因小鼠模型, 转基因小鼠外周血细胞IKKα mRNA 表达量明显降低。Li 等[3]

报道了 siRNA 制备的新方法, 通过构建质粒pAd-hTR(human telomerase RNA, hTR), 将pAd-hTR转染哺乳动物细胞系HEK-293, 获得了携带有hTR靶向的siRNA(Ad-hTR-siRNA)腺病毒, 证明了hTRsiRNA 在HeLa细胞系中能有效特异地进行端粒酶的敲除, 从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。

与传统的基因敲除方法相比, RNAi的方法具有明显优点——高效、周期短、特异性强和操作简单, 因此RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具。通过制备针对靶基因 mRNA 不同区段的siRNA 转基因动物, 有可能获得对靶基因不同程度的缄默效果, 从而可以模拟动物数量遗传性状。但RNA干扰载体导入率不高, 很多设计的dsRNA 不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果, 且不能产生稳定地干涉作用。在RNAi的研究中, 研究人员一般利用逆转录病毒传递编码shRNA的基因。有研究表明, 大量的shRNA会阻断细胞miRNA路径, 影响内源性正常miRNA的水平和活性。

5基因打靶技术

基因打靶技术是基于同源重组原理, 使外源DNA定点整合到靶细胞的特定基因座上, 对动物基因组进行精细地修饰和改造的技术, 其具有位点专一性强和打靶后目的片段可以和染色体 DNA 共同稳定遗传的特点。Thomas等[4]首先对小鼠胚胎干细胞(ES 细胞)进行了基因打靶, 然后将此打靶的 ES细胞移植进入小鼠囊胚, 将此重组胚移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠, 通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。在大家畜体内至今还没有成功获得胚胎干细胞系, 因此在大家畜上主要结合克隆技术与体细胞基因打靶技术来产生转基因动物。McCreath 等[5]首先在成纤维细胞中进行基因靶位操作, 用体细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。Lai等[3]运用基因打靶结合克隆的方法制作出了敲除α-1, 3-糖苷

转移酶的转基因猪。Kuroiwa等[7]通过敲除牛朊蛋白( PRNP) 基因制作了无疯牛病的牛。在家禽上, van de Lavoir等[8]对原始生殖细胞(PGC)进行基因打靶, 获得携带能表达绿色荧光蛋白基因的打靶载体, 将其注入孵化3 d发育至13~15 d的鸡胚内, 获得8只公雏, 成长后与母鸡交配产生7只生殖腺有转入外源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。Tong等[3]利用大鼠胚胎干细胞首次成功建立了p53 抑癌基因敲除大鼠模型。这一突破解开了20多年来“无法用基因敲除的方法来构建大鼠疾病动物模型”的难题, 使得这种“与人类更接近”的动物能更好地为人类疾病研究效力。

基因打靶技术克服了随机整合的盲目性和偶然性, 整合位点精确、表达水平高, 是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。但这一方法在技术上仍有一些问题, 主要是基因打靶的效率太低, 产生的串联重复序列不稳定, 能自发进行二次同源重组, 对此尚须进一步的研究。

6展望

通过转基因技术，除了能提高动物的生长速度外，还可改变乳的成分、改善肉质、增加产毛量。与提高家畜生产性能和改善畜产品质量一样，利用转基因技术提高动物的抗病性具有十分乐观的应用前景。利用转基因动物生产某些具有生物活性的蛋白质，即建立动物生物反映器是当前转基因动物研究的热点。转基因生物反映器具有投资少、成本低、产量大等优势。转基因技术经过大约30年的发展日渐成熟。随着动物转基因领域新的研究方法不断涌现, 转基因技术的应用范围也不断扩展, 相续取得新进展、新突破。动物转基因技术的研究成果在改善肉奶质量, 生产生物医药产品以及人类疾病模型的建立, 特别是在治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。转基因动物已深刻影响到农业、畜牧业、医药业等许多重要领域, 同时也推动了生命科学研究的发展。因此, 充分利用转基因技术的潜在价值, 实现转基因技术实用化、商业化和转基因动物的产业化, 是科学工作者努力的目标。

参考文献

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by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(12): 7380–7384.

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技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎. 中国科学C辑: 生命科学, 2005, 35(5): 439–445.

