发酵工程期末复习资料
第一章
第二节种子的扩大培养与保藏
种子扩大培养的目的：接种量的需要；缩短发酵时间、保证生产水平
优质种子必须具备下列五项条件：
(1)菌种细胞的生长活力强，移种到发酵罐后能迅速生长以缩短迟滞期，
(2)生理性状稳定，菌体生长过程稳定，
(3)具有适宜的菌体总量及浓度以能满足大容量发酵的要求;
(4)无杂菌污染，以确保整个发酵过程正常进行，
(5)保持稳定的生产能力，使最终产物的生物合成量持续稳定高产。
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
（一）液体种子制备
1，好氧培养：试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）：试管→三角瓶→卡式罐→种子罐二、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
1，种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。
2，种子罐级数的确定
种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：
菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积
确定种子罐级数需注意的问题：
种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会
种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子质量的控制
一、影响孢子质量的因素及控制
培养基
培养条件
培养时间和冷藏时间
1，培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。
原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。
水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。
菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
措施：培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；严格控制灭菌后培养基的质量；斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源
2，培养条件
（1）温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37?C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。
2）湿度
3，培养时间和冷藏时间
1）培养时间
一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。
措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。2）冷藏时间：
斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4?C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。
4，接种量：接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况
二、影响种子质量的因素及控制
孢子的质量培养基培养条件种龄接种量
1，培养基：营养成分适合种子培养的需要
选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高
营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
2，培养条件
（1）温度
（2）通气量：在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。
3，种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。
不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。
4，接种量
接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代
谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%
三、种子质量的控制措施
种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。四、种子质量标准
1，细胞或菌体
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；
霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。2，生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。
3，产物生成量;在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。
4，酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。
五、种子异常分析
菌种生长速度，过快或过慢；菌丝结团；菌丝粘壁
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养
→发酵
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
1.表面培养法
表面培养是一种好氧静置培养方法
针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。
相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固）界面向培养基内传递。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。
氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。
优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。
2.固体培养法：固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
固体培养具有以下优点：
①原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。
②防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。
③通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能
3.液体深层培养
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
几种深层培养法
①控制培养法②载体培养法③两步法
菌种的保藏与复壮
一、菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
二、菌种保藏的原理
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。
基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体
3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）
4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株
四、菌种的衰退与复壮
1，菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象
衰退：菌种出现或表现出负变性状
菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变
2，菌种退化的原因：
◆基因突变；
◆变异菌株性状分离；
?诱变的单菌落是由—个以上孢子或细胞形成
?菌落由—个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞
?单核孢子发生突变时，双链DNA上仅—条链上某个位点发生变化
◆连续传代
连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。
其它因素：菌种保藏不当；长条件不满足（培养基组成、培养条件）
3、防止衰退的措施
1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代
4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法
4.菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。
复壮措施：（1）对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化（2）淘汰衰退的个体（3）选择合适的培养基
空气的灭菌是好氧培养过程中的一个重要环节。
第一节空气中的微生物与除菌方法
（一）、空气除菌
?工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同而异。
