联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞的影响
?基础研究?
联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ对黑色素瘤Ｂ１６细胞的影响
余少鸿１，汤荣春１，ＰｅｒＨＢａｓｓｅ２
（１．云南省昆明市第一人民医院普外科 ６５００１１；２．美国匹兹堡大学肿瘤中心，
宾夕法尼亚州匹兹堡１５２１３‐１８６３）
摘 要：目的 探讨联合应用自然杀伤（ＮＫ）细胞及细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬ）对黑色素瘤Ｂ１６细胞的作用。方法 提取ＮＫ细胞及ＣＴＬ，分别用白细胞介素‐２（ＩＬ‐２）（６０００ＩＵ／Ｌ）、ＩＬ‐２（６００ＩＵ／Ｌ）及植物血凝素（８μｇ／ｍＬ）活化，流式细胞仪检测细胞表面受体，将ＮＫ细胞及ＣＴＬ互为靶细胞及效应细胞进行细胞毒性实验；以黑色素瘤Ｂ１６细胞为靶细胞检测ＣＴＬ的杀伤率。结果 ＮＫ细胞表面受体ＮＫ１．１＋的百分比在８７％以上，ＮＫｐ４６＋在９０％以上；ＣＴＬ表面受体的百分比在ＣＤ３＋９９％以上，ＣＤ８＋在９８％以上。ＮＫ细胞与ＣＴＬ相互无细胞毒性，联合应用ＮＫ细胞与ＣＴＬ明显增加对黑色素瘤Ｂ１６细胞的杀伤作用。结论 联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ对黑色素瘤Ｂ１６细胞有协同杀伤作用。
关键词：黑色素瘤，实验性；Ｔ淋巴细胞，细胞毒性；自然杀伤细胞
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１‐８３４８．２０１２．０９．００１文献标识码：Ａ文章编号：１６７１‐８３４８（２０１２）０９‐０‐０
ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ
ＹｕＳｈａｏｈｏｎｇ１，ＴａｎｇＲｏｎｇｃｈｕｎ１，ＰｅｒＨＢａｓｓｅ２
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ′ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００１１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１５２１３‐１８６３，ＵＳＡ．）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌｓａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＣＴＬ）ｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２（ＩＬ‐２）（６０００ＩＵ／Ｌ），ＩＬ‐２（６００ＩＵ／Ｌ）ａｎｄｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（８μｇ／ｍＬ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐ‐ｔｏｒｓ．ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｗｅｒｅｓｅｒｖｅｄａｓｔａｒｇｅｔａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｅａｃｈｏｔｈｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｂ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｔｏａｓｓａｙｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆＣＴＬ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＮＫｃｅｌｌｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒＮＫ１．１＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ８７％，ＮＫｐ４６＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９０％．ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＣＴＬｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ３＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９９％，ＣＤ８＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９８％．ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｓｈｏｗｅｄｎｏｍｕｔｕａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｐｏｓｓｅｓｓｅｓｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｌａｎｏｍａ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ；Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ；ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ
细胞免疫在肿瘤免疫中发挥重要的作用，其中，自然杀伤（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）细胞及细胞毒Ｔ细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏ‐
