叶绿体内活性氧产生及清除的酶系统_廖祥儒[1]

文章编号:1000-1336(2000)06-0260-03

叶绿体内活性氧产生及清除的酶系统

廖祥儒,　王　越

(河北大学生命科学学院,河北保定071002)

关键词:活性氧;叶绿体;清除酶系统

中图分类号:Q 946.5 文献标识码:A

收稿日期:2000-07-22

作者简介:廖祥儒(1964—),男,副研究员,博士。

活性氧是需氧生物正常代谢的产物[1]。在光照条件下,由于光合作用,水裂解而产生大量的分子氧,造成叶绿体局部氧浓度剧增而引起氧的光还原,形成大量的超氧化物阴离子(O ·-2)。O ·-

2的歧化及金属离子的作用则可引起H 2O 2和·OH 的产生,危及叶绿体的膜结构。因此,叶绿体活性氧的清除对于维持其正常的生物功能具有重要意义。1.叶绿体内活性氧的产生

氧的光还原是叶绿体活性氧产生的主要方式[2]。在叶绿体内,氧的光还原主要有3条途径:类囊体途径、叶绿体基质途径和黄素脱氢酶途径。

1.1　类囊体途径 已经证明,在洗去铁氧还蛋白(Fd )后,类囊体能够在光照条件下使分子氧还原成O ·-2,Asada 等(1994)认为,光系统I (PSI )复合体中的psaA 和psaB 组分上的X 铁硫簇(4Fe -4S )以及psaC 组分上的A /B 铁硫簇(4Fe -4S )是分子氧的电子供体。在中性pH 条件下,类囊体氧分子光还原速率为20μmol /mg 叶绿素/小时,约为每秒钟每分子PS I 产生4分子O ·-2。类囊体氧分子的光还原K m 值一般为2～10μmol /L 。

1.2　叶绿体基质途径 叶绿体基质中氧分子的光还原主要由Rubisco 催化经光呼吸途径完成,这一过程受低氧(小于2%时)和高二氧化碳抑制。在这一途径中,高等植物

叶细胞或组织的氧分子光还原K m 值约为

80μmol /L ,而完整叶绿体氧分子光还原K m 值约为60μmol /L ,均明显高于类囊体氧分子的光还原。在大气氧浓度高于16%(160μmol /L )和光强度较高时,氧分子光还原的叶绿体基质途径即可达到饱和。在植物光反应过程中,叶绿体氧浓度一般略高于250μmol /L ,因此在正常条件下类囊体的氧分子光还原可忽略不计。

1.3　黄素脱氢酶途径 在氧浓度较高情况下,黄素脱氢酶也能催化NADPH 与O 2反应产生O ·-

2,参与这一过程的脱氢酶主要有叶绿体的铁氧还蛋白-NADP +还原酶(FNR )、谷胱甘肽还原酶(GR )、单脱氢抗坏血酸(M DA )还原酶,催化速率一般约300μmol /mg 叶绿素/小时(相当于每秒钟每分子PSI

产生60分子的O ·-2)。黄素脱氢酶途径光饱和点为200μmol 光子/m 2/s ,O 2的K m 值约为100μmol /L 。2.叶绿体的超氧化物清除酶

叶绿体中的超氧化物由超氧化物歧化酶(SOD )歧化为H 2O 2和O 2[1]。大多数植物叶绿体的SOD 主要是Cu ,Zn -SOD ,少数植物如烟草也含有Fe -SOD [3]

。Cu ,Zn -SOD 催化

反应为:

SOD -Cu (Ⅱ)+O ·-2※S OD -Cu (Ⅰ)+O 2SOD -Cu (Ⅰ)+O ·-2

※S OD -Cu (Ⅱ)+H 2O 2

研究发现,叶绿体Cu ,Zn -SOD 与非叶绿

体型细胞基质Cu ,Zn -SOD 的氨基酸序列不同,其免疫原性也不同[2]

。植物Cu ,Zn -SOD

像其它有机体的同工酶一样是同型二聚体,

每个亚基(16kD)有一个Cu和Zn原子。植物有多个胞质Cu,Zn-SOD的同工酶,但只有一个三维结构呈β-桶状的叶绿体同工酶。胞质Cu,Zn-SOD位于独立的细胞区域,在核、液胞膜、过氧化物酶体中也可发现。此外,胞质Cu,Zn-SOD也可位于非原生质体的区域,并在木质素合成中起作用。

