考马斯亮蓝标准曲线制作

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

一、标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1、凯氏定氮法

2、双缩脲法

3、Folin-酚试剂法

4、紫外吸收法

5、考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl （0.9%NaCl）配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

1、

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）

一、药品的配制步骤

（一）、实验准备：

1、准备所需的药品和玻璃仪器。

2、洗涤。（怎样洗涤算干净？）

（二）、计算：

1、百分比浓度计算：

1)、G/V比

例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。

2）、V/V比：

例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。

2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。

1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。

M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml

mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g

毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量

3）、0.1uNaCl配100ml

mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg

微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug

3、混合溶液配制的计算：

如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。

注意：1、分别标定体积计算

2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml

（三）、标量：

1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液

管。

2、电子分析天平的使用。

（四）、溶解：

1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。

2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤

烧杯三次左右，直到洗涤干净。

小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。

如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。

3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:

配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。C），过量会糊化。

（五）、定容：

1、用容量瓶定容；

2、用玻璃棒引流或用小漏斗；

3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切

为止（眼睛可视）；

4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。) （六）、装入试剂瓶，贴上标签。

标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。

（七）、清理实验场所。

二、磷酸缓冲液的配制。

（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。

选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。

（二）、计算：

1、注：书中有注明配置的量。

2、计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164g

NaH2PO4·12H2O称取31.21×0.1=3.121g

3、含有不同结晶水的换算。

书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？

11.87=（178/358）×X，X=23.87g。

（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。

即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。

（四）、按书中的量配制取量再混合。

如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。

（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。

（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。

计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；

取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H 3PO 4 ， 加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H 3PO 4 。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理 2、移液管使用 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A 595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A 595nm =a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测围），依照操作步骤1操作， 测出样品的A 595nm ，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A 595nm 值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A 595nm 值太大， 可以稀释后再测A 595nm 值，然后再计算。（五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

最优考马斯亮蓝染色Protocol

考马斯亮蓝染色 推荐选用前三种染色方法，另有传统考马斯亮蓝染色法和网上经验，染色效果不好，不推荐使用，仅供参考。（见后页比对照片） 操作步骤： 1、取出SDS-PAGE凝胶，经超纯水漂洗；（以下每步操作皆在摇床上进行。） 2、固定：将凝胶放入相应的固定液中，固定1小时； 3、染色：取出凝胶，放入相应的染色液中，过夜染色；（也可依实际情况缩短时间） 4、脱色（胶体法&改良法）：凝胶放入纯水中洗脱，换液数次； 脱色（Neuhoff法）：取出凝胶，用0.1 M Tris-H3PO4缓冲液（pH6.5）漂洗2分钟。再用25%乙醇淋洗＜1 min。然后再用10%乙酸中在室温脱色2小时即可。 试剂的配制： 1、胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：1.6%磷酸、8%硫酸铵、0.02% CBB-G250、20%乙醇 脱色液：H2O 2、改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：10%磷酸、10%硫酸铵、0.12% CBBG250、20%乙醇（着色1小时即可）。 脱色液：H2O 3、Neuhoff染色法： 固定液：12%三氯醋酸 染色液：2%磷酸、10%硫酸铵、0.02% CBB-G250、使用前振摇。染色时，取一定体积的染色液，加入1/4体积的甲醇。 脱色所需：0.1 M Tris-磷酸缓冲液（pH6.5）、25%乙醇、10%醋酸

4、传统考马斯亮蓝染色法： 固定液：45.4%甲醇、4.6%乙酸 染色液：45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB-G250 脱色液：5%甲醇、7.5%乙酸 5、网上方法： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：30%甲醇、10%乙酸、0.125% CBB-G250 脱色液：30％甲醇，10％乙酸 比对照片：每块胶左道是Marker（质量原因，未跑开( ˇ?ˇ )）上样量5μl，右道是BSA（分子量68kDa），上样量为3μg. Neuhoff法 传统法胶体法改良法网上法