ｃｙｔｅ，ＣＴＬ）是体内主要的免疫细胞［１］。研究表明，白细胞介素‐２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２，ＩＬ‐２）及血凝素激活的ＣＴＬ体外能有效破坏肿瘤细胞［２］。ＣＴＬ能够识别结合主要组织相容性复合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）Ⅰ类抗原及来源于小鼠及人类多种肿瘤细胞的多肽抗原。临床及动物实验表明，ＭＨＣⅠ类抗原限制性导致ＣＴＬ不能有效杀灭肿瘤细胞。下调肿瘤细胞表面人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）是肿瘤细胞逃避ＣＴＬ攻击的重要原因之一［３］。研究表明ＭＨＣⅠ类抗原部分或全部缺失是黑色素瘤对ＣＴＬ不敏感的因素之一［４‐５］。
ＮＫ细胞表达自杀相关因子配体（ｆａｃｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｕｉｃｉｄｅｌｉｇａｎｄ，ＦａｓＬ）、颗粒酶Ｂ（ｇｒａｎｚｙｍｅＢ，ＧｚｍＢ）及穿孔素（ｐｅｒｆｏｒ‐ｉｎ）。ＮＫ１．１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６活化时表达活化性受体ＮＫＧ２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ‐ｋｉｌｌｅｒｇｒｏｕｐ２，ｍｅｍｂｅｒＤ），同时，ＮＫ细胞分泌大量细胞因子［如肿瘤坏死因子α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌ‐ｐｈａ，ＴＮＦ‐α）、ＩＬ‐１２及干扰素α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα，ＩＦＮ‐α）］，通过Ｆａｓ‐ＦａｓＬ、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ｔｕｍｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ，ＴＲＡＩＬ）、ＮＫＧ２Ｄ‐主要组织相容性复合体‐Ⅰ类分子链相关蛋白Ａ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍ‐ｐｌｅｘｃｌａｓｓⅠｃｈａｉｎ‐ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＡ，ＭＩＣＡ）等途径，抑制肿瘤细胞增殖及分化，促进肿瘤细胞凋亡。研究表明，ＮＫ细胞可直接杀伤血液循环的肿瘤细胞及肿瘤组织［６］，并且对黑色素瘤肺转移也有抑制作用［７‐８］。细胞因子ＩＬ‐２可调节其杀伤及分泌功能［９］。ＮＫ细胞可识别靶细胞“非己”性改变，能够识别无
ＭＨＣ表达或ＭＨＣ低表达的肿瘤细胞，有利于靶向定位于肿瘤及转移部位［１０］，而ＣＴＬ能够识别结合ＭＨＣⅠ类抗原的肿瘤细胞，因此，推测联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ可提高对肿瘤细胞的抑制作用。
１ 材料与方法
１．１ 动物及肿瘤细胞培养 Ｃ５７ＢＬ／６雌性裸鼠购自Ｊａｃｋｓｏｎ实验室，匹兹堡大学肿瘤中心无菌环境饲养，８～１２周龄。黑色素瘤Ｂ１６细胞为匹兹堡大学肿瘤中心实验室保存培养，于ＲＰＭＩ１６４０培养基（含１０％灭活小牛血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、０．８ｇ／Ｌ链霉素及１．６×１０５Ｕ／Ｌ青霉素）中常规培养。１．２ ＮＫ细胞及ＣＴＬ的分离培养、纯化及表面受体检测 断颈处死Ｃ５７ＢＬ／６裸鼠，取脾脏磨碎，离心５ｍｉｎ（离心半径８ｃｍ，１２００ｒ／ｍｉｎ），溶解红细胞３ｍｉｎ，再离心、过滤，制成脾单细胞悬液，计数，置于Ｔ７５培养瓶中，并加入２５ｍＬ细胞条件培养基及６０００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２培养。２天后，用抗白细胞分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＣＤ）３抗体磁珠（美国ＤｙｎａｌＢｉｏ‐ｔｅｃｈ公司）纯化，敲除Ｔ细胞，制成ＮＫ细胞；再加入６０００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２（美国ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ公司）培养２～３天后，制得
活化ＮＫ（ａｄｈｅｒｅｎｔＮＫ，Ａ‐ＮＫ）细胞。收获细胞，将每管０．５ｍｏｌ／Ｌ细胞离心、取沉淀、混匀，分别加入抗体ＮＫ１．１、ＮＫｐ４６、ＣＤ３、ＣＤ４及ＣＤ８，采用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）检测其表面受体。脾单细胞悬液的制备同上，加入８μｇ／ｍＬ植物血凝素（美国ＤＩＦＣＯ公司）及６００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２进行培养。２天后，可见大量细胞聚集成团，静置５～７ｍｉｎ，小心吸弃上清液，即可获得细胞团块，再加入６００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２培养２天，即可制得
ＣＴＬ。１．３ ＮＫ细胞及ＣＴＬ功能的检测 将５１Ｃｒ溶液与靶细胞（ＮＫ细胞或ＣＴＬ）混合，于３７℃培养１ｈ左右，洗去游离５１Ｃｒ后，即可得到５１Ｃｒ标记的靶细胞。收集ＣＴＬ或ＮＫ细胞为效益细胞，将待检细胞毒性的细胞与５１Ｃｒ标记的靶细胞混合４ｈ，用γ射线测量仪检测上清液的放射性每分钟计数（ｃｏｕｎｔｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ，ＣＰＭ）值，根据公式即可计算出ＮＫ细胞及ＣＴＬ的杀伤率。特异性细胞杀伤率（％）＝（特异性释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）÷（最大量释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）×１００％１．４ ＮＫ细胞及ＣＴＬ体外对黑色素瘤细胞作用的检测 设立对照组，收集ＮＫ细胞和ＣＴＬ，计数并调整细胞，使ＮＫ细胞与Ｂ１６细胞比值从１０∶１稀释至０．３１２∶１，ＣＴＬ细胞与