虽然Cu,Zn-SOD和Fe-SOD都是可溶性蛋白,但Cu,Zn-SOD的免疫金标记显示至少有70%的酶定位于基质类囊体的5nm片层上[4]。由于Cu,Zn-SOD的分子大小为16×4.8×8.6nm,这表示位于类囊体膜上的Cu,Zn-SOD局部浓度大约为1m mol/L。当Cu,Zn-SOD连接到膜上,在基质约100nm片层中可形成较高的浓度。如果基质酶类直径为5～7nm,相当于片层100nm内有14～20个酶分子。由于叶绿体光系统Ⅰ(PSⅠ)也位于类囊体膜上,产生于其中的超氧化物可以从表面开始的5nm内被迅速清除[11]。另外,卡尔文循环的酶复合体也连接到类囊体膜上[2]。而活性氧敏感型基质酶类大约位于从膜开始的100nm片层内,如果Cu,Zn-SOD没有连接到膜上,这些酶就会与O·-

2

和

由O·-

2

产生的H2O2反应。已发现缺少叶绿体Cu,Zn-SOD的转基因烟草,尽管其M n-SOD仍然存在,其叶绿体可被强光漂白,PS Ⅰ复合体被钝化。不过,在转入烟草M n-SOD后,也可增强玉米叶绿体对寒冷和氧化胁迫适应。Fe-SOD也位于叶绿体基质之中,转基因烟草中Fe-SOD的大量产生可以增强烟草抗氧化胁迫能力。表明在细胞器和叶绿体导入清除酶能够增强植物对逆境的适应。

3.叶绿体的H2O2清除酶

在叶绿体内,SOD催化O·-

2

歧化产生的H2O2主要在抗坏血酸过氧化物酶(APX)催化下生成水[2]。同时叶绿体包含清除磷脂氢过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和2-半胱过氧还蛋白,这些酶可能参与类囊体膜上的脂类氢过氧化物还原成醇以抑制类囊体磷脂链的氧化,因为APX不能还原磷脂类氢过氧化物[5、6]。

APX的催化循环属于过氧化物酶的乒乓机制。反应如下(其中R表示卟啉或保守Trp残基,AsA为抗坏血酸,MDA为单脱氢抗坏血酸):

APX-Fe(III)-R+H2O2※APX-Fe(IV)=O-R++H2O

APX-Fe(IV)=O-R++AsA※APX-Fe(IV)=O-R+M DA APX-Fe(IV)=O-R+AsA※APX-Fe(III)-R+M DA+H2O 叶绿体中APX可分为类囊体束缚(tAPX)和可溶性基质酶类(sAPX)。tAPX 束缚于PSⅠ复合体位于的基质类囊体,处于表面的tAPX局部浓度大约为1mmol/L。sAPX处于基质,浓度为40μmol/L,估计均匀分布于基质内。叶绿体中至少有一半APX 是tAPX,但tAPX/sAPX的转换比例随植物种类而异。tAPX虽比sAPX(3.2kD)约大5. 5kD,但它们的同工酶是单体并有相似的酶构成[28]。两种APX是在同一前体m RNA 的剪接控制下合成,在一般条件下二者m R-NA表达水平是基本相同的。最近研究表明,两种叶绿体APX同工酶不同剪接的调节依赖于编码APX的基因APXⅡ3′末端的处理。tAPX的C末端有附加序列,这是疏水区,可连接类囊体。

除了叶绿体APX,植物还含有胞质同工酶(cAPX)。cAPX是同型二聚体,它的氨基酸序列不同于叶绿体APX,并且也不像tAPX和sAPX那样将电子专一地给抗坏血酸,也许cAPX可以参加除叶绿体外的H2O2的清除。

为了使叶绿体过氧化氢清除系统运转,须得使反应中消耗的抗坏血酸(AsA)迅速由单脱氢抗坏血酸(M DA)来补充,在叶绿体中主要通过以下几种方式来完成。

在类囊体清除系统,MDA主要通过光还原态铁氧还蛋白(Fdr)来还原。虽然Fdr在类囊体中MDA和NADP+之间竞争,但MDA的还原速率是NADP+的34倍。同时依赖Fd的MDA还原也受氧交换[35]和类囊体中M DA水平[36]的影响。在无Fdr而有NAD(P)H底物时,MDA还原酶可作为电子

