基因工程复习重点
绪论
1.理论上的三大发现：
（1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。 1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。
2.技术上的三大发现:
（1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ）
（2）DNA连接酶的发现（1967Gellert）
（3）基因工程载体的发现
3.基因工程研究的内容：
(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。
(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。
(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。
(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；
(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
第二章基因克隆所需的工具酶
一、限制性内切酶
1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制
修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。
2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型
3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统
4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性：
a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；
b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；
c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。
一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。
二、切割类型：
（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。
三、产生的末端特征：
1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。）
2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。
3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。
4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。
四．影响核酸内切限制酶活性的因素：
(1) DNA的纯度。
提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
(2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
(3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。
(4) DNA的分子结构
(5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=7．4时，最佳
1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。
二．DNA连接酶
1、种类：
①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子
2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子
3，一条链带有切口的DNA分子
4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。
②、大肠杆菌DNA连接酶
1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子
2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段
3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段
4.底物要求严格，假阳性背景底
4、携带特殊的遗传标记
6、受体细胞应具备的条件：限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型
三、DNA聚合酶
1、DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力：
(1) 5’---->3，聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3，一OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3，一OH方向按模板顺序从5，一3’延伸。
(2) 5， ----> 3，外切酶活性：E．co1i DNA 聚合酶1也能从游离的5，末端降解dsDNA成为单核苷酸。
(3) 3，----> 5，外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3，OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。
缺口转移：指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’--->3，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3，—OH和5，—P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移。
2 ．Klenow片段
Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。
１）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；
２）标记DNA片段的末端；
3. T4DNA聚合酶
T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。具有两种酶催活性，即5，--->3，的聚合酶活性和3，--->5，的核酸外切酶活性。
4.TaqDNA 聚合酶
从极度嗜热菌提出。具有5’ 3’聚合酶活性和3’ 5’外切酶活性。主要用于PCR扩增。
四、逆转录酶
1、又称RNA依赖的DNA聚合酶。这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。产物DNA又称cDNA
2、逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。
3、逆转录酶的酶活性：
(1) RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带3，一OH末端的DNA片段为引物，沿5，--->3，方向合成DNA 链。
(2) DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3’一OH末端的DNA片段为引物，从5’--->3’方向合成DNA链。
(3)外切RNA酶活性底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。从RNA链5’末端外切的称5’--->3’外切RNA酶，从RNA链3’末端外切的称3，--->5，外切RNA酶H。
第三章基因克隆载体
1、载体：指携带外源基因进入受体细胞的这种工具。（载体的本质是DNA）
2、基因工程中所用的载体：(1)?? 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。(2)噬菌体且的衍生物。(3)cosmid(柯斯质粒)。(4)单链DNA噬菌体M13。（5）动物病毒。
3、作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求：
(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。
(2)容易从宿主细胞中分离纯化。
(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。
一、质粒载体
1、质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。