标准曲线的绘制样本

标准曲线绘制 在分析化学实验中， 常见标准曲线法进行定量分析，一般情况下的标准工 作曲线是一条直线。 标准曲线的横坐标（X）表示能够精确测量的变量（如标准溶液的浓度）,称为 普通变量，纵坐标（Y）表示仪器的响应值（也称测量值，如吸光度、电极电位 等）, 称为随机变量。当X取值为X1, X2,……Xn时，仪器测得的丫值分别为丫1, 丫2,……Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中,用直尺绘出一条表示X 与丫之间的直线线性关系，这就是常见的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，标长准曲线不能任意延。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太 大或太小，应能近似地反映测量的精度。 由于误差不能完全避免，实验点完全落在工作曲线的的情况是极少的，特别是在误差较大时，实验点比较分散，它们一般并不在同一条直线上，这样凭直觉很难判断怎样才能使所连接的直线对于所有实验点来说误差是最小的，当前较好的方法是对实验点（数据）进行回归分析。 研究随机现象中变量之间相关关系的数理统计方法称为回归分析，当自变 量只有一个或X与丫在坐标图上的变化轨迹近似一直线时，称为一元线性回归。 甦2.6.1 —元线性回归方程的求法 确定回归直线的原则是使它与所有测量数据的误差的平方和达到极小值 设回归直线方法为 9 (2 - 15)

式中a表示截距，b表示斜率 9 (2 - 15)

假设Xi和Yi （i=1,2,3, ……,n）是变量X和Y的一组测量数据。对于每一个Xi值,在直线（卩“+^ ）上都有一个确定的旳“从X】值。但哲值与X 轴上Xi处的实际测定值Yi是不相等的, 与Yi之差为： 筈厂& +返AY’F-碍（2—佝 上式表示与直线（）的偏离程度，即直线的误差程度。如果全部n个测定引起的总偏差用￡（节厂印'表示,则偏差平方和s为 (2 - 17) 在所有直线中，偏差平方和s最小的一条直线就是回归直线，即这条直线 的斜率b和截距a应使s值达到最小，这种要使所有数据的偏差平方和达到最小 的求回归直线法称为最小二乘法。 根据数学分析的极值原理,要使s达到最小,对式（2 —17）中的a、b分别 求偏微分后得到 (2 —18) (2 —19) 是所有变量Xi和Yi的平均值。由于计算离均差较麻烦，可将式（2 — 18）变换为 n是测量的次数，也就是坐标图中实验点的数目。 (2 —20)

考马斯亮蓝染色套装使用说明

考马斯亮蓝染色套装使用说明 货号：P1305 保存：室温保存，至少一年有效。 规格：100ml+500ml 产品简介： 本考马斯亮蓝染色套装(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的 考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western 转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 产品内容： 考马斯亮蓝染色液100ml 考马斯亮蓝脱色液500ml 说明书1份 使用方法： 1、电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中(至少5倍胶体积)，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、将凝胶置于摇床上缓慢摇动，室温染色至少2小时，低丰度蛋白染 色需4小时以上。 3、染色结束后移除染色液，染色液通常可重复利用2-3次，但染色效

果会略有影响。 4、将凝胶浸泡于和染色液等量体积的脱色液中，摇床上脱色4-8小时，期间更换3-5次脱色液。 注意事项： 1.染色时间4小时以上效果最佳。 2.脱色可根据目的蛋白丰度和脱色效果随时终止，或延长脱色时间。 3.脱色越彻底，检测的蛋白量越低，脱色24小时一般可以检测出0.1ug蛋白量。 4.脱色后，将凝胶保存在水中，拍照或扫描保存图像。或制成干胶保存。 相关试剂： P1300-500考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒 PR1400低分子量蛋白MARKER PR1700预染次高分子量蛋白MARKER I1020IPTG溶液(50mg/ml) A101030%丙烯酰胺(29:1) T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒

标准曲线的作法

标准曲线的作法

标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成 倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以 减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。 ①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ： 2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。 在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线， 以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将 各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的 直线。 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在 直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比 色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 ④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线 方可应用。 ⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。 当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新 绘制。 ⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。 1.5 原子吸收光谱分析的定量方法 原子吸收光谱分析是一种动态分析方法，用校准曲线进行定量。常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和浓度直读法。如为多通道仪器，可用内标法定量。在这些方法中，标准曲线法是最基本的定量方法。 1.5.1 标准曲线法 前面已经指出，原子吸收光谱和原子荧光光