转基因技术介绍

转基因技术 编辑 转基因即转基因技术。 转基因技术（Genetically Modified，简称GM），是指运用科学手段，从某种生物体基因组中提取所需要的目的基因，或者人工合成指定序列的基因片段，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有特定的遗传性状个体的技术。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因技术的理论基础来源于分子生物学。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词（但如今人们对改变原有动植物性状的技术称为转基因技术（狭义），将对微生物的操作称为遗传工程技术（狭义）。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Genetically modified organism，简称GMO）。 目录 1发展历史 2基本技术过程 3分类 人工转基因 植物转基因 动物转基因 微生物基因重组 自然转基因 4转基因技术产物 转基因生物 转基因食品 5技术特点 组合原理 植物 动物 6与杂交的区别 种基根杂交技术 植物杂交 杂交畜牧 7转基因技术现状 转基因食品 技术应用 商业化 8媒体报道 9转基因植物转化方法 农杆菌介导转化 花粉管通道法 核显微注射法 基因枪法 精子介导法 核移植转基因法 体细胞核移植法

10影响 减少温室气体排量 疑问 对环境系统 对生态物种 动物试验 11社会 学者批评 转基因标识法案 12相关事件 动物异常事件 转基因水稻争议 巴西坚果事件 普斯泰事件 转基因玉米事件 俄转基因食品事件 广西迪卡玉米事件 转基因大米试验 实验鼠致癌事件 猕猴喂养实验 律师申请公开遭拒 13批准作物一览 1发展历史 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔医生奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 2基本技术过程 (1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段；或者人工合成目的基因。 (2)在体外, 将带有目的基因的DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上, 形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞) 。 (4)带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖体。 (5) 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进一步研究分析,并设法使之实现功能蛋白的表达。 3分类 转基因过程按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因技术,动物转基因技术和微生物基因重组技术。 人工转基因 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology)。人们常说的“遗传工

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/0615583961.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

转基因食品安全问题

反对种植转基因作物的人们，并非都是由于科学上的疑虑（且不说其理由是否站得住脚），有的是出于其信仰，认为人类不应该种植“不自然”的作物。但是人类今天种植的作物，没有一种是“自然”的，全都是人工改造过的。这个改造过程发生于大约1万年前的新石器时代，人类开始尝试种植粮食的时候。在种植过程中，发现有的植株有人们想要的性状（比如产量比较高、味道比较好），于是其种子被保留下来，继续种下去。在下一代中，又选择“品质”最好的往下种，这样一代代地选择下去，就能得到“优良”品种。达尔文后来把这个过程称为“人工选择”。 这个过程非常缓慢。在新石器时代，“驯化”一种野生植物要花上千年的时间。1719年，英国植物学家费尔柴尔德发明了一种创造作物新品种的方法——杂交育种，把作物的不同品种进行杂交，在其后代中选育具有优良品性的品种。到了20世纪初，遗传学的创立为作物育种提供了理论依据，植物学家用杂交育种方法创造出了许多在农业生产上有巨大实用价值的新品种。这些新品种都是自然界原先没有的。 但是不同物种之间的杂交很难成功。在1930年代，植物学家发现使用秋水仙碱能够有效地克服远缘杂种不育的难题。之后又发明了细胞质融合技术，把来自两个物种的细胞融合在一起，从中培育出杂交后代。有了这些技术，杂交打破了物种障碍，杂交育种不再限于物种内部。两个不同的物种之间，甚至不同的属之间的杂交成为了可能。比如，通过把属于不同属的小麦和黑麦杂交，创造出既有小麦的高产又有黑麦的抗锈病能力的新物种小黑麦。 在第二次世界大战之后，一种新的育种技术——诱变育种获得了广泛应用。它通过使用化学诱变剂或辐射来诱发种子产生基因突变，从中筛选出具有优良性状的新品种。比起杂交育种，诱变育种更加“不自然”，因为它直接改变生物体的遗传物质，创造出了新的基因。 这些方法都属于经典育种技术，育种学家在使用这些技术时，其实是相当盲目的，并不知道他们给植物新品种引入了什么基因。从遗传学诞生日起，人们就梦想着有一天能够直接而精确地改变生物体的基因，或者说，对生物体实施“遗传工程”。这只有在分子遗传学诞生以后，才成为可能。 第一次遗传工程是1971年在美国斯坦福大学的生物学家伯格实验室完成的。他们把噬菌体λ的DNA片段插入猿猴病毒SV40的基因组，首次在体外将来自不同物种的DNA重组起来。这个重组DNA分子由于含有哺乳动物病毒序列，有可能被结合进哺乳动物细胞的染色体中；又由于含有噬菌体λ序列，有可能在细菌（例如大肠杆菌）中扩增。虽然由于许多