?半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格，一般无需复杂的空所净化处理；
?密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等处理。
（二）发酵对空气无菌程度的要求
?在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3
二、空气除菌的方法
（一）热杀菌（二）静电除菌（三）过滤除菌（四）辐射杀菌
第二节介质过滤除菌
按过滤除菌机制不同而分为绝对过滤和深层介质过滤。
2、影响过滤效率的因素
（1）介质填充厚度与过滤效率的关系
（2）介质填充密度与过滤效率的关系：增加填充密度，可以提高过滤效率。
（3）空气流速与过滤效率的关系：在空气流速很低时，过滤效率随气流速度增加而降低，当气流速度增加至临界值后，过滤效率随气流速度增加而提高。
3、常用过滤介质
（1）棉花（2）玻璃纤维（3）活性炭4）超细玻璃纤维纸（5）烧结材料过滤介质
（6）新型过滤介质
4、提高过滤除菌效率的措施
（1）减少进口空气的含菌数
①加强生产场地的卫生管理，减少生产环境空气中的含菌数②正确选择进风口，压缩空气站应设在上风口③提高进口空气的采气位置，减少菌数和尘埃④加强空气压缩前的预处理（2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质
（3）设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的
（4）降低进入空气过滤器的空气的相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作。
①使用无油润滑的空气压缩机②加强空气冷却和去油、水③提高进入过滤器的空气温度，降低其相对湿度
三、空气预处理
空气预处理的目的：
（1）提高压缩前空气的洁净度（2）去除压缩后空气中所带的油水
四、空气除菌流程分析
?要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。
?气流速度可由操作来控制；
?要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在50%～60%的条件下过滤。
空气净化的流程
吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤---进入空气压缩机（120-150度）---冷却（20-25度），除去油、水，再加热至30-35度---最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
一、培养基的营养成分
微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶．将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。
糖蜜预处理的方法
由于糖蜜干物质浓度很大，糖分高，产酸细菌多，灰分与胶体物质很多，如果不预先进行处理，微生物是无法直接进行发酵的。因此必须进行预处理，糖密的处理程序包括稀释、酸化、灭菌、澄清和添加营养盐等过程。
1、加酸通风沉淀法
2、加热加酸沉淀法
3、添加絮凝剂澄清处理法
淀粉水解糖的制备
一、淀粉水解糖的制备方法
1.酸解法
2.酶解法（双酶水解法）：
优点：①反应条件温和②专一性强，转化率高；③可高浓度水解；④可使发酵培养基的组成简化；⑤糖液质量高。
缺点：反应时间长、设备多、需专门的培养条件、糖液过滤难。
3.酸酶结合法
（1）酸酶法：（2）酶酸法：
二、培养基的分类
（1）按培养基组成物质的化学成分:合成培养基、天然培养基。
（2）按物理性质:固体，液体
（3）按用途: 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等
（1）天然培养基
是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。
适合于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。
（2）合成培养基
是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素
适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。
（3）半合成培养基
多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。
大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。
液体培养基：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。
发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。
固体培养基分类：斜面试管、平板等
是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。
作用：固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。
在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。
选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。
增殖培养基：可以配制成适合某种微生
物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。
鉴别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。
三、发酵生产中的培养基类型
工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：斜面培养基，种子培养基，发酵培养基，摇瓶培养基
1．斜面培养基
作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。
特点：1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。2．种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基)：
培养种子的目的：
1.扩大培养，增加细胞数量；
同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。
种子培养基特点：
1. 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。
2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。
3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
3．发酵培养基
发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。
（1）根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。
对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。
（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。
（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。
四、发酵培养基的选择
(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。
(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。
(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。
(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。
(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。
(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。
7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。
(8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。
发酵培养基的设计和注意事项
1．提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。
2．配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。
3. 主成分与其他成分的配比。
4．控制合适的pH：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要已一定的pH环境，在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。
pH的具体控制方法