Ｂ１６细胞比值从２００∶１稀释至３．１２∶１，分别用５１
Ｃｒ标记靶细胞，使这２种靶细胞１∶１混合后，轻轻旋转９６孔板（使细胞紧密接触），３７℃孵育４ｈ。即可检测上清液ＣＰＭ值，计算待检细胞的杀伤率。特异性肿瘤细胞杀伤率（％）＝（特异性释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）÷（最大量释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）×１００％２ 结 果
ＮＫ细胞及ＣＴＬ的形态、大小均匀，ＮＫ细胞表面受体ＮＫ１．１＋的百分比在８７％以上，ＮＫｐ４６＋在９０％以上；ＣＴＬ表面受体ＣＤ３＋的百分比在９９％以上，ＣＤ８＋在９８％以上，见图１～３。ＮＫ细胞、ＣＴＬ相互无细胞毒性，见图４、５。联合应用ＮＫ细胞与ＣＴＬ对Ｂ１６细胞的杀伤活性见图６。
图１ ＮＫ细胞（左）及ＣＴＬ（右）的形态表现（倒置
相差显微镜×
２００）
上：ＣＤ３；左下：ＣＤ８；右下：ＮＫｐ４６。
图２ ＣＴＬ细胞表面受体的表达情况（
流式细胞术）
左上：ＮＫ１．１；右上：ＮＫｐ４６；左下：ＣＤ８；右下：ＣＤ３。
图３ ＮＫ细胞表面受体的表达（
流式细胞术）
图４ ＮＫ细胞：ＣＴＬ的细胞毒性（４
ｈ）
图５ ＣＴＬ细胞：ＮＫ的细胞毒性（４
ｈ）
图６ ＮＫ细胞与ＣＴＬ对Ｂ１６细胞的杀伤活性３ 讨 论
研究证实体内外活化ＮＫ细胞及ＣＴＬ均需要ＩＬ‐２维持，ＩＬ‐２是激发细胞因子（如ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ）级联反应的关键因素，活化的ＮＫ细胞及ＣＴＬ均有较高的细胞活性及较高的纯化度［８］，同时，也可应用其他细胞因子如ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１８活化ＮＫ细胞，以ＩＬ‐２活化的ＮＫ细胞对肿瘤细胞杀伤力较强［１１‐１２］。为进一步研究ＮＫ细胞与ＣＴＬ是否具有协同作用，首先要了解ＮＫ细胞与ＣＴＬ之间是否能互相杀伤，如果两者之间互相杀灭，那么就不能联合应用这两种细胞共同作用于肿瘤细胞，本研究表明，这两种细胞并不相互作用，因此，可同时应用ＮＫ细胞与ＣＴＬ作用于肿瘤细胞。研究表明ＮＫ细胞与ＣＴＬ混合后对恶性黑色素瘤细胞具有叠加作用，在ＣＴＬ与Ｂ１６细胞数之比为２５∶１时，ＣＴＬ与ＮＫ细胞存在协同作用。ＣＴＬ单独应用，ＣＴＬ与肿瘤细胞数之比为２００∶１时，其杀伤肿瘤细胞效率为２１．５７％；ＣＴＬ与肿瘤细胞数之比为１０∶１时，其杀
伤肿瘤细胞效率为３２．４３％。当ＮＫ细胞与Ｂ１６细胞数之比为１０∶１，ＣＴＬ与Ｂ１６细胞数之比为２５∶１时，两种细胞对肿瘤细胞杀伤率为４６．７２％，具有明显协同作用。其机制可能在于ＣＴＬ能够识别并结合ＭＨＣⅠ类抗原。ＭＨＣⅠ类抗原的限制性导致ＣＴＬ不能有效杀灭肿瘤细胞［１３］。但是，ＮＫ细胞可识别靶细胞“非己性”改变，能够识别无ＭＨＣ表达或ＭＨＣ低表达的肿瘤细胞，因此，同时应用这两种细胞可协同杀伤肿瘤细胞，有研究表明，ＩＦＮ‐γ在这种协同作用中发挥关键作用［１４‐１５］，为进一步联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ治疗及预防肿瘤复发提供理论基础。
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（收稿日期：２０１１‐１０‐０９ 修回日期：２０１２‐０１‐２２）
两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的构建和比较_李佳悦
?基础论著? 两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的 构建和比较 李佳悦朱欣凯王萍钮利喜 【摘要】 目的 采用尾静脉接种法建立C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移 动物模型，观察小鼠肺部成瘤过程，并对两种模型进行比较。制作肿瘤切片，通过HE染色分析两种 肿瘤模型的组织病理学特征。方法培养B16黑色素瘤细胞至对数生长期时收集细胞，用生理盐水 调整浓度为5×106/ml备用。将备好的B16细胞通过尾静脉接种小鼠，每只注射0.2 ml。接种后，两种 小鼠每隔一定时间随机各取一只小鼠处死，解剖取肺，观察成瘤情况，计数肺表面的瘤结节数，测 量瘤结节大小。以出现瘤结节开始计时，记录小鼠荷瘤时间。形成稳定的肿瘤模型后，制作肿瘤组 织切片，HE染色进行病理学观察分析。结果B16细胞尾静脉接种C57BL/6小鼠和KM小鼠，均能形 成肺转移模型，但两种小鼠成瘤情况差异较大。KM小鼠的荷瘤时间比C57BL/6小鼠荷瘤时间长。HE 染色结果显示黑色素瘤B16细胞在两种小鼠的肺组织中均形成巢团状的转移瘤，且两种模型肺转移 瘤均多分布在支气管周围。结论通过对C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠 模型的成瘤特点的分析比较，可以看出KM小鼠更适合用于研究新的肺肿瘤治疗药物，为研究黑色素 瘤的发生发展提供依据。 【关键词】 B16细胞；肺转移小鼠模型；尾静脉 Establishment and comparison of two kinds of lung metastasis mouse models Li Jiayue, Zhu Xinkai, Wang Ping, Niu Lixi. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China Corresponding author: Niu Lixi, Email: nlx@https://www.wendangku.net/doc/0717773689.html, 【Abstract】 Objective To observe the tumorigenic process, two pulmonary metastatic models of melanoma B16 cells were established and compared using C57BL/6 and KM mice, respectively. Methods Tail intravenous injection of 1×106 melanoma B16 cells/mouse resulted in macroscopic disease by 4-9 days and a randomly selected mouse was sacrificed in a certain interval to survey the morphologic characteristics of melanoma. The number of tumor nodules in the lung surface was counted and the size of tumor nodules was measured. The tumor-burdened time of mice was recorded and the tumor sections were made for pathological observation and analysis. Results HE staining showed that each mouse in the B16 cell injection groups had nest-shape metastatic foci distributed around the bronchi in the lung, but the tumor-burdened time was significantly different which was longer in KM mice than in C57BL/6 mice. Conclusion By comparing the characteristics of two pulmonary metastatic models of C57BL/6 mice and KM mice, we can concluded that the B16 melanoma models in KM mice were ideal tumor models which were suitable for researching the new drugs in lung cancer treatment. Our research would provide evidence for the occurrence and development of melanoma. 【Key words】 B16 cells; Pulmonary metastatic mouse model; Tail vein 肺肿瘤又叫支气管肺癌（lung carcinoma）是常见的恶性肿瘤之一，近年来肺癌的发病率和死亡 DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2015.19.022 基金项目：山西省青年基金资助项目（2011021035-5） 作者单位：030006 太原，山西大学生物技术研究所 通讯作者：钮利喜，Email: nlx@https://www.wendangku.net/doc/0717773689.html, 率都有明显增高的趋势，已成为人类因癌症死亡的主要原因[1-2]。但其发病机制目前尚未完全阐明，目前治疗方法以化疗和放疗为主，治疗带来的不良反应给患者造成极大的痛苦，治疗效果亦不尽人意。新的有效的肺肿瘤治疗的方法一直在探索中。肿瘤模型是研究恶性肿瘤病因、发展过程和探索肿瘤治
黑色素瘤相关知识
皮肤 表皮：细胞分为两大类，一类是角质形成细胞，占表皮细胞的绝大多数；另一类是非角质形成细胞，散在于角质形成细胞之间，包括黑色素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞。 表皮的分层和角化： 手掌和足底的表皮结构，从基底到表面可分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角层五层。薄皮的表皮，颗粒层和透明层不明显，并且角质层较薄。
1、基底层：附着于基膜上，由一层矮柱状的基底细胞组成。胞质内因有丰富的游离核糖体而呈嗜碱性，有散在或成束的角蛋白丝。 2、棘层 由4-10层多边形、体积较大的棘细胞组成。细胞表面有许多短小的棘状突起。相邻细胞的突起镶嵌，并以大量的桥粒相连。胞质呈弱嗜碱性。 3、颗粒层 由3-5层梭形细胞组成。颗粒层细胞的核与细胞器已退化，胞质内板层颗粒增多，出现许多形状不规则、强嗜碱性的透明角质颗粒。 4、透明层 由2-3层扁平细胞组成。细胞界限清楚，本层强嗜酸性。 5、角质层 由多层扁平的角质细胞组成。细胞完全角化，干硬，嗜酸性。 非角质形成细胞 1、黑素细胞 是生成黑色素的细胞。包体多分散在基底细胞之间，其突起伸入基底细胞和棘细胞之间。HE染色胞体呈圆形，核深染而胞质透明，突起不能辨认。 2、朗格汉斯细胞 散在与棘层浅部，HE染色呈圆形、核深染、胞质清亮。 真皮 1、乳头层 是紧靠表皮的薄层疏松结缔组织，向表皮突出形成真皮乳头。含有丰富的毛细血管和游离神经末梢，在手指掌侧的真皮乳头内含较多触觉小体。
2、网织层 为乳头层下放较厚的致密结缔组织，内有粗大的胶原纤维束交织成网，并有许多弹性纤维，。此层内有较多血管、淋巴管和神经，深部常可见环层小体。
原位恶性黑色素瘤 1、恶性雀斑 表皮基底层色素细胞增多，可呈单排或大小不等巢状增生。增生细胞有不同程度的异型性。异型性细胞单个或成群侵及表皮，特别是单个异型性黑色素细胞侵及表皮浅层具有诊断意义。增生黑色素细胞呈梭形、多角形、上皮样，有多形性、多为梭形，胞浆大多透明，内常可见多少不等色素。在表皮内细胞团与其周表皮界限不清，呈浸润性，胞核较大，深染，形状不规则，极向紊乱。
恶性黑色素瘤