转基因克隆技术

转基因克隆技术研究进展 摘要：转基因克隆技术是最近发展起来的利用细胞核移植技术生产转基因动物的方法，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。与传统转基因方法相比具有明显的优势。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 关键词：转基因动物克隆转基因克隆 引言： 转基因动物( transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。[ 1 ]在转基因动物作为当今生命科学中一个发展最快、最热门的领域正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学的研究与发展面貌的时代背景下，如何高效率低成本的生产出所期望的转基因动物已成为科学界甚至商界关注的热点。 克隆(cloning)是英语“clone”音译，来源于希腊语“klon”[2]，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，所以在一般情况下人们往往把它称为动物克隆技术。克隆技术的发展为转基因动物的研究应用带来了契机，两者的结合既有迫切性又有必然性。而且，这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化[3]。 转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。[3]转基因技术与克隆技术结合，创建转基因克隆动物，已经成为本世纪培育遗传工程动物的主导性技术途径。转基因克隆技术作为一种高效而低成本生产转基因动物的技术已经为转基因动物的生产带来了新的契机。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 1.动物传统的转基因技术概述 现代转基因动物研究始于20 世纪80年代初。1980年， Gordon等首次报道用显微注射法获得转基因小鼠。1982年， Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了个体比对照鼠增大一倍的“超级小鼠”，从此揭开了转基因动物研究的新篇章[1，4]。先后出现了显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子载体法等转

(完整版)中国市场上的转基因食品及鉴别方法

中国市场上的转基因食品及鉴别方法 国内市场上的转基因食品清单 一、我国转基因作物有哪些? 1、已批准安全证书的有棉花、水稻、玉米和番木瓜，只有棉花、番木瓜批准商业化种植 “截至目前，我国批准了转基因生产应用安全证书并在有效期内的作物有棉花、水稻、玉米和番木瓜。”中国农科院植保所副研究员谢家建介绍说。 “目前，转基因水稻和转基因玉米尚未完成种子法规定的审批，没有商业化种植。”谢家建表示，“我国已经进行商业化种植的转基因作物只有棉花和番木瓜。” 我国批准进口用作加工原料的转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花和甜菜。这些食品必须获得我国的安全证书。 2、目前市售圣女果、彩椒、小南瓜、小黄瓜都不是转基因食品 网上流传一份转基因食品名单，包括“圣女果、大个儿彩椒、小南瓜、小黄瓜”。对此专家并不认同。 中国农科院生物所研究员王志兴说，小番茄也叫圣女果、樱桃番茄，是自古就有的番茄品种，只是因为个头小、采摘不便、产量低，最早仅作为观赏用，后来发现食

用方便，口味经过改良后逐渐流行。个头小是天生的基因差异，不是转基因的结果。 中国农科院油料所副研究员吴刚说，小南瓜和小黄瓜也不是转基因食品，仅仅是未充分成熟的南瓜和黄瓜。如果继续在田间种植，小南瓜和小黄瓜最终会生长成普通的大南瓜和老黄瓜。 关于大个儿彩椒，吴刚表示，大个儿彩椒含有不同类型的花青素，表现为更丰富的颜色。花青素的变异在植物中很常见，像鲜花同一个品种就有不同颜色，萝卜也有红萝卜、绿萝卜、白萝卜等。“我国曾经批准过抗病毒甜椒的商业化种植，但与常规甜椒相比，转基因甜椒并没有明显优势，因此被市场自然淘汰。” 3、我国市场转基因食品主要是大豆油和木瓜 中国农业大学食品工程与营养科学院院长罗云波介绍，目前中国市场上的转基因食品主要有两种，一种是转基因食用油，就是我们所说的大豆色拉油，来源主要是从美洲，尤其是从美国、阿根廷、巴西等国家进口的大豆所生产出来的食用油。 还有一种就是转基因木瓜，因为木瓜容易得一种农药很难治的病，用基因的技术能够控制，转基因木瓜也是我们能够吃到的转基因食品。除此之外，我国很少能够见得转基因种类的食品。