1. 可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分，使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。
2. 还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.
3. 控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。 4．避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀
葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。
硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。
5．注意代谢调节物的影响：
有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。
前体物质，诱导剂，阻遏物，抑制剂，金属离子
（二）发酵培养基的设计和优化
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。
1.培养基设计的步骤
①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；
②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。
生产用菌种的保藏
1、意义：菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是发酵生产如抗生素、
氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种，所以菌种保藏是进行微生物学以及和微生物育种工作的重要组成部分，是微生物工业生产的重要环节。
菌种不变异是相对而言的，实际上没有一种方法可使菌种绝对不变化。所以菌种保藏就是要采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。
2、主要目的
?保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能，提高菌种的存活率，减少菌种的变异，以及不被杂菌污染以利于生产上的长期使用。
3、原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态，使其生长繁殖受到抑制。人工创造条件①挑选优良纯种，且为菌种的休眠体（孢子、芽孢等）；②创造最有利休眠状态的环境条件，如低温、干燥、缺氧、缺乏营养物质等。
一个较好的菌种保藏方法，应能保持菌种的优良特性和较高的存活率，同时也因考虑到方法本身的经济、简便。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，因此一个菌种具体采用什么方法，要根据具体情况而定。
例如：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低，抗逆性极强的休眠体，称为芽孢。芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热、抗化学药物、抗辐射和抗静水压等方面，更是首屈一指。
一、操作方法
（一）、干燥保藏法干燥包括从培养物中除去水分和防止再吸水。
1、砂管保藏法和土壤保藏法（该法适用于芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌等的保藏）
2、硅胶干燥法
3、纸条保藏法
4、陶瓷珠干燥保藏下干燥的环境中密封保存。
5、冷冻干燥保藏法
（二）冷冻保藏法
1、在20％（体积分数）甘油中－50℃保藏
2、玻璃珠中甘油保藏
3、液氮冷冻保藏法（三）中间培养物保藏法
1、冰箱中的琼脂上
2、室温下的琼脂上
3、室温下的琼脂块上
4、矿物油保藏法
5、中间培养与单孢子选择结合保藏法
（四）基因工程菌的保藏
三、菌种保藏管理
1、活力测定：活力、纯度、理想性状的保留的测定。
菌株保藏后的活力筛选应以菌株产生次级代谢产物的能力为依据。
2、培养记录及计算机管理
菌株标记包括：
（1）“室内”收集及参考数字（2）来源及参考数字的来源，或其他收集的相当数字（3）菌株名或同义词（4）交替状态（5）分类（6）存放日期（7）产品产量（8）致病性/许可状况（9）培养条件：培养基、生长温度、PH及营养需要（10）分离培养基及方法（11）一定范围培养基的培养（12）培养物使用（13）保藏方法
3、螨的防止螨会破坏以某些保藏方式保藏的菌种或吃掉培养物或将培养物的孢子粘在身上，导致交叉感染。
4、安全
（1）病原体:操作应在通风厨中进行，各种器皿应进行消毒处理；废物处理前应进行灭菌；液氮保存时不能用玻璃器皿。
（2）干燥剂－P2O5: P2O5是腐蚀性的，应在通风厨中进行，分装时戴面具、手套。
（3）液氮: 脸部全面防护，铁手套，样品解冻未达到室温时需保护。
防止菌种退化的措施
菌种的退化：菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低，或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。
引起菌种退化的原因：
★核基因突变：菌种退化的主要原因是有关基因的负突变，这些负突变都是自发形成的。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。
★连续传代：连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。
★其它因素：温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例如在菌种保藏中基因突变率就随温度降低而减少。
菌种的复壮
纯种分离的方法：
（1）稀释分离法：是通过不断的稀释手段使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，这样分散的菌种就被固定在原处而形成菌落。
（2）平板划线法：是用划线的方法将混杂的微生物在平板表面分散开来，最后以单个菌体细胞生长繁殖，形成单个菌落，达到分离，得到纯种。
（3）组织分离法：用子实体的某一部分来分离菌种的方法，称为组织分离法。组织分离法简便,后代不易发生变异，能保持原菌株的优良特性。
第二章：菌种的来源
第一节微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长；有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长；有些微生物能进行复杂的代谢；有些微生物能利用较复杂的化合物；有些微生物能在
极端的环境下生长。
二：工业化菌种的要求
①能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物
②有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强
③遗传性能要相对稳定
④不易感染它种微生物或噬菌体
⑤产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）
⑥生产特性要符合工艺要求
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
三、食品酶制剂生产有关的微生物
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌
四、常用的基因表达系统
一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌，沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高;表达蛋白的纯化、分离及分析快速；外源基因的导入相对容易；已建立了整套表达理论及技术。
(二) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)：
生长迅速，营养要求不高，易培养；安全性好；比哺乳动物细胞操作简单；具有一定的修饰蛋白的能力。
一、菌种分离的一般过程:
土样的采取→土样预处理→富集培养→菌种初筛-----菌种复筛----性能鉴定--菌种保藏目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。
二、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
三、菌落的选出
从产物角度出发：在培养时以产物的形成有目的的设计培养基，利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度：菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。
第四节菌株选育、分子改造目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。
方法：基因突变，自然选育，诱变育种，基因的直接进化，基因重组。
自然选育定义：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。由于促
使变异产生的环境因素的影响较溺，不可能产生大的变异，也就难以依赖自然选育来获得高产突变株。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
自然选育操作步骤：
单细胞(孢子)悬液的制备-----平板分离-----挑选单菌落(注意形态的观察)-----发酵试验稀释涂布平板法