2、F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。 F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。
3、R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
4、Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
5、在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。
6、质粒载体的基本条件
(1) 能自主复制，即本身是复制子
(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；
(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。
(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
7、载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
8、载体应具备的条件（共有特性）：(1) 在宿主细胞中能独立和稳定的自我复制，即本身是复制子。(2) 具有合适的限制性内切酶位点。(3) 具有合适的选择标记基因，来筛选重组体DNA
9、质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。（质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的）
绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，
10、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：严紧型松弛型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒
11、质粒的基本特性：1、质粒的自主复制性2、质粒的不相容性3、质粒的可转移性
12、革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒（能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞《结合作用》）、非接合型质粒（不能在天然条件下独立地发生接合作用）
13、实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 1、氯化铯密度梯度离心法 2、沸水浴法 3、碱溶法
14、按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒
15、考斯质粒：是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
16、考斯质粒载体的特点：
*能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞
*能像质粒那样在受体细胞中自主复制
*重组操作简便，筛选容易
*装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围
*不能体内包装，不裂解受体细胞
二、各种基因工程受体
1、大肠杆菌载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定产结构复杂、种类繁多的内毒素，适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。
2、枯草杆菌蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素遗传欠稳定，载体受体系统欠完备，适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。
3、酵母菌具有真核生物的特征，，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定内源性蛋白产物种类繁多且含量高，适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。
4、昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 DNA 重组操作系统欠完善，适用于真核生物基因的高效表达
5、哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统细胞培养条件苛刻，生长缓慢，适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA 重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体
6、植物细胞（拟南芥、烟草）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用遗传操作繁琐，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良
三、实验室常用的基因工程受体
1、大肠杆菌：用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE39
2、ED8654
2、酵母菌毕赤酵母、啤酒酵母
3、哺乳动物细胞 CHO
第四章目的基因的分离克隆
一、目的基因的获取：化学合成法、cDNA文库、基因组DNA文库、聚合酶链式反应
二、基因克隆，主要包括以下几个过程：
1.DNA片段的分离、纯化，即目的基因的制备；
2.外源DNA片段与载体DNA分子的体外连接；
3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移；
4.重组克隆的筛选和鉴定。
三、化学法合成目的基因适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备
1、聚合酶链式反应（PCR)：是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。
2、PCR基本技术的三步：
（1）变性：即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。
（2）退火：即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。
（3）延伸：即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5，→ 3，的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。
PCR产物的大小则取决于两引物退火位点5’端之间的距离。
3、PCR反应体系：（1） DNA模板（2）引物(3)．脱氧核苷三磷酸(4). 耐热性聚合酶
4、设计引物时应注意以下几个因素：
（1）应选择在进化过程中可能保守的区域及不被内含子间隔的区域(如进行目的基因的cDNA克隆时)；
（2）应选择密码子简并少的氨基酸序列，如选择只有一个密码子的色氨酸而非6个密码子的丝氨酸；
5、PCR反应条件的选择：（1）变性（2）退火（3）延伸
为满足实验的需要所采用的PCR条件是：94℃初变性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，25—30个循环，72C保温10min后，4℃下停止反应。
6、在PCR反应中由于反应体系或条件的不适常会出现两种极端的现象，一种是非特异性扩增严重，产生许多不确定的产物甚至无目的条带；另一种是扩增不到任何产物。这时需要通过改变模板浓度、引物用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、缓冲液pH值等加以优化。其中尤以Mg2+浓度最为重要，其直接影响着引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性，Mg2+的最佳有效浓度为1．5mmol／L，但也随模板和引物的不同而有所改变，可从0．5 mmol ／L到10 mmol／L。在Tm值允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使PCR产物的特异性增强。
四、PCR技术在基因克隆方面的应用
（1）目的基因的直接克隆，（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针，进行分子检测等。
利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo(dT)为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链。
1、RT-PCR：是指以mRNA在反转录酶作用下合成的cDNA第一链为模板的PCR。