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物

转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与

转基因技术的研究进展

作物转基因技术的研究进展 摘要：作为生物技术领域的前沿，转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法：农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆，甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词：转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的，即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后，作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示，全球27 个国 家超过1800 万农民，2013 年种植转基因作物，种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外，首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示，全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上，从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷，其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者，种植面积达7010 万公顷，占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示，目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷，这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中，有19 个为发展中国家，8 个为发达国家；发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前，作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时，受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激，活化质粒上Vir 区基因的表达，将质粒上的另一段DNA（T-DNA）共价整合到植物基因组上，在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响，如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件（pH、温度和光照条件）等[32]，此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33]，且基因沉默少，转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%，已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法，是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面，加速轰击植物外植体靶组织，穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此，通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制，可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介

植物基因的克隆与转化_3_转基因植物中报告基因的检测方法

科技知识讲座 植物基因的克隆与转化(3) 转基因植物中报告基因的检测方法 李成云　(云南省农业科学院生物技术研究所,昆明　650223) 检测转基因植物有许多方法。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。 NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。 在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。电泳后,将胶从胶槽中取出,放在反应缓冲液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝胶上面注入一层含卡那霉素和(γ-32P) ATP底物的琼脂糖固定。NPT-Ⅱ酶接触底物后,酶促反应在凝胶夹层中进行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。通过S outhern转移将磷酸化的卡那霉素转移到磷酸纤维素滤纸上。基本分子卡那霉素和磷酸卡那霉素可以结合在滤纸上,ATP则不能。经过洗涤除去背景的ATP。通过放射自显影显示出放射性的卡那霉素,从而确定在聚丙烯酰胺凝胶上哪些条带上的蛋白质具有NPT-Ⅱ的活性。进一步的定量分析可以将滤纸上反映出NPT-Ⅱ活性的条带切下用闪烁计数器进行测量。 G us基因的检测: E.coliβ-葡萄糖苷酸酶的编码序列已经发展成为转化植物的报告基因系统。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶。采用一些商业上提供的特种β-葡萄糖苷酸酶作为底物,其反应产物可用分光光 53 2000年第6期 云南农业科技

简述转基因技术原理

转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通

转基因生物安全性辩论赛规则

转基因生物安全性辩论赛 一、赛制 本次辩论赛采取形式为四对四团体辩论赛，每个代表队选出四名选手上场参加比赛，在赛前进行分工，分为四个辩手，中途不得更换选手。比赛由队员陈词、盘问、自由辩论、总结陈词四部分组成。比赛要求用普通话表述。 1、一辩：开篇立论；在攻辩阶段结束后做小结，攻辩共分为四轮；参加自由辩论 2、二辩、三辩：参加攻辩和自由辩论 3、四辩：参加自由辩论；进行陈词 二、比赛时间、地点、班级安排： 2014年5月6日上午第3节微格教室 2015级1班 三、辨题：转基因生物安全性 正方：转基因生物是安全的反方：转基因生物是不安全的 四、辩论赛程序（由主持人介绍） 1、选手入场 2、辩论开始 3、宣布辩题 4、介绍参赛代表队及所持立场 5、各代表队展示自我特色以及介绍参赛队员 6、介绍规则、评委及点评嘉宾 7、辩论比赛 8、评委、嘉宾确定比赛结果 9、评委对此次比赛进行点评 10、宣布比赛结果 11、辩论赛结束

赛场规则 1、自比赛开始起各队不准中途更换队员，一经发现，工作组将有权在任何时间任何情况下取消其比赛资格。 2、对阻挠工作人员者，经劝阻无效的，将被清出场外。 3、辩手发言期间或将要发言时，观众不得鼓掌打断或阻碍辩手发言。 4、在观众提问阶段，对于每个观众提问的问题，辩手回答时间至多为1分钟，允许团队内部互相补充。 六、评判标准 （一）同学推荐评委，对比赛进行全程评议。 （二）评分标准 项目： 1、论点明晰，论据充足，引证恰当，分析透彻。 2、迅速抓住对方观点及失误，驳论精到，切中要害。 3、反映敏捷，应对能力强。 4、表达清晰、层次清楚，逻辑严密。 （三）评分项目

