建立细胞种属鉴别和种属间细胞交叉污染的快速有效检测方法

建立细胞种属鉴别和种属间细胞交叉污染

的快速有效检测方法

纳涛，袁宝珠*

中国食品药品检定研究院细胞资源储藏及研究中心

卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050

*通讯作者：袁宝珠，ybao4356@https://www.wendangku.net/doc/0f8374205.html,, 010-********，北京天坛西里2号，100050

项目支持：十二五重大新药重大专项课题/子课题：生产用细胞基质质量控制关键技术研究

确保用于生产用（重组蛋白、疫苗等生物制品生产）细胞基质、治疗性细胞产品，在体外培养过程中无不同种属间细胞交叉污染，是细胞质量控制中的重要内容之一。近年来国内干细胞及组织工程细胞在基础研究及临床应用研究中快速发展，进一步强调了对细胞间交叉污染检测的重要性。目前《中国药典》2010年版对于细胞种属鉴定及排除细胞间交叉污染的方法，主要是采用染色体分析、STR图谱和同工酶图谱分析法。这些方法主要的缺点是耗时、成本高，或是细胞用量大，以及可检定的种属范围窄。其中除STR图谱检测外，所有其他方法灵敏度都很低，而成熟的STR方法只适合对人源细胞的检测。

本研究借鉴以往基于细胞色素b(Cytochrome b)种属间进化保守性差异所建立的检测方法，并对以往报道中所使用的引物在序列特异性和反应条件上进行了优化，最后设计出可同时高效、敏感地检测10种常见动物种属来源细胞的PCR检测方法。

我们提出的方法是采用针对10个种属细胞鉴别的引物分别以不同浓度比例

混合，经过一次PCR扩增反应获得各种属来源相关的PCR产物，并通过产物分子量可同时鉴别细胞种属及是否存在种属间交叉污染（图1）。我们主要通过显著提高各种属所用引物的互不干扰性和特异性的基础上，提高检测的效率和敏感性，进而能做到同时鉴别10种不同细胞的种属来源。在进行种属间细胞交叉污染的检测

方面，本检测方法的灵敏度可达到至少千分之一细胞污染的检测水平（图2）。最后我们采用本方法，分别对不同来源的、经现版药典方法证明无种属鉴别和种属间交叉污染问题的5株人源细胞（MRC-5等）、5株中国仓鼠细胞（CHO）和5株非洲绿猴肾（Vero）细胞，进行了种属鉴定和种属间交叉污染检测结果的确认。确认结果符合药典方法检测结果，因此证明，新研发的检测方法，具备成为新的有效检测方法的巨大潜力。此外，本方法可扩展性好，可针对种属鉴别的要求，基于不同种属的细胞色素b序列，通过类似的引物设计规律，可设计出更多产物分子量有差异的不同种属鉴别引物。

总之，本方法在细胞种属鉴别和种属间交叉污染方面，有利于提高对中国生产用细胞基质及治疗性细胞产品质量控制的检测能力。

图1.混合引物体系可同时进行细胞种属鉴别和种属间细胞污染检测。将10种种属细胞的基因组DNA等量混合作为模板，用混合引物进行PCR扩增。结果显示混合引物可以特异性地扩增得到针对不同种属的PCR 产物（lane 11），且无种属间交叉影响。

图2. 多引物混合PCR扩增体系检测种属间细胞污染的灵敏度。分别将不同比例的人和小鼠基因组DNA混合作为模板，保持总基因组DNA量为10 ng，研究混合引物用于细胞污染检测的检测限。结果表明混合引

物的方法可用于检测细胞种属间污染的灵敏度可达到至少千分之一细胞污染的检测水平。