2、目前常用的反转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒的AMV反转录酶，另一类是来源于莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV反转录酶。
3、cDNA末端的快速克隆(RACE技术)：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。
4、RACE原理：
①利用特异性引物对mRNA进行反转录形成cDNA第一链；
②以RNaseH分解掉cDNA—RNA杂交体中RNA；
③在T4RNA连接酶的作用下将单链cDNA环化或首尾相连物；
④用两对基因特异性引物：A1、S1及A2、S2分别进行二次PCR扩增得到所需目的片段
5、反向PCR：PCR通常用于扩增位于两寡核苷酸引物之间的DNA区段，但是经特殊设计的PCR也可用来扩增那些位于已知序列外侧的序列，这就是反向PCR
6、2. PCR操作步骤：（1）反应体系的准备(20ul体积) (2) PCR程序（3）电泳检测
五、基因文库技术分离目的基因
1、文库：是指一种全体的集合。
2、基因文库：则是指某一种生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。
全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库
3、基因文库构建包括以下基本程序：① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择及制备。③ DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。
4、基因文库的类别：基因组文库和cDNA文库。
5、基因组文库：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。
6、cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
7、基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。
8、从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。
9、克隆文库：由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。
10、表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。
11、表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。
12、人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。
13、核基因组文库构建主要使用λ噬菌体载体或粘粒载体。
14、随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等的文库。对于随机文库:
N = ln(1-P) ；ln（1-x/y）
N：克隆数目 P：设定的概率值(如：0．99，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99) x：插入片段平均大小(15～20kb) y：基因组的大小(以kb计)
15、应用于cDNA文库构建可产生以下效果：
①能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库
②可以以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。
③能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。
16、常见人工染色体：酵母人工染色体、细菌人工染色体、P1噬菌体及其衍生人工染色体、可转化人工染色体、哺乳动物人工染色体、人类人工染色体、植物人工染色体、
17、线状染色体自我复制、分离和传递至少依赖于染色体上3个关键序列：
(1) 自主复制DNA序列(，ARS) ARS的生物功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性。
(2) 着丝粒DNA序列(CEN) 着丝粒确保复制了的染色体能够平均分配到子细胞中。
(3) 端粒DNA序列(TEL) 端粒的功能是与端粒酶结合，完成染色体末端复制。
18、mRNA差别显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速并行之有效的方法之一。mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR，简称为DDRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
19、共有12种oligo(dT)12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，每一种3，端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1／12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。这一过程叫做差异显示反转录，即DDRT。还需要另外一种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。这种5，随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3，端的不同位置上。
20、mRNA差别显示技术的优点：简便性、灵敏度高、可重复性较好
第五章、重组体的构建、转化及鉴定
一、质粒DNA的分离纯化
1.细菌培养物的生长
2.细菌的收集和裂解：
a.离心收集菌体
b.将沉淀溶于蔗糖-Tris-EDTA缓冲液，震荡。裂解细胞方法很多，共同步骤加溶菌酶和EDTA，破坏胞壁和膜。
c.加入SDS一类去污剂溶解球形，温和溶菌。
d.离心，使质粒DNA分子与细胞碎片分开。
e.大质粒和小质粒
3.质粒DNA的分离与纯化
a.离心后得到含质粒DNA上清液，用异丙醇沉淀得到粗品。
b.纯化的方法（1）聚乙二醇（2）氯化铯密度梯度离心
4、氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加CsCl和溴化乙锭，超速离心过夜，在紫外灯下吸取cccDNA，稀释沉淀cccDNA
5、沸水浴法：用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁
，沸水浴40秒钟，离心，用无菌牙签挑去沉淀物，乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA
6、外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用
7、在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：（1）实验步骤要尽可能地简单易行，(2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段，(3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。
8、将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转染和转化主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。
9、转化：严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。
10、转染：则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。
11、常用5种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落：
1.PCR﹑DNA测序鉴定。
2. 小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。
3. a—互补。
4. 抗性的插入失活。
5. 杂交筛选。
12、核酸分子杂交技术：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
13、如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。
14、DNA／DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系。
15、杂交筛选的两个不同的步骤：
第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法。第二，是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