受体表现出对MDA的高度专一性,将MDA 还原成为AsA。不过在类囊体清除系统中M DA还原酶不参与M DA的还原。

在PSⅡ遭到活性氧的胁迫钝化时,产生于类囊体腔内的M DA不能被铁氧还蛋白或NAD(P)H还原。这时MDAD可自发歧化成脱氢抗坏血酸(DHA)和抗坏血酸。DHA 可穿过类囊体膜,但阴离子M DA却不能。扩散到基质的DHA在依赖GSH的DHA还原酶的作用下还原成抗坏血酸。现已从叶中和其它组织中提纯得到以GSH为电子供体的DHA还原酶。在此反应中使GSH再生的谷胱甘肽还原酶大约含量为1.4μmol/L,经基因工程研究,发现DHA-谷胱甘肽系统对提高植物抗氧化能力具有重要作用。

4.环境因子对叶绿体活性氧清除酶系的影响

叶中清除酶类的量受到环境胁迫的影响,如干旱﹑寒冷﹑气体交换胁迫﹑金属离子﹑UV﹑强光、无机质胁迫和内源性胁迫(如容量胁迫和衰老)等,它们可以引起清除系统的酶量增加,例如在光照下健康叶中很难测出M DA,然而在环境胁迫下却可测出[7～12]。

当清除系统不能快速清除H2O2时,可被H2O2钝化[2]。除M n-SOD外, Cu,Zn-SOD和Fe-SOD虽然可以抵抗变性胁迫如温度升高,但都可被H2O2钝化并在酶反应中心产生羟基。羟基不但使Cu,Zn-SOD,也可使其它酶类如1,5-二磷酸核酮糖羧化酶成片断化。由于叶绿体包含有抗坏血酸的再生系统,APX不会被钝化,但随着H2O2/AsA比例的升高而使APX呈不稳定性。DHA还原酶在缺少硫醇时被H2O2钝化。谷胱甘肽还原酶则在缺少GSSG时被NADPH钝化。在百草枯作用下,叶绿体中AsA不能从MDA和DHA中再生,经短时间照射后APX即被钝化。即使缺少百草枯,黑暗中额外加H2O2也可钝化APX。相比于APX,只有在百草枯处理后较长时间照光才能使SOD、DHA还原酶和谷胱甘肽还原酶钝化。

综上所述,叶绿体活性氧主要来自氧光还原的类囊体途径、叶绿体基质途径与黄素脱氢酶途径,其中后两种是主要途径。在正常条件下,当叶绿体中产生O·-

2

后即能快速地为SOD歧化为H2O2和O2,H2O2及其衍生物则被APX、GPX或2-半胱过氧还蛋白快速地清除或还原。然而,在逆境条件下,叶绿体的SOD、APX、GPX等活性氧清除酶的生成易被抑制或易失活。因此,如何激活叶绿体清除酶或调节其基因表达,或导入能够高效表达的活性氧清除酶基因,对提高植物抗逆性具有重要意义。

参考文献

[1]　Asada K,Takahashi M.Production and scavenging of

active oxygen in photosynthes is.In Photoinhibition

ed.DJ Kyle,C B Osmond,CJ Arntzen,Amsterdam:El-

sevier,1987,227—287

[2]　Asada K.An nu Rev Plant Physiol Pla nt Mol Biol,

1999,50:601—639

[3]　Kurepa J et al.P lant Cell Physiol,1997,38:463—470

[4]　Ogaw a K et al.P lant C ell Phys iol,1995,36:365—373

[5]　Baier M et al.Plant J,1997,12:179—185

[6]　Eshdat Y et al.Physiol Plant,1997,100:234—240

[7]　Navari-Izzo F et a l.Physiol Plant,1998,104:630—

638

[8]　Heber U et al.P lant Cell Physiol,1996,37:1066—

1072

[9]　廖祥儒等.生命的化学,1996,16(6):19—21

[10]　Hiroyuki I et a l.J Biol Chem,1999,274:5222—5226

[11]　Lascano FR et al.P lant Phys iol B iochem,1998,36:

321—329

[12]　Iturbe-Ormaetxe I et al.Plant Physiol,1998,116:

173—181