水稻转基因实验方法与步骤

水稻转基因 一、实验目的 1.学习水稻组织培养的方法 2.学习水稻转基因的方法 二、实验原理 目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。 历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。 三、试验步骤： 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；

2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周） 一、农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。 二、共培养和抗性愈伤组织的选择 1．感菌与共培养： 1）取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01； 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟； 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。 2．选择： 1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；

转基因与杂交的区别

转基因与杂交的区别 转基因是指将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically modified organism，简称GMO）。杂交（hybridization）是两条单链DNA或RNA的碱基配对，是通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。杂交育种是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。杂交的原理是基因重组，通过基因重组产生新的基因型，从而产生新的优良性状。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型，为选择提供丰富的材料；基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。但是，杂交过程并不会产生新基因，且杂交后代会出现性状分离，育种过程缓慢，过程复杂。转基因是将特定的外源基因片段导入生物体的基因组中，是一种外源基因的引入手段；杂交是不同基因型个体之间通过交配而实现的双亲基因重组，不会产生新的基因。同时，转基因可以直接在当代表现出来，而杂交表象在后代才能表现出来。 转基因是通过对基因染色体进行操作，改变生物当代的基因，从而直接在当代表现出来。杂交是将基因有区别的近亲生物养殖或者种植在一起，杂交过程由生物自身完成，杂交后的表象在后代才能体现出来，当代是看不到的。

转基因生物安全

转基因生物安全 一、引言 转基因生物安全问题在国内外已经引起极大的关注，不同领域的专家都从自己的专业角度对这个问题进行了很多研究，积累了丰富的文献。这些研究主要集中在生态学、科技伦理、环境科学等方面，主要通过技术层面来分析转基因生物的安全性问题。随着研究的深入，人们一致认为，生物安全是一个综合性的问题，它对于人类社会的深远影响已经超过人们的预期，原来那种希望仅仅依*科学技术的完善来解决人们对生物安全的疑虑和不安的想法已经显得过于简单。 近年来，中国出现了一系列涉及到转基因生物及其产品的案件和纠纷，如雀巢转基因食品标识纠纷，美国转基因大豆进口许可证风波等，还有如今沸沸扬扬的转基因稻米市场化争议，国内越来越多的学者开始意识到生物安全法律问题研究的重要性，在生物安全立法、管理体制等方面作了很多开创性的研究工作，但是与国外的研究现状相比，我国对生物安全的法学理论研究滞后于实践的状况比较严重。因此在生物安全法律规制的框架构建上缺乏足够的法学理论支撑。就现有的极少量相关研究成果而言，大都出自生物技术专家之手，而非出自法律专家。从采取的研究方式来看，长期以来仅仅引进和介绍国外相关研究成果，研究范围狭窄，层次相对单薄，没有建立起

独立和成熟的转基因生物安全法律研究框架和法学理论。 作为转基因生物安全法律问题研究的逻辑起点，转基因生物安全的概念界定是一个核心问题和工作基础。笔者有感于国内学者对转基因生物安全概念理解的不一致，结合转基因生物安全问题的科技背景和转基因生物安全问题的演变，试图对转基因生物安全的概念作一梳理和探究。 二、“转基因”词源和“生物安全”的由来 “转基因生物”一词的最初来源是英语“Transgenic Organisms”，因为在上世纪70年代，重组脱氧核糖核酸技术（rDNA）刚开始应用于动植物育种的时候，常规的做法是将外源目的基因转入生物体内，使其得到表达，因而在早期的英语文献中，这种移植了外源基因的生物被形象地称为“transgenic Organisms”，即“转基因生物”。但随着分子生物技术的不断发展，尤其是上世纪90年代末以来，科学家们能够在不导入外源基因的情况下，通过对生物体本身遗传物质的加工、敲除、屏蔽等方法也能改变生物体的遗传特性，获得人们希望得到的性状。在此类情形下，没有转入外源基因，严格说就不能再称为转基因，称为“基因修饰”更加合适和全面，因此现在开始用“Genetically Modified Organisms（简称GMO）”，即“基因修饰生物”，来代替早期的“Transgenic Organisms”。因此，现在我们所指的“转基因生物”，其概念已经为“基因修饰生物”所涵盖。但因为“转基因”一词已经普遍为