步骤： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌），高氏I号培养基（培养放线菌的
淀粉硝酸盐培养基），查氏培养基（培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基）冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。
2.制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取1ml 加入盛有9ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-
4、10-5和10-6的试管中吸取0.2ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂
培养基在37℃培养1-2days。
5、挑菌落：转至斜面，保存。
平板划线法：
1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
诱变剂：物理：紫外，快中子、β射线等
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍、5－溴嘧啶等
生物：噬菌体、转座子
诱变育种工作中应考虑的几个原则：选择简便有效的诱变剂；选优良的出发菌株；处理单孢子（或单细胞）悬液；选用最适剂量；利用复合处理的协同效应；利用和创造形态，生理与产量间的相关指标；设计或采用高效筛选方案或方法。
紫外线的诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。
充分利用复合处理的协同效应：青霉菌的选育中先用不足以引起突变的氮芥短暂处理，再用紫外线处理，可使诱变频率大大提高。
①杂交育种：杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
②原生质体融合优点：
(1)去除了细胞壁的障碍，亲株基因组可直接触合、交换，实现重组而不需要有已知的遗传系统；
(2)原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组而得到多种类型的重组子，参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的；
(3)重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。
(4)可以和其他育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
(5)可以先用温度、药物、紫外线等处理钝化亲株的一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子，这样往往也可以提高筛选效率。
④基因工程育种
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子
导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增或表达。
本章小结：
①涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力;②目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；③传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证④基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生物产品开发的进程。
培养基和设备的灭菌
在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？
1由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；
2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；
3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；
4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；
5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等
工业上具体的措施：
1.使用的培养基和设备须经过灭菌
2.好氧培养中使用的空气应除菌处理
3.设备应严密，发酵罐维持正压环境
4.培养过程中，加入的物料应经过灭菌
5.使用无污染的纯粹种子
一、灭菌的原理和方法
消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。
灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。
1、化学试剂灭菌法:化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 ; 适用范围：环境
空气、皮肤及器械的表面消毒
2、射线灭菌法：电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱
3、干热灭菌法 ;常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿
4、湿热灭菌法 :利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30min
适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌例：高压灭菌锅
5、过滤除菌法 :利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气
6、火焰灭菌法 :火焰 :适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口、酒精灯
二、培养基的灭菌
湿热灭菌原理：由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。
灭菌条件：121℃，30min。
灭菌不利方面：同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损失。
衡量热灭菌指标：
热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。
致死温度：杀死微生物的极限温度。
致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。
热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
三、微生物的热死规律和影响灭菌的因素
在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。
1、微生物的死亡速率：对数残留定律
2、死亡速率常数 （比死亡速率）
3.灭菌温度的选择
灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：
a.微生物的热致死温度。选择的温度应高于该温度。通常以芽孢为准。
b.营养成分的破坏。灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。因此，可择合适的灭菌温度和时间来调和二者之间的矛盾。
4、影响培养基灭菌的其他因素
（1）pH值的影响：pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0~8.0时微生物最不易死亡，pH <6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。从而改变细胞的生理反应，促其死亡。所以培养基的PH值越低，灭菌所需的时间越短。
（2）培养基成分：培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。
（3）培养基中的颗粒物质：培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
（4）泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭空气中的微生物。所以，对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。
（5）细胞含水量：细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低
（6）细胞菌龄：老细胞水分含量低，低龄细胞水分含量高。
（7）空气排除情况
在灭菌过程中，为什么要排除罐内空气？
蒸汽灭菌过程中，温度的控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。压力表显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应，即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。但是如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力，还包括了空气分压，因此，此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底。