考马斯亮蓝染色法

蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法 目的要求 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。 二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。 2．未知蛋白质溶液。 三、器材 试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。 操作方法

常规考马斯亮蓝染色液

常规考马斯亮蓝染色液 简介： 考马斯亮蓝染色液(Commassie Blue Staining Solution)是以考马斯亮蓝R250为染料可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的常规染色或Western 转膜后PAGE 胶上残余蛋白的检测。采用常规染色方法需至少1h ，采用快速染色方法一般数分钟即可。本染色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)常规染色脱色方法 1、PAGE 电泳结束后取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 3、倒出染色液。染色液可以回收重复使用次。 4、加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。Leagene 推荐脱色液的配方是：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。 5、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色。期间更换脱色液2～4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1～2h 后即可出现。 6、完成脱色后把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。 (二)快速染色脱色方法 1、PAGE 电泳结束后取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 2、随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动。 3、倒出染色液。染色液可以回收重复使用2～3次。 编号 名称 PT0018 PT0018 Storage Commassie Blue Staining Solution 100ml 500ml RT 使用说明书 1份

最优考马斯亮蓝染色Protocol

最优考马斯亮蓝染色 P r o t o c o l Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

考马斯亮蓝染色 推荐选用前三种染色方法，另有传统考马斯亮蓝染色法和网上经验，染色效果不好，不推荐使用，仅供参考。（见后页比对照片） 操作步骤： 1、取出SDS-PAGE凝胶，经超纯水漂洗；（以下每步操作皆在摇床上进行。） 2、固定：将凝胶放入相应的固定液中，固定1小时； 3、染色：取出凝胶，放入相应的染色液中，过夜染色；（也可依实际情况缩短时间） 4、脱色（胶体法&改良法）：凝胶放入纯水中洗脱，换液数次； 脱色（Neuhoff法）：取出凝胶，用 M Tris-H3PO4缓冲液（）漂洗2分钟。再用25%乙醇淋洗＜1 min。然后再用10%乙酸中在室温脱色2小时即可。 试剂的配制： 1、胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：%磷酸、8%硫酸铵、% CBB-G250、20%乙醇 脱色液：H2O 2、改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：10%磷酸、10%硫酸铵、% CBBG250、20%乙醇（着色1小时即可）。 脱色液：H2O 3、Neuhoff染色法： 固定液：12%三氯醋酸

染色液：2%磷酸、10%硫酸铵、% CBB-G250、使用前振摇。染色时，取一定体积的染色液，加入1/4体积的甲醇。 脱色所需： M Tris-磷酸缓冲液（）、25%乙醇、10%醋酸 4、传统考马斯亮蓝染色法： 固定液：%甲醇、%乙酸 染色液：%甲醇、%乙酸、% CBB-G250 脱色液：5%甲醇、%乙酸 5、网上方法： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：30%甲醇、10%乙酸、% CBB-G250 脱色液：30％甲醇，10％乙酸 比对照片：每块胶左道是Marker（质量原因，未跑开( ˇˇ )）上样量5μl，右道是BSA（分子量68kDa），上样量为3μg.