16、印迹杂交：使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段称之为印记杂交技术。
17、northern RNA吸印杂交技术：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。
18、Western蛋白质杂交技术：将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。
第六章克隆基因的表达
1、原核生物基因表达的特点：
①原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。
④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。
⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。
2、调控区主要分为三个部分：操纵子、启动子及其他有调控功能的部位。
3、RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
4、将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：
①通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
②外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；
③必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；
④外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；
⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
5、基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。
6、启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，没有启动子，基因就不能转录。
7、启动子有两个保守区：（1）Pribnow盒（TATA盒或—10区）（2）—35区
8、通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。
9、S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA转译成蛋白质的主要因素之一。
10、终止子：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子
11、衰减子：是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。
12、前导序列：指位于编码区之前的不转译的mRNA区段。
13、在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型和非融合型两种表达蛋白。
14、非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。
15、融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。
16、影响克隆基因的表达效率的因素：启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等
17、提高翻译水平常用的途径：
(1) 调整S-D序列与AUG间的距离 S-D序列距AUG为7个核苷酸时最合适
(2) 用点突变的方法改变某些碱基
(3) 增加mRNA的稳定性
18、减轻细胞的代谢负荷常用的方法有：
（1）诱导表达使细菌的生长与外源基因的表达分开。（一般采用温度诱导或药物诱导）
(2) 表达载体的诱导复制
19、提高表达蛋白的稳定性，防止其降解的方法：(1) 克隆一段原核序列，表达融合蛋白
(2) 采用某种突变菌株 (3) 表达分泌蛋白
20、蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素：
①有一段信号肽；
②在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列；
③细胞内有相应的转运机制。
二、外源基因在真核细胞中的表达
1、根据质粒和复制方式不同，把它们分为整合型(YIp)、复制型(YRp)、附加体型(YEp)
2、以上3种类型载体的共同特点是：①能在大肠杆菌中克隆②含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记③含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插入。
3、穿梭载体：可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体。
4、Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒，简称Ti质粒。
5、外源基因导入真核细胞的方法：
(1) 利用酵母的原生质球进行转化 (2) 利用Li+盐进行转化
6、植物细胞的转化及其他基因转移方法：(1) 叶盘法（双子叶植物基因导人的主要手段）
(2)电击法（以原生质粒为受体细胞） (3) 基因枪法
7、哺乳动物细胞基因导入方法：（1）磷酸钙沉淀法 (2) 脂质体载体法 (3) 显微注射法
(4) DEAE葡聚糖转染技术
8、DEAE-dextran转染主要有两种不同的方法。
第一是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞；第二是受体细胞先用DEAE-dextran溶液预处理，然后再用来与转染的DNA接触。
9、重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。
一、遗传检测法：
1．根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法：
(1) 抗药性标记插入失活选择法 (2) β—半乳糖苷酶显色反应选择法
2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法
原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。
二、物理检测法：凝胶电泳检测法和R—环检测法两种。
三、核酸杂交筛选法：1．原位杂交 2. Southern印迹杂交 3. Northern杂交
四、免疫化学检测法：1、放射性抗体测定法2、免疫沉淀测定法
五、DNA—蛋白质筛选法：是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。现在这种方法已成功地用于筛选并分离表达融合蛋白质的克隆。
第七章重组体的筛选与检测
1、重组体的筛选与检测的方法：
遗传学检测法、物理检测法、核酸杂交筛选法、免疫化学检测法、DNA-蛋白筛选法
2、遗传学检测法分为：抗药性筛选法、营养缺陷型筛选法、显色筛选法、
3、物理检测法：限制性酶切图谱法
4、核酸杂交筛选法：菌落噬菌斑原位杂交法
5、外源基因产物检测：蛋白质生物功能测定法
6、免疫化学筛选法：放射性抗体检测法（标记放射性元素）、免疫沉淀检测法（抗原与抗体高度专一结合结合）、Western 印迹分析法
7、DNA-蛋白质筛选法：蛋白质生物功能测定法、蛋白质生物结构鉴定法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
第八章、RACE法分离目的基因
一、RACE即cDNA 末端的快速克隆，是由80年代方法是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，用PCR技术得到从基因内部某个特定位点到到3'或5' 端之间未知序列的方法。
二、基本原理
1、3'-RACE 特异性引物设计：GSP1 、GSP2
2、5'-RACE
3、5'和3 '序列的电子合并去掉5 '和3 '重复序列，把5 '和3 '序列进行合并。
4、SMART RACE
SMART技术是利用PowerScript反转录酶的末端转移酶活性，当反转录到mRNA的5'末端时，会自动在新合成的第一链cDNA末端加上3-5个“C”碱基，SMART Oligo的3'端具有几个“G”碱基与之互补配对，从而得到一个反转录的延伸模板，接下来反转录酶以SMART Oligo作为新的模板，继续cDNA合成至SMART Oligo的末端。得到的单链cDNA具有完整的模板RNA的5’末端，同时还具有一段与SMART Oligo序列互补的SMART接头。SMART接头与GSP 分别作为PCR引物，通过PCR合成大量的双链cDNA。
4、优点：
A.操作简便:相当于普通的RT-PCR. 两步即可完成不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应.