“杂交”与“转基因”区别

“杂交”与“转基因”区别 大家对转基因争论不休，其实很多人并不太明白,有人企图“混淆”转基因与杂交的区别。 所以我们必须分清楚“杂交”与“转基因”区别。 杂交——物种非常非常相近的生物，进行交配，生育出后代。杂交的条件苛刻，即使能成功，也受自然生物体系的限制。 转基因不同——它可以把“不同的物种”进行切片，从理论上可以进行“任意组合”。也就是说——“转基因”可以不受自然生物体系的限制。 比如——狮虎兽是杂交；长翅膀会飞的老虎就是“转基因”。 利用“杂交”手段，完全不可能让麻雀与老虎“杂交”。因为那样——完全违背了自然生物体系。不可能被自然界允许接受。但“转基因”不同——它突破了“自然生物体系的限制”。 我完全相信——有一天，通过“转基因”，麻雀的翅膀可以长到老虎身上。 这就为“转基因” 现在所谓的转基因技术，大多并不是对染色体进行改变，而是使用质粒。质粒是类似线粒体和叶绿体一样的自带DNA的细胞器。质粒其实可以看作一种介于病毒和细胞器之间的一种存在形式。基于质粒的这种存在形式，它可以很容易地被导入到细胞。而由于它可以利用细胞结构产生蛋白质，或者把部分基因导入到植物细胞DNA上/从植物细胞DNA移除部分基因，所以是目前转基因技术的主要应用方式。 质粒的遗传、变异规律并没有研究那么透彻。质粒可以把更大范围的基因进行重组，质粒的稳定性比核内基因差很多，质粒还分几种复制和遗传特性差别很大的不同类型，等等。从这个角度来说，人们对转基因技术的担心是可以理解的。例如，质粒在环境物种之中的扩散规律就没有研究报告说得清楚，在何种情况下影响环境物种、何种情况下不影响环境物种？但杂交基因在这方面就好得多。 基于以上原因，谨慎使用转基因技术于开放式大规模生产的环境是合理的。 杂交只能在同种和近亲种间进行,可自然发生，而转基因技术可以将基因在不同生物间转移，自然发生的概率非常小，几乎为零概率事件。透过杂交技术的品种改良只能够在近亲的品种之间进行, 杂交水稻都是在栽培稻之间或栽培稻与野生稻之间的杂交品种, 育种及筛选优良的株系。即使人工杂交技术, 也没有打破大自然的遗传规律, 正如我们最熟悉的狗，就是古人早期驯化狼通过从野生的狼中寻找父本或母本，不断杂交，最后得到优势种，迄今狼依然可以和狗生育后代。但通过转基因技术,科学家可以将某个基因从一种生物中移植到另一生物, 使受体生物出现一些特殊的性状,如抗虫、抗除草剂等。从这层意义上看，转基因生物是实验室中创造出来的生命，譬如最常说的将杆菌上的产毒素的基因转移到水稻，小麦上去，但是不管怎么转，人们是不可能让杆菌和小麦，水稻来交配生育后代的。这就是转基因和杂交的最本质的区别。

关于转基因食品的20个问题

关于转基因食品的20个问题 世界卫生组织 食品安全规划 瑞士日内瓦 2002年10月15日出版 这些问题和解答已由世界卫生组织拟定，以应对世界卫生组织一些会员国政府就转基因食品的性质和安全提出的问题和关注。 1. 何为转基因生物和转基因食品 转基因生物可界定为遗传物质（脱氧核糖核酸）已以非自然发生的方式改变的生物。该技术通常被称为“现代生物技术”或“基因技术”，有时候也称为“重组脱氧核糖核酸技术”或“遗传工程”。它可使选定的个体基因从一种生物转移到另一种生物，并且还可在不相关的物种之间转移。 这些方法用以产生转基因植物——然后将它们用于培植转基因粮食作物。 2. 为什么要生产转基因食品 转基因食品得以开发和销售是因为对这些食品的生产者或消费者存在着某些感知的好处。这是指将其转变为一种价格较低、利益更大（在耐用或营养价值方面）或二者兼具的产品。最初，转基因种子开发者希望他们的产品获得生产者的接受，因此集中于农民（以及更广泛的食品工业）所重视的革新上。 以转基因生物为基础开发植物的最初目标是改进作物保护。目前市场上的转基因作物主要目的在于通过增强对由昆虫或病毒引起的植物病的抗性或通过增强对除草剂的耐受性提高作物保护水平。 通过将从苏云金芽孢杆菌（BT）这种细菌中生产毒素的基因转入粮食作物，从而实现抗虫害抗性。这种毒素目前在农业中作为常规杀虫剂使用，并且供人食用是安全的。持续产生这种毒素的转基因作物已显示在特定情况下，如在虫害压力大的地方，需要较少量的杀虫剂。 通过从引起植物病的某些病毒中引入一种基因，从而实现抗病毒抗性。抗病毒抗性使植物较不易受这些病毒引起的疾病的影响，使作物产量更高。 通过从传送抗某些除草剂抗性的一种细菌中引入一种基因，从而实现抗除草剂耐受性。在杂草压力大的情况下，利用这些作物已造成减少使用除草剂数量。 3. 对转基因食品的评估是否不同于传统食品