一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法_江南

经验交流 一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法* 江南1)吴开力黄强潘苏华 (中山医科大学中山眼科中心,广州510060) 摘要介绍一种快速、简便、几乎无背景的考马斯亮蓝G250(CBB G250)染色方法.该方法所用试剂仅为稀盐酸和CBB G250,CBB G250的工作浓度为010015%,灵敏度达0102L g/带,染色2h达70%,4h以上或染色过夜即可充分染色.与以往的考马斯亮蓝染色方法相比,该方法有经济方便、灵敏度高、几乎无背景等优点,便于推广应用. 关键词电泳,染色方法,考马斯亮蓝G250 学科分类号Q5-33 蛋白质电泳后染色方法有多种:氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和银染色等.其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低,和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点,是最常用的染色方法.但它仍然存在一些问题,如考马斯亮蓝R250 (CBB R250)背景深、耗时长;CBB G250灵敏度不高;二者所耗试剂均较多.近几年,人们对考马斯亮蓝染色法作了许多改进,不同程度地改善了某些方面的问题,但仍未尽善.本文介绍一种经济快速,灵敏度高,几乎无背景的CBB G250染色方法. 1材料和方法 111材料 11111蛋白质样品:牛血清白蛋白(BSA)购自Bio-Rad公司;小牛晶状体的alpha晶体蛋白由Sephadex G200sf两次柱层析(100cm@116cm和40cm@116cm)分离获得. 11112染色液配制:1mol/L盐酸溶液(A), 1g/L CBB G250溶液(B);应用时用1ml A液和15ml B液混合加水至1L,搅拌混匀. 11113仪器:Bio-Rad Model1000/500电泳仪; Bio-Rad(M in-i Proteanò)电泳槽.DY-1500A型高压电泳仪;Pharmacia Biotech(M ultiphorò)电泳槽. 112方法 11211电泳:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦(IEF)参照郭尧君等[1]方法操作. 11212染色程序:a1电泳完毕,取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中,振荡1h;b1弃去盐酸溶液,重复步骤a;c1将胶置于染色液中,染色2~ 16h,连续振荡;d1弃去染色液,将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时(换液3~5次).最后对凝胶进行观察和照相,并将凝胶保存于1mmol/L盐酸溶液中. 11213凝胶染色图象分析:在染色和漂洗过程中应用Alphaimag e2000Documentation&Analysis System对凝胶照相(同一照相条件及参数)并作蛋白质条带染色强度分析;观察染色的强度变化时,以同一参照点分别测定蛋白质条带和凝胶背景的染色强度;测定漂洗时染色强度变化则以蛋白质条带的强度减去背景强度后作为该蛋白质条带的染色强度;染色强度和加样量的相关性分析采用Video DensitometeròSystem(USA Biomed Instrument.Inc),扫描每条蛋白质条带的染色强度并计算其与加样量的依存关系;染色的灵敏度通过加样不同浓度(\10ng)的BSA,染色后以肉眼能观察到的最低浓度的条带为标准. *广东省自然科学基金项目(970084)部分工作. 1)通讯联系人. Tel:(020)87330395,E-mail:yunj uyan@https://www.wendangku.net/doc/067236171.html, 收稿日期:1999-08-15,修回日期:2000-01-04 # 560 #生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2000;27(5)

考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝染色 一产品简介： 本考马斯亮蓝染色试剂盒(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 使用本试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。 本试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。二保存条件：室温保存，至少一年有效。 注意事项： 可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。 本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三使用说明： 1. 常规染色脱色方法： a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。 注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。 注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。 f．完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保 存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。 2. 快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。

标准曲线的制作方法

标准样品的准备 由于你做的是基因表达分析，样品的准备就比较简单了，因为你要知道都是相对的数值（你的对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 你实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和你的未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得Ct值。那么我们先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，我们既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样我们可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值我们知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，你只需要告诉软件你的哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮你把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来。 举例来说如何进行设置 先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。 选择要使用的荧光染料。

考马斯亮蓝快速染色液

考马斯亮蓝快速染色液 简介： 考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast staining solution)是以考马斯亮蓝G250为染料可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的快速染色，亦可用于Western 转膜后PAGE 胶上残余蛋白的检测。 Leagene 考马斯亮蓝快速染色液采用Leagene 自主研发的技术，在传统考马斯亮蓝快速染色液的基础上进行改良，是一种无毒的染色液，快速染色液，可以检测低达蛋白电泳条带。其核心优点在于：无需对凝胶进行固定，无需煮沸，无需脱色，染色时间短，操作更加简单。 组成： 自备材料： 1、 水平摇床或侧摆摇床 2、 蒸馏水 3、 (可选)加热装置 4、 20%甘油水溶液 操作步骤(仅供参考)： 1、PAGE 电泳结束后取凝胶放入约蒸馏水中，在摇床上摇动，弃液，重复上述步骤1次。 2、弃蒸馏水，加入Commassie Blue Fast staining solution ，使染色液能盖住凝胶。 3、(可选)凝胶置于考马斯亮蓝快速染色液中，在水浴锅或微波炉内加热至95～100℃，立即从加热装置中取出。(此步骤可以使染色提高灵敏度或加快染色进程，亦可省略。) 4、在摇床上摇动染色，蛋白量大的条带10～15min 左右会出现，大部分蛋白条带会在30～60min 左右出现。一般情况下，5h 能获得极佳效果。 5、出现清晰的目标蛋白条带即可停止染色，弃染色液。 6、加入适量的蒸馏水停止染色反应。亦可以在摇床上摇动脱色，以便减少背景干扰。 7、把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。 编号 名称 PT0013 PT0013 Storage 考马斯亮蓝快速染色液 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份