B.大大提高了获得全长cDNA的几率:逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个C ,由于有5 '帽子结构的 mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
C.可以从非常少量的样品中得到大量的高质量的cDNA ,只需要少至25ng 的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA.产物可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列扩全长cDNA（RACE)，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等.
5.环化5'RACE法（TaKaRa公司试剂盒）
二.方法
1.RNA的提取
高质量的RNA是实验成功的保证。电泳检测和保存时注意事项。
2.反应体系
反转录、两轮PCR反应体系按试剂盒说明书进行即可。第一轮PCR产物一般经稀释后作为第二轮PCR反应的模板。
3.电泳回收、连接测序
有多条带产生，回收时在合理的范围内尽量全部回收。
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
扬州大学基因工程期末试题复习要点整理
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程考试试题.doc
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
基因工程知识点梳理
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程总结
简述Southern blot,northern blot,western blot的原理，比较它们的不同. 答：Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光 Western Blot 与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 不同：所用于分析的对象不同。 Northern杂交用于分析RNA； Southern杂交用于分析DNA； Western杂交用于分析蛋白质。 转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？ 答：技术原理相同，用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，不但表达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）,还可以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。动物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；而植物一般采用农杆菌转化法或基因枪法将目的基因导入受体细胞。
基因工程和细胞工程测试题(附答案,可用于考试)
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程期末考试重点知识整理教学文案
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
专题一、基因工程知识点归纳
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
(整理)专题一基因工程.(最新整理)
专题一基因工程单元测试 A卷 一、选择题(共50分) 1．限制性内切酶的特点是( ) A．只能识别GAATTC序列 B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 C．识别黏性末端 D．切割质粒DNA的标记基因 2．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，可以想象这头牛( ) A．发生了基因突变 B．发生了染色体变异 C．发生了基因重组 D．没发生可遗传的变异 3．“工程菌”是指( ) A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到的新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选择出的能迅速增殖的菌类 4．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是( ) A．目的基因限制性内切酶运载体受体细胞 B．重组DNA RNA聚合酶内切酶连接酶 C．模板DNA信使RNA质粒受体细胞 D．工具酶目的基因运载体受体细胞 5．用DNA限制酶切割DNA时识别的核苷酸序列和切口是( ) A．一种限制酶只识别一种核苷酸序列，有专一性酶切位点 B．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列不同 C．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列相同，但酶切位点不同 D．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列和酶切位点都不同 6．根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是( ) A．用DNA探针测出目的基因 B．用mRNA探针测出目的基因 C．用mRNA反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mRNA 7．在人类染色体DNA不表达的碱基对中，有一部分是串联重复的短序列，它们在个体之间具有显著的差异性，这种短序列可用于( ) A．生产基因工程药物 B．侦查罪犯 C．遗传病的产前诊断
生物实训实验报告
生物实训实验报告 篇一：细胞生物学实验社会实践报告 建立一个动物细胞培养室与植物细胞培养室所需的条件与社会价值 无菌环境是细胞离体培养的最基本条件，所以构建一个细胞培养室需要保证工作环境不受微生物和其他有害物质污染，并且干燥无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。 一、基础实验室配置 ⑴消毒间：消毒间主要为了处理实验器材以及实验材料，营造一个无菌的试验环境，一般消毒间会配备超净实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉、酸缸等。 ⑵无菌操作间：一般由缓冲间和操作间两部分组成。缓冲间在外侧，多用于实验之前的准备，例如：更衣，准备实验材料，处理实验数据等，可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等。工作人员进入操作间一定要消毒并更衣。 （3）培养基配制间：主要用于配置细胞培养所用的培养基。主要包括冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、
药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。 （4）培养室：用于培养细胞，放置以接种的培养基等。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺 设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。 （5）洗涤间：主要用于清洗实验之后的用具。除配置水槽外，还需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等，有需求的还可以配置洗瓶机。 以上基础设施若实验室条件不够，可将消毒间，培养基配制间，洗涤间合并一起，但注意实验室卫生以及仪器摆放，房间要保持清洁，明亮。 二、辅助实验室 细胞学鉴定室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分
基因工程 重点复习
质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝 松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。