阿尔兹海默病转基因动物模型研究进展

阿尔兹海默病转基因动物模型研究进展 【摘要】阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）转基因动物模型的脑病理变化与人类 相似，可模拟AD与年龄呈正相关的老年斑的形成、胶质细胞增生和突触减少等部分病理特征，并表现出与AD相似的行为学障碍。本文就几种常用的AD转基因动物模型研究进展做一概述。 【关键词】阿尔兹海默病；转基因动物模型 【中图分类号】R-332【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）17-181-01 阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性认知和行为障碍为主要临床症 状的神经退行性疾病，多发于老年人，目前已成为继心脏病、肿瘤、脑卒中后第四位致死性 疾病。随着人口老龄化日渐加快，研制出有效的AD防治药物已刻不容缓，建立完善的AD动物模型则尤为重要。本文就几种常用的AD转基因动物模型研究进展做一概述。 转基因技术是将外源性基因引入基因组，并使其得以稳定遗传的方法。近年来研究发现，与AD发病有关的基因包括APP、PS-1、PS-2、载脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE）及Tau蛋 白基因[1]。 1单转基因动物模型 1.1 APP转基因模型 正常情况下，APP经由α分泌酶途径代谢。基因突变时，β和γ分泌酶被激活，导致β 淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）生成增多，Aβ异常聚集和沉积形成老年斑（senile plaque,SP），从而引发AD。Games将突变APP基因与血小板衍生因子相结合导入到小鼠体内从而获得PDAPP小鼠。该模型较好的模拟了AD细胞外Aβ的沉积、神经炎斑块、神经元突触丢失等病 理特征[2]。Tg2576小鼠转录了人类APP695基因，是目前最常用的APP转基因小鼠模型之一，小鼠在6-8个月龄时脑内Aβ开始升高，尤其以Aβ42增加更为明显。10个月左右可见Aβ沉积，且沉积位置与人类相近，出现认知障碍[3]。 1.2 Tau转基因模型 神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）是AD的另一个特征性病理改变，过度磷酸 化的微管相关蛋白Tau构成了其主要成分。Lewis等建立了Tau突变转基因小鼠JNPL3，该小 鼠在6.5个月左右出现运动和行为障碍、脊髓出现神经纤维缠结和神经元丢失。10月龄左右，90%的模型小鼠出现严重的运动损伤[4]。 1.3 ApoE4转基因模型 有大量研究证实ApoE4直接促进Aβ沉积。ApoE4转基因小鼠脑内tau蛋白的磷酸化水 平增加，NFTs表达增加，存在大量SP，胆碱乙酰转移酶活性明显降低，6-7月龄时出现学习 记忆障碍[5]。 2 多重转基因模型 研究人员发现，AD单转基因模型的病理改变及行为学异常出现较晚，不能较好的模拟 出AD的病理过程。多重转基因模型能够弥补单转基因模型的不足，模拟出更多与人类AD相似的病理过程和临床特征，为AD的研究提供更完善的模型。 研究表明小鼠脑内形成Aβ沉积的最快途径是PS和APP杂交。Yao ZG等建立了 APPswe/PS1DE9双转基因小鼠模型，此模型应用较广泛。该模型在4.5月时大脑皮层出现老 年斑，行为障碍。2012年，Zhang QL等利用APP/PS1转基因小鼠和铝建立了一种更接近人类