HPLC标准曲线的制作

HPLC标准曲线的制作 你可以随便弄一个浓度进一针样品看一看你这个样品的吸收度如何，再根据你样品的吸收度配置适当的底浓度样品逐个稀释这样可以连检测线定量限一起做了，一举3得(最后将你得到的峰面积根据你的进样浓度做一个线性回归就行啦，线性好的话R的平方一般接近于1 。 请问下各位在上样的时候是进同浓度的不同体积的样液绘制标准曲线好还 是先配好不同浓度的样液再以相同体积进样好呢, 这2个有什么区别吗, 请你看看分析化学书，有关精密度和线性的关系就知道了，实在不行，可以查看2005版药典一部附录新药质量标准的技术要求项下。自己看看就知道了。 我觉得进不同浓度相同体积好.因为你进样体积不同.在同样的方法下,系统的 各项参数可能会发生变化.而且你要通过进样体积的变化来控制浓度范围,这样也不大可行.一般我们进样的体积是5到20微升.而这个狭小的范围我们能调控的浓度线性范围非常窄.而通过事先调配不同浓度的话,就简单可行,而且浓度范围可以任意去控制.在实际操作中,老师也一直是教我们通过控制不同浓度来制作标准曲线的.以上只是个人的粗浅看法,欢迎高手们前来批评指正!!!!!!!!!! 前面几个站友说得都很好。我简单再补充一点自己的看法。 一般而言，还是不同浓度进相同体积做标曲是最规范的做法，而且可以有效避免人为误差。比如说，你的一个浓度配错了，如果以这个浓度为基准进不同的体积，会导致你最后的结果会整体偏大或偏小。所以要特别注意。 但实际工作中，如果你们的产品做得比较成熟了，而且做实验的经验比较丰富，大家为了省事还是多采用配一个浓度进不同的体积。 以进样量做标准曲线和以不同浓度进样相同体积做标准曲线差别不大。

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 试管编号0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

药品的配制（磷酸缓冲液的配制） 一、药品的配制步骤 （一）、实验准备： 1、准备所需的药品和玻璃仪器。 2、洗涤。（怎样洗涤算干净？） （二）、计算： 1、百分比浓度计算： 1)、G/V比 例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。 2）、V/V比： 例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。 乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。 2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。 1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。 M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量 3）、0.1uNaCl配100ml mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg 微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、混合溶液配制的计算： 如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。 注意：1、分别标定体积计算 2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml

考马斯亮蓝快速染色液

仅供科研版本号：170818 考马斯亮蓝快速染色液 【产品组成】 【保存条件】 4℃,12个月 【产品概述】 考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast staining solution)是以考马斯亮蓝G250为染料可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳胶的快速染色，亦可用于Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 考马斯亮蓝快速染色液采用自主研发的技术，在传统考马斯亮蓝快速染色液的基础上进行改良，是一种无毒的染色液，快速染色液只需1h，可以检测低达100ng的蛋白电泳条带。其核心优点在于：无需对凝胶进行固定，无需煮沸，无需脱色，染色时间短，操作更加简单。 【使用方法】 1、PAGE电泳结束后取凝胶放入约50～100ml蒸馏水中，在摇床上摇动5min，弃液，重复上述步骤1次。 2、弃蒸馏水，加入3～5倍体积以上的Commassie Blue Fast staining solution，使染色液能盖住凝胶。 3、(可选)凝胶置于考马斯亮蓝快速染色液中，在水浴锅或微波炉内加热至95～100℃，立即从加热装置中取出。(此步骤可以使染色提高灵敏度或加快染色进程，亦可省略。) 4、在摇床上摇动染色，蛋白量大的条带10～15min左右会出现，大部分蛋白条带会在30～60min左右出现。一般情况下，5h能获得极佳效果。 5、出现清晰的目标蛋白条带即可停止染色，弃染色液。 6、加入适量的蒸馏水停止染色反应。亦可以在摇床上摇动脱色5～10min，以便减少背景干扰。 7、把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。 【注意事项】 1、PAGE电泳后凝胶采用蒸馏水清洗的目的在于去除凝胶中的SDS等干扰物质。如果丌能充分去除SDS 会导致背景较高。如果凝胶很厚，洗涤时间应适当延长、洗涤次数应适当增加。蒸馏水洗涤去除凝胶中的杂质时，如果使用经过加热或沸腾的蒸馏水，每次洗涤时间可以缩短至1～2min。 2、染色时如果把凝胶和染色液一起放置在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。但加热时宜尽量避免沸腾，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。 3、如果希望染色的背景更低，希望获得更加清晰的蛋白条带，可以加入适量的室温蒸馏水进行洗涤。通过蒸馏水洗涤可以进一步降低背景。在4℃蒸馏水中浸泡过夜可以获得背景更低，条带更清晰的条带。在次日对4℃蒸馏水浸泡过夜的已经进行了染色的凝胶再同前一天一样进行染色和洗涤可以进一步改善染色效果，获得更好的染色蛋白条带。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.wendangku.net/doc/067236171.html,/ 第1页