恶性黑色素瘤 一、 流行病学恶性黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤。该病起病隐袭、高度恶性、预后很差，临床上也比较少见，约占皮肤恶性肿瘤的1%左右。恶性黑色素瘤可见于任何年龄，较多见于中年和老年，女性稍多于男性。该病多发生于白色人种，尤其是有日晒史的人群，美国的年发病率约为10-15/10万，澳大利亚的昆士兰邦的年发病率高达16／10万，而我国的发病率较低，约为0.4-0.5/10万。但是近年来，不论国内或国外，恶性黑色素瘤的发病率均在不断上升。同样，死亡率也在不断增加，澳大利亚、新西兰的恶性黑色素瘤死亡率最高（5－6/10万），中国和日本较低（约0.2/10万）。 二、 临床表现 （一）发生部位 恶性黑色素瘤可发生于身体的任何部位，最常见于女性的四肢和男性的躯干，多发生于皮肤和邻近皮肤的粘膜，故而也常称皮肤恶性黑色素瘤。亦可见于眼球的色素膜、脑膜的脉络膜丛、以及消化道粘膜等皮肤以外的部位。皮肤黑色素瘤起源于与黑色素细胞有关的皮损，起初通常为棕色或蓝黑色小点，呈浸润性生长，生长迅速，质韧无毛，大小不等，迅速破溃，沿淋巴管可见细线状色素沉着，围绕原发灶可出现多发的隆起型卫星结节。 （二）皮肤恶性黑色素瘤分型： 1．表浅播散型黑色素瘤（SSM）：占所有皮肤恶性黑色素瘤的70%，早期为扁平状，至垂直生长期时皮损进一步增大，周边呈锯齿状。 2．结节型黑色素瘤（NM）：占所有皮肤恶性黑色素瘤的15-30%，侵袭性较强，颜色较深，多为蓝黑色，类似血泡或血管瘤，也有红色、灰色、紫色，甚至无色。 3．雀斑型黑色素瘤（LMM）：较少见，约占所有皮肤恶性黑色素瘤的4-10%，几乎均局限于头颈部，多为棕黄色皮损，周边纤细迂曲，呈锯齿状，较少出现转移。 4．肢端雀斑型黑色素瘤（ALM）：仅占所有皮肤恶性黑色素瘤的2-8%，病变特征性出现于手掌、足底或甲床下，呈棕黄色或褐色，可突然出现颜色改变。多发生于老年人，发病较快，侵袭性强，容易出现转移。除了皮肤以外，约有10%的恶性黑色素瘤发生于皮肤以外的部位，其中常见的部位包括眼球的色素膜、脑膜的脉络膜丛、以及消化道粘膜等。其中色素膜黑色素瘤是眼内最常见的恶性肿瘤，根据发生的部位可以分为虹膜、睫状体和脉络膜黑色素瘤，一般生长缓慢、恶性程度较低、预后优于皮肤黑色素瘤。消化道粘膜黑色素瘤发生率不高，主要发生于肛门区，临床无特异性症状，淋巴结常受累，预后较差，还可发生于口腔粘膜或食管粘膜。淋巴结是恶性黑色素瘤最常见的转移部位，主要表现为区域淋巴结转移，远处转移常见的部位包括皮肤及软组织、肺、肝脏等。 三、诊断与鉴别诊断 皮肤黑色素瘤可发生于皮肤的任何部位，多见于白皙或光亮的皮肤，尤其有日光暴露史的人群。与含色素的皮损密切相关，当皮损出现以下变化时，常提示早期皮肤恶性黑色素瘤的可能：①颜色改变，尤其以蓝黑色、灰色、棕色和杂色最为重要；②表面不规则隆起、粗糙、脱屑和渗液等；③周边参差不齐，呈锯齿状；④皮损迅速增大、持续瘙痒、结痂或出现卫星
中国黑色素瘤诊断治疗共识
《中国黑色素瘤诊断治疗共识》 恶性黑色素瘤(MM)是恶性程度较高,临床预后较差的恶性肿瘤。在西方国家属于发病率前5位而死亡率第1位的恶性肿瘤。在我国,由于以前MM发病率较低,未引起人们足够重视,近年来其发病率增长迅速,而临床医生对其诊断和治疗与其它恶性肿瘤相比较为生疏。在MM的规范化诊断治疗方面,与西方国家也存在较大差距。 为宣传普及黑色素瘤知识并促进中国MM诊断治疗的规范化,2007年5月,在解放军南京八一医院秦书逵教授及北京肿瘤医院郭军教授的倡导下,CSCO黑色素瘤专家委员会正式成立,并先后在杭州、南京等地召开了专家组会议。小组十几位专家教授以循证医学证据为基础,综合分析评价了国内外相关资料, 于2008年8月正式发布第一版《中国黑色素瘤诊断治疗共识》,并希望通过循证医学证据的不断补充,最终制定出适合中国患者的黑色素瘤诊治指南,为国内临床医生提供实用的临床实践工具。 1. 概述 MM是皮肤肿瘤的一种,由位于表皮基底部的黑色素细胞恶变而成,多由痣或色素斑发展而来,一旦进入快速生长期,则预后差、死亡率高。90%的MM发生于皮肤,最常见于背部、胸腹部和腿部,可见于足底、指趾、甲下和头皮,少数发生于外阴、消化道和眼内。MM与鳞癌和基底细胞癌不同,后两种起源于表皮的角质细胞,预后较好。 早期MM经外科扩大切除后95%-100%可治愈。因此,早期发现与早期诊断非常重要。皮肤MM的早期临床表现为痣或色素斑迅速增大、隆起、破溃不愈、边缘不整或有切迹和锯齿、颜色改变、局部形成水疱、瘙痒、刺痛等。进而可出现卫星灶、局部淋巴结肿大、移行转移(经由淋巴管在原发病灶与区域引流淋巴结之间形成皮下结节)和远处转移。常见的远处转移部位包括远处皮肤、淋巴结、肺、脑、肝、骨等。 MM预后与患者性别、年龄、肿瘤部位、厚度、淋巴结转移个数及乳酸脱氢酶(LDH)等相关。通常,女性患者预后好于男性;发生于四肢的MM预后最好,躯干其次,头颈部最差;分期较早者预后较好;LDH较低者预后较好,LDH<0.8正常值者生存期较长;有1个淋巴结转移者5年生存率为75%,有3个转移者为15%;浸润深度<1 mm者10年生存率>90%,浸润深度>4.5 mm者10年生存率为30%。 2. 流行病学与病因学 MM是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤,年增长率约3%-5%。MM平均发病年龄为45岁,50岁以后发病率随年龄增长而升高。 白种人发病率高于其他肤色人种。英国近5年来MM男性发病率增加了28%,女性增加了12%。美国2007年估计MM新发病例59940人,死亡约8110人。澳大利亚昆士兰和美国的南亚利桑那州为MM高发地区,发病率分别为40例/10万和30例/10万。中国和日本等亚洲国家发病率较低,但增长迅猛。北京市八城区统计资料显示,2000年MM发病率为0.2例/10万,2004年已达1例/10万。 MM的病因学在白种人中研究较多,主要认为其与日照相关。日光中的紫外线灼伤皮肤诱导DNA突变。紫外线中的UV A和UVB均可诱导MM的发生,但UVB在破坏黑色素细胞的某种基因并诱导MM发病中起主要作用。研究已证实,位于9号染色体短臂的p16或CDKN2A的基因突变是造成黑色素瘤高遗传易感性的主要原因。 亚洲和非洲地区的MM患者原发病灶多位于足跟、手掌、指趾和甲下等接触紫外线极少的地方,其病因尚不明确。不恰当的处理有可能诱导黑色素瘤的迅速生长,如刀割、绳勒、盐腌、激光和冷冻等。内分泌、化学、物理因素对MM的发生是否有影响尚不清楚。 3. 病理类型 MM常见病理类型有浅表扩散型、结节型、恶性雀斑样和肢端雀斑样;少见类型有促纤