四、分批灭菌和连续灭菌比较
培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念：
1.空消:
意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连
续灭菌的工艺，需要空消。
2.实消（实罐灭菌）：与空消对应，反应器里装有培养基。
3、分批灭菌与连续灭菌的比较
分批灭菌或连续灭菌都有各自的优点和缺点，现比较如下 ：
因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。 但是出于对设备的考虑，中小型罐还是采
用分批灭菌比较好。
第四章 柠檬酸发酵机制
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柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。
分子式C 6H 8O 7，分子量192.12
有两种形式
水合物：100℃时融解，密度1.542g/cm3(18℃) ； 无水物：无色晶体或粉末，熔点153℃
有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚
用途：1）食品行业2）医药行业3）化工行业4）其它行业
柠檬酸的生产：1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利
用黑曲霉发酵生成柠檬酸。
1953年，Jagnnathan 等证实了黑曲霉中存在EMP 途径的所有酶；
1954年，Shu 提出葡萄糖分解代谢中约80％走EMP 途径；
1958年，MeDomough 等发现黑曲霉还存在HMP 途径的酶，但HMP 途径主要存在于孢子
形成阶段；
1954－1955年，Ramakrishman 和Martin 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；
存在两个CO 2固定系统（需Mg 2＋、K ＋）：
1） 丙酮酸（PYR ）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）
2） 2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP ）在PEP 激酶的作用下，生成草酰乙酸
碳平衡和能量平衡
二、柠檬酸生物合成的代谢调节
（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、A TP对磷酸果糖激酶的抑制作用。
铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。
2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。
锰缺乏时，细胞内NH4＋浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。
3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。（二）TCA循环的调节
1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。
?顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。?2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤）
?3氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。
?氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需
?标准呼吸链产生A TP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使A TP积累，柠檬酸积累减少。
TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：
（1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键
（2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力
（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。
③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。
④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：
柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。
⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。
三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸
丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成
存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸提供。
作业：简述柠檬酸生物合成的代谢调节
第五章氨基酸发酵机制
第一节氨基酸发代谢调控酵的
氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，所生氨基酸作为微生物发酵的一大类代谢中间产物，其代谢调控一般采用下述方法中的一种或几种方法结合起来，以实现对生产菌种的代谢调控、大量合成和积累氨基酸。
一、控制旁路代谢
二、降低反馈作用物的浓度：控制反馈作用物浓度能克服反馈抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反应顺利进行；利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。
三、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用：使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。是一种与初级代谢产物结构类似但缺乏生理功能的化合物。
四控制细胞渗透性
生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。
青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。
六促进ATP的积累以利于氨基酸的生物合成
氨基酸的生物合成需要能量,A TP的积累可促进氨基酸的生物合成.P67
第二节谷氨酸发酵机制
谷氨酸，学名：α-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。谷氨酸生产菌能够在体外积累为菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：
①代谢调节控制②细胞膜通透性的特异调节③发酵条件的适合；
一、谷氨酸生产菌：节杆棒状杆菌属(Corynebacterium)短杆菌属(Brevibacterium)
小杆菌属（Microbacterium）菌属
国内常用菌株：北京棒杆菌；钝齿棒杆菌；天津短杆菌
2、谷氨酸生产菌的主要特征
1）GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失.
2）都是需氧型；3）多为生物素缺陷型
4）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化
5）二氧化碳固定反应酶系活力强；6）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱、乙醛酸循环弱；7）异柠檬酸脱氢酶活力强,提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸.形成氧化还原共轭体系.8）柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活力强；
9）具有向环境中泄漏谷氨酸的能力；10)菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
二、谷氨酸发酵机制
1) 谷氨酸脱氢酶(GHD)催化的还原氨基化反应
2) 转氨酶催化的转氨反应
α-酮戊二酸+ NH4+ + NADPH2 ——→谷氨酸+ H2O + NADP
3) 谷氨酸合成酶(GS)催化的反应
2、谷氨酸生物合成途径酵解途径(EMP)
己糖一磷酸途径(HMP 三羧酸循环(TCA) 乙醛酸循环二氧化碳固定反应
在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：
需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+
实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%-81.7%。乙醛酸循环标志酶：异柠檬酸裂解酶
DCA循环
作用：1。在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循有缺陷时C4二羧酸的补充2．在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量