常规考马斯亮蓝染色液

常规考马斯亮蓝染色液 货号：P1310 规格：100mL/500mL 保存：室温保存，有效期12个月。 产品说明： 考马斯亮蓝染色液(Commassie Blue Staining Solution)是以考马斯亮蓝R250为染料可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白电泳胶的常规染色或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。采用常规染色方法需至少1h，采用快速染色方法一般数分钟即可。本染色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。 自备材料： 水平摇床或侧摆摇床、蒸馏水、20%甘油水溶液、(可选)加热装置 操作步骤(仅供参考)： (一)常规染色脱色方法 1、PAGE电泳结束后取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。具体的染色时间取决于凝胶的厚度 和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2～4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 3、倒出染色液。染色液可以回收重复使用2～3次。 4、加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。推荐脱色液的配方是：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏 水。 5、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4～24h。期间更换脱色液2～4次，直至蓝色背景基本 上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1～2h后即可出现。 6、完成脱色后把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可 以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。

考马斯亮蓝染色总结

12.5％考马斯亮蓝染色液的配制（含30％甲醇，10％乙酸） 考马斯亮蓝R250 0.125g 甲醇30ml 冰乙酸10ml 加ddH2O至100ml 染胶1h~2h 脱色液配制（含30％甲醇，10％乙酸） 甲醇30ml 冰乙酸10ml 加dd H2O至100ml 注：1. 染色液可回收利用；室温保存即可；甲醇可以用乙醇代替。 2.其它脱色液： （1）用水脱色，但效果非常不好，建议不要用。 （2）脱色液也可以用0.5％mol/l的氯化钠，没有气味，脱色效果也不错。但胶可能会胀的厉害! （3）20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸（PH6.5） 先用tis-磷酸（PH6。5）漂洗2min，然后用20%的甲醇漂洗1min（最好不要超过1min），最后用20%的NH4SO4固定30min 3. dd H2O煮法脱色 PAGE胶染色完毕后，如果用一般的甲醇－乙酸脱色液进行脱色，一般至少需要2－3h，可利用蒸馏水煮的方法： （1）. 先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中，在电炉上煮沸。 （2）. 将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中，煮3～5min。 （3）. 将DD水倒掉，看胶是否已经脱净，如果还不好，可以用少量水再煮一次。 一般整个脱色过程最多15min即可搞定！还可以避免每次脱色时的醋酸味！ 4. 重复利用 （1）染色液和脱色液重复次数不一定的,可以根据他们的着染能力和脱色能力考虑是否换新的.夏季甲醇挥发快,用3~5次应该可以用.当然,用时要加盖. （2）脱色时注意防止挥发,脱色液可以用活性碳处理后反复用多次的. （3）脱色液反复使用，用两三次后用活性炭“包被”的滤纸过滤，滤纸可反复使用。脱色液反复使用后，胶有点泛红，但不影响观察，如果要发表，建议用新配脱色液。5. 加快染色和脱色速度 （1）染色和脱色都可以在微波炉中加热甚至煮沸，很省时间。但注意不要沸腾时间太长，否则容易把胶上煮出泡状的破损。 （2）若为了提高考染及脱色速度，可在45℃左右的水浴中进行，染色时间只需几分钟（其间轻轻晃动一二次，整个胶变为较深的亮兰色即可）。脱色也在水浴中（约需15分钟）， （3）胶放入用乙醇-乙酸配成的脱色液后微波加热10秒钟至微热,上摇床,10分钟后,倒掉,换新的脱色液重复一次,不超过半个小时也好了. （4）用乙醇和乙酸配脱色液,然后加热脱色，很快的，可加热到马上要沸腾为止。不但脱色可以，染色也可加热，速度也很快 （5）用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热，效果很好。 只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了！ （6）加入甲醇－乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去（把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦!(不要和胶混在一起）)，能吸去很多染料，加快脱色，效果不错。 6. 注意问题 （1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。 （2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；《分子克隆》：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。 7. 胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”）