特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定
一、基本原理 本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL，然后再进行细胞毒试验。其原理为：外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他T细胞克隆则逐渐死亡；经3~4次刺激后，存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞，即抗原特异性CTL 。 二、试剂及材料 1. 丝裂霉素C（Sigma）：用培养液或PBS配制300μg/ml。 2. 含20%的新生牛血清的RPMI 1640 3. EB病毒转化的B淋巴母细胞株 三、操作方法 1. 特异性CTL的诱导和制备 ①取作者外周血分离PBMC，无血清1640洗两遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640调成1.5×106 /ml，置于24孔板中，于5% CO2 培养箱中4小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数； ②取EB病毒转化的B淋巴母细胞，加入丝裂霉素C，最终浓度为30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞用1640液洗涤3次并计数； ③取2×106 个PBL于24孔板中，加入5×104 （2.5%）个经丝裂霉素C处理（30mg/ml、30min）的自身、同种异体（其HLA-I类型别完全不同）的EBV-LCL细胞作为刺激细胞，混匀，用完全培养基（RPMI 1640）补总体积至2ml； ④静置于培养箱中；4d后半量换液，继续培养3d； ⑤离心收集细胞，取1×106 个反应细胞，加入2×105个（20%）的刺激细胞，第三天加入重组IL-2，使终浓度为30U/ml；每三天半量换液一次并维持相同IL-2浓度。 ⑥每周按相同程序刺激效应细胞一次，3~4次后，效应细胞即为特异性CTL，可用于杀伤实验。 2. 细胞毒试验 检测CTL细胞毒作用均可采用检测NK细胞杀伤活性的方法，仅效靶细胞比例不一样，现将LDH释放法简要叙述如下：
恶性黑素瘤——病理改变
【病理改变】恶性黑素瘤的典型病理特征是在真皮表皮交界处不不典型的黑素细胞增生，且瘤细胞侵犯表皮和真皮。瘤细胞呈双相分化，上皮细胞型与梭形细胞型。细胞核呈显著异形性，核形怪异。还可见单核、双核或多核，常见核分裂象。恶黑的组织病理形态因不同类型而不尽相同。 1.恶性雀斑样痣黑素瘤：表皮萎缩，基底层有较多不典型黑素细胞，并向下侵袭真皮，瘤细胞内或细胞间质中噬色素细胞含有相当多的黑素。 2.浅表扩散性黑素瘤：表皮突向下不规则增生，真皮表皮交界处和真皮内可见不典型的痣细胞巢，除上皮细胞型与梭形细胞型的黑素细胞外，有时表皮上部还可见少数paget样黑素细胞。真皮炎症细胞浸润明显。 3.结节性黑素瘤：不典型黑素细胞垂直向下增生侵入真皮，而不向表皮侵犯。上皮细胞型的黑色素细胞常排成腺泡状；梭形细胞型则类似成纤维细胞，有时作束状排列。 4.肢端雀斑样痣黑素瘤：表皮增厚，含大量色素的不典型黑素细胞巢位于表皮下部，常见梭形黑素细胞。表皮上部也可见paget样的黑素细胞，真皮乳头可见噬色素细胞。无黑素性恶性黑素瘤的细胞形态结构具备恶黑特点，HE染色中无明显黑素，用多巴（Dopa）试验可呈阳性反应，银染色可显示少量黑素。对恶黑的组织学诊断除了确诊、分型外，还应观察其侵袭程度，瘤细胞侵犯愈深则预后愈差。通常采用Clork深度和Breslow厚度两个主要参数来表示。（1）Clork分级：Ⅰ级：瘤细胞限于表皮内；Ⅱ级：侵入真皮乳头；Ⅲ级：充满真皮乳头；Ⅳ级：侵入真皮网状层；Ⅴ级：侵入皮下脂肪层。从Ⅰ级到Ⅴ级的5年存活率依次为99%，95%，90%，65%和25%。（2）Breslow测定法是用目镜测微器测量肿瘤厚度。肿瘤厚度与患者5年存活率的关系为：厚度小于0.85mm为98%；0.8～1.69mm为90%；1.7～3.59mm为70%；大于3.6mm为45%。
对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM
对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM 作者：田蓉，程绍辉，于继云，李巍，刘玉峰 【关键词】黑色素瘤 Inhibition of lung metastasis of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor in mice 【Abstract】AIM: To investigate the inhibition of lung metastasis of melanoma by a tumor vaccine of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor (mGMCSF). METHODS: The murine melanoma cell line B16 was transfected with the recombinant plasmid containing mGMCSF. A cell line stably expressing mGMCSF was obtained by G418 selection. The Balb/c mice were administered i.v. with B16 cells transfected with or without mGMCSF respectively and the lung metastasis was examined 2 weeks later. RESULTS: The recombinant cell line B16TR was established after mGMCSF tranfection and the expression of mGMCSF was confirmed by RTPCR. The number of lung metastatic lesions of mice treated