谷氨酸生成期中要封闭DCA环？
通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%
谷氨酸积累机理：
1）谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的α-酮戊二酸脱氢酶活力，使α-酮戊二酸不能继续氧化；但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样就使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；在有过量铵离子存在时，α -酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应而生成谷氨酸。
2）谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷氨酸发酵时通过控制生物素亚适量，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。3）生成的谷氨酸不形成蛋白质，而分泌泄漏于菌体外。
4）谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸，而使谷氨酸成为最终产物。
但是，当环境条件发生变化时，菌体的生物代谢也会发生变化，谷氨酸发酵会向其他发酵转换，谷氨酸积累减少，而其他副产物积累量增加。如：溶氧适中----产生谷氨酸，不足—产乳酸，过量—产α-酮戊二酸；磷酸盐适中---产谷氨酸过量----产缬氨酸
3、控制细胞膜的通透性
谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的特异性变化，使细胞膜转变成谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成。有利于谷氨酸向膜外渗透的样式，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。这样，由于终产物谷氨酸不断地排出细胞外，使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，
控制细胞膜渗透性的方法：
1、化学控制法
通过控制发酵培养基中的化学成分，达到控制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态，以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。
生物素缺陷型：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。控制的关键：亚适量控制生物素
2）添加表面活性剂或饱和脂肪酸
作用机制：在不饱和脂肪酸合成过程中作为抗代谢物对生物素有拮抗作用，通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高细胞膜对谷氨酸的渗透性。关键：必须控制好添加表面活性剂、饱和脂肪酸的时间与浓度
3）油酸缺陷型
作用机制：油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，也即丧失脂肪酸合成能力，必须由外界供给油酸才能生长；油酸含量的多少直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸，使磷脂合成量减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸分泌积累于发酵液。关键：必须控制油酸的亚适量（细胞内生物素含量的多少影响甚微）
4）甘油缺陷型
甘油缺陷型不能合成 -磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长；在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，使谷氨酸得以积累。
控制的关键：必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物
以上都是通过控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜
5）添加青霉素法
在发酵对数生长期的早期添加青霉素抑制细胞壁的合成，使细胞膜处于无保护状态，又由于膜内外的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，增大了谷氨酸向胞外漏出的渗透性。
2、物理控制法
如利用温度敏感突变型（Ts）
突变发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上
关键：在生长的什么阶段转换温度是影响产酸的关键
总结：谷氨酸积累的理想途径，应具备：
（1）一定的糖酵解速度，不能走向乳酸等的发酵。
（2）生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶作催化作用下，缩合成柠檬酸，再经下面的氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。
（3）生成的乙酰CoA不向脂肪酸途径转化，全部趋于合成柠檬酸。
4）α-酮戊二酸氧化能力微弱，即不转化为琥珀酸，而成为马蹄形不完整的三羧酸环。（5）异柠檬酸裂解酶活性弱，即不形成二羧酸环。
（6）异柠檬酸脱氢酶活性强。
（7）L-谷氨酸脱氢酶活性强，在NH4存在下，由α-酮戊二酸转化为谷氨酸。（这点特别重要）（8）NADPH再氧化能力欠缺。谷氨酸菌有两种该类酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢酶。
（9）造成强的细胞膜透性，以便克服终产物反馈抑制和阻遏，使生产菌产生的谷氨酸不断地渗到细胞外进入培养基中。
第七章抗生素的发酵机制
一. 微生物的次级代谢与初级代谢的关系
1.初级代谢产物,次级代谢产物的概念
初级代谢产物：是指微生物产生的、生长和繁殖所必需的物质。
次级代谢产物：是指由微生物产生的，与微生物生长和繁殖无关的一类物质
2.次级代谢产物的特征：
1）次级代谢产物是由微生物产生的，不参与微生物的生长和繁殖。
（2）次级代谢产物的生物合成与初级代谢产物合成无关的遗传物质有关。
（3）次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期（trophophase）和生产期（idiophase）。（4）一般都产生结构上相类似的多种副组分。
（5）生产能力受微量金属离子和磷酸盐等无机离子的影响。
（6）次级代谢酶的底物特异性在某种程度上是比较广泛的。
（7）培养温度过高或菌移植次数过多，会使抗生素的生产能力下降。
（8）次级代谢中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物。
（9）在多数情况下，增加前体是有效的。
生物合成抗生素与初级代谢的关系：
（1）从菌体生化代谢方面分析
次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的
（2）从遗传代谢方面分析
次级代谢产物除与初级代谢产物一样受核内DNA的调剂控制外，还受到与初级代产物合成无关的遗传物质的控制，即核内遗传物质和核外遗传物质的控制。
二、抗生素的生物合成类型
A. 蛋白质衍生物
B.糖类衍生物
C.以乙酸为单位的衍生物
4、抗生素生物合成的代谢调节方式
(1)、细胞生长期到抗生素产生期的过渡
次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产物合成的酶受到阻遏。
A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入;
B.初级代谢的终点产物耗尽;
C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用;
D.高能化合物ATP形成减少后，阻遏作用也就解除;
E.在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用；当生长停止后,酶的结构改变,允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用,负责抗生素合成的酶开始生成。
(2)、酶的诱导作用
在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。
需要底物或底物的结构类似物(外源和内源诱导剂)
(3)、分解代谢产物的调节控制
碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。解除分解产物阻遏的方法:
(1).选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型;
(2)在培养过程中逃避分解产物阻遏.
A.培养过程中利用缓慢的碳源,连续流加葡萄糖;
B.使用能慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。
（4）、磷酸盐的调节
抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。
磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下二方面：
A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。
B.改变代谢途径。