ELISA标准曲线制作方法.pdf

ELISA标准曲线制作方法 一般而言，我们拟合ELISA标准曲线选用比较经典的Curve Expert 1.3或者Curve Expert 1.4软件。现在我们以Curve Expert 1.4为例，对ELISA标准曲线绘制方法进行详述。 Generally speaking, the standard fitting curve of ELISA is based on the classic software of Curve Expert 1.3 or Curve Expert 1.4. Now we will use the Curve Expert 1.4 to illustrate how to construct the ELISA standard curve. 1.点击Curve Expert 1.4，打开应用程序，截图界面如下： Click Curve Expert 1.4, and then open the application programs. You will see the following screen shot.

2.在X轴输入标准品的OD值，Y轴输入相应的标准品的浓度，截图界面如下： Input the value of OD on the X-axis against the concentration of samples on the Y-axis. The following screen shot will appear like this.

3.单击上图界面中的图标，出现如下界面 Click the icon showed on the above screen shot and you will see the following picture. 4.单击上图界面中的ALL OFF 按钮，出现如下界面 Click the ‘All Off’ button , you can see the following screen shot.

快速考马斯亮蓝染色

Mini VE 凝胶快速考马斯亮蓝染色 1.剥离凝胶置于小盒中（例如1ml枪头盒），使凝胶平展，在盒中加入100ml 试剂A，在 微波炉中用最大功率加热至溶液刚好沸腾（>90℃,约需30-60s，小心防止烫伤） 2.室温轻轻摇动冷却5min 3.弃去试剂A（可选用注射器吸取），加入100ml试剂B，用微波炉最大功率加热至溶液 刚好沸腾（>90℃，约需30-60s，小心防止烫伤） 4.弃去试剂B，用蒸馏水冲洗凝胶一次 5.加入100ml 试剂C，用微波炉最大功率加热至刚好沸腾（>90℃，约需1min） 6.弃去试剂C，用水冲洗凝胶一次。 7.加入100ml试剂D，用微波炉最大功率加热至刚好沸腾（>90℃，约需1min） 8.室温轻轻摇动冷却5min，弃去试剂D 9.加入100ml试剂D，室温轻轻摇动脱色至背景无色。 试剂A 试剂名称用量用量用量 异丙醇25 ml 125 ml 250 ml 醋酸10 ml 50 ml 100 ml 水65 ml 325 ml 650 ml 考马斯亮蓝R-250 0.05 g 0.25 g 0.5 g 总体积100 ml 500 ml 1000 ml 试剂B 试剂名称用量用量用量 异丙醇10 ml 50 ml 100 ml 醋酸10 ml 50 ml 100 ml 水80 ml 400 ml 800 ml 考马斯亮蓝R-250 0.005 g 0.025 g 0.05 g 总体积100 ml 500 ml 1000 ml 试剂C 试剂名称用量用量用量 醋酸10 ml 50 ml 100 ml 水90 ml 450 ml 900 ml 考马斯亮蓝R-250 0.002 g 0.01 g 0.02 g 总体积100 ml 500 ml 1000 ml 试剂D 试剂名称用量用量用量 醋酸10 ml 50 ml 100 ml 水90 ml 450 ml 900 ml 总体积100 ml 500 ml 1000 ml