不同微环境下黑色素瘤细胞三维结构差异4.26
不同微环境下黑色素瘤细胞三维结构差异癌症是一种衰老的疾病。从临床来看，老年癌症患者的预后往往比年轻人差。这可能是由于细胞损伤累积、适应性免疫下降和慢性炎症。然而，老年微环境对肿瘤进展的影响在很大程度上尚未被探索。由于真皮成纤维细胞对黑色素瘤进展有深远的影响，研究了真皮成纤维细胞的年龄相关变化是否可以驱动黑色素瘤转移和靶向治疗的反应。 目前关于老化的微环境对黑色瘤的发展，其中是否对黑色素瘤的三维结构差异效果未知，因此我们设计此实验达到如下两个目的： （1）不同肿瘤微环境下对黑色瘤的三维结构变化产生的影响 （2）尝试寻找老化微环境下对黑色瘤的作用机制，通过哪条通路上关键基因进而调控一系列基因表达变化起保护作用。 Part I. 老化微环境黑色瘤细胞模型构建 利用2个黑色素瘤细胞系（WM35和WM793）、年轻（<35岁）或衰老（>55岁）的成纤维细胞系构建了器官型皮肤重建。 （1）WM35+年轻（<35岁）成纤维细胞系 （2）WM35+衰老（>55岁）成纤维细胞系 （3）WM793+年轻（<35岁）成纤维细胞系 （4）WM793+衰老（>55岁）成纤维细胞系 测定指标： a. CCK8 测增殖（不同组分） b. 检测MDA、SOD 及ROS 含量的变化 C. 黑色瘤细胞形态变化 Part II. 不同微环境下黑色瘤动物模型构建及三维结构变化 实验材料：实验室构建小鼠黑色瘤模型（依据“Dankort, D. et al. BrafV600E cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genet. 41, 544–552 (2009).”) 实验分组：每组尽量多做生物学重复，减少个体误差。 Yumm1.7细胞来自于Braf V600E /Cdkn2a - / - /Pten - / - 小鼠黑色素瘤模型 （1）8周龄小鼠（幼龄）（注射Yumm1.7）
中国黑色素瘤诊断治疗共识(2008年第一版)
中国黑色素瘤诊断治疗共识 （2008年第一版） 目录 一、概述 二、流行病学与病因学 三、病理 四、临床病理分期 五、治疗流程及原则 六、辅助治疗 七、手术治疗 八、放疗 九、全身治疗 十、随访 1
一、概述 恶性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是皮肤肿瘤的一种，与鳞癌和基底细胞癌不同。后两种起源于表皮的角质细胞，预后较好。皮肤恶性黑色素瘤是由位于表皮基底部的黑色素细胞恶变形成的，多由痣或色素斑发展而来，一旦进入快速生长期，则预后差、死亡率高。恶性黑色素瘤90%发生于皮肤，最常见于背部，胸腹部和腿部，足底、指趾、甲下、头皮等部位也不少见；少数发生于外阴、消化道和眼内。 早期恶性黑色素瘤经外科扩大切除术后95%-100%可治愈。因此早期发现与早期诊断非常重要。皮肤MM的早期临床表现为痣或色素斑迅速增大，隆起，破溃不愈，边缘不整或有切迹、锯齿，颜色改变、局部形成水泡、瘙痒、刺痛等。进而可出现卫星灶、局部淋巴结肿大，移行转移（原发病灶与区域引流淋巴结之间的皮下结节，通过淋巴管转移）和远处转移1。常见的远处转移部位包括远处皮肤淋巴结、肺、脑、肝、骨等部位，有文献报道仅发生肺转移的预后好于其它远处转移2。 恶性黑色素瘤的预后与性别、年龄、部位、肿瘤厚度、淋巴结转移个数及LDH等相关3。通常来说女性预后好于男性，四肢最好，躯干其次，头颈部预后最差；分期越早预后越好，LDH 越高预后越差。淋巴结有1个转移的5年生存率为75%，有3个转移的为15%；浸润深度<1mm的10年生存率>90%，浸润深度>4.5mm的10年生存率为30%；2008年ASCO会上报道LDH<0.8正常值的患者较LDH高的患者总生存明显延长4。 二、流行病学与病因学：恶性黑色素瘤是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤，年增长率约3-5%5。英国近5年来MM男性发病率增加了28%，女性增加了12%。据报道美国2007年估计MM 新发病例59940人，死亡约8110人。澳大利亚昆士兰和美国的南亚利桑那州为MM的高发地区，发病率分别为40/10万，30/10万6。白种人发病率高于其他肤色人种。中国和日本等亚洲国家发病率低，但是增长迅猛。北京市八城区统计资料显示2000年恶性黑色素瘤发病率为0.2/10万7，2004年其发病例率已达1/10万。MM平均发病年龄为45岁，50岁以后随年龄 2
细胞毒性T细胞作用的分子机制
第四章 细胞毒性T 细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性T 细胞（CTL ）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL 为主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL 对于被感染细胞的MHC I 类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。 第一节 CTL 作用概述 CTL 即杀伤性T 细胞，是一类具有CD8+表面标志、受MHC I 类分子限制性杀伤功能的T 细胞。CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受TCR 以及MHC I 类分子的严格限制。CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL 前体的体外培养和效应CTL 的分化诱导中也起着重要作用。 一、CTL 的主要生物学功能 CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL 在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞都表达I 类MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。 二、CTL 作用的MHC 限制性 CTL 的杀伤作用受MHC 严格限制。CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I 类分子相联系的特异性抗原多肽。 三、CTL 的组成 CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T 细胞群体。在组成上，它包括CD8+T 细胞和CD4+T 细胞。 1、CD8+ T 细胞 主要有αβTCR 型CD8+T 细胞和γδTCR 型CD8+T 细胞。前者以αβTCR 识别靶细胞表面上的MHC I 类分子-肽复合物（图4- ）；后者则以γδTCR 识别靶细胞表面的 HLA-I HLA-II 图4-1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物 αβ TCR αβ TCR
参一胶囊Rg3诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡
文章编号：１００７－４２８７（２０１０）０４－０５２６－０２ 参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠黑色素瘤细胞凋亡 孙宝胜１，张 矛２，刘林林２，孙 晶３，侯吉光４ （１．吉林省肿瘤医院放疗三科，吉林长春１３００２１；２．吉林大学第二医院肿瘤生物治疗科； ３．吉林大学第二医院药剂科；４畅吉林大学第二医院放疗科） 摘要：目的 探讨参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用。方法 ＭＴＴ法检测参一胶囊（Ｒｇ３）对黑色素瘤细胞生长的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 参一胶囊（Ｒｇ３）对小鼠黑色素瘤细胞生长有显著的抑制作用，并能显著诱导细胞发生凋亡，其作用呈明显的量效和时间依赖性关系。结论 参一胶囊（Ｒｇ３）诱导小鼠Ｂ１６－４Ａ５黑色素瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。 关键词：参一胶囊；黑色素瘤细胞；细胞凋亡 中图分类号：Ｒ９６５文献标识码：Ａ ＭｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＲｇ３ ＳＵＮＢａｏ－ｓｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＭａｏ２，ＬＩＵＬｉｎ－ｌｉｎ２，ｅｔａｌ．（１．ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＴｕｍｏｒＨｏｓ－ｐｉｔａｌ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００１２，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＲｇ３ｏｎｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｍｅｌａｎｏｍａＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｗｉｔｈＭＴＴｍｅｔｈｏｄａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｇ３ｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｉｔｈａｄｏｓｅ－ａｎｄｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｇ３ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＢ１６－４Ａ５ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｇ３；ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌ；ａｐｏｔｏｓｉｓ （ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，２０１０，１４：０５２６） 人参皂苷Ｒｇ３是从人参中提取的有效单体成分。研究证明，人参皂苷Ｒｇ３可通过抑制肿瘤血管形成，阻断肿瘤的浸润和转移［１，２］；提高肿瘤病人免疫力，抑制转移，并降低肿瘤病人放、化疗后毒副作用［３］。本文通过观察人参皂苷Ｒｇ３对黑色素瘤细胞的存活率及细胞凋亡的变化，为其临床应用提供重要的实验依据。 １ 材料与方法 １．１ 试剂 细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰酶和磷酸盐缓冲液均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）。Ｔａｕｒｏｌｉｄｉｎｅ（Ｔａｕｒｏｌｉｎ）溶剂由ＧｅｉｓｔｌｉｃｈＰｈａｒｍＡＧ（Ｗｏｌｈｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）赠送。其他的化学试剂均购于ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。 １．２ 细胞及培养 小鼠黑色瘤细胞（Ｂ１６－４Ａ５）购于美国细胞库（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。Ｂ１６－４Ａ细胞均在含有１０％小牛血清、青霉素（１００Ｕ?ｍｌ－１）和谷氨酰胺（２ｍｍｏｌ?Ｌ－１）的ＤＭＥＭ培养液培养，并在３７℃、５％ＣＯ２孵箱中贴壁生长。１×１０５?ｍｌ－１。将Ｂ１６－４Ａ５细胞种植在９６孔培养板（１００μｌ?ｗｅｌｌ－１）２４ｈ后，分别给予不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－ ｄｉｎｅ，并确定最终浓度分别为０、１０、２５、５０、１００和２００μｍｏｌ?Ｌ－１。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃、ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，给予１００μｌＭＴＴ（５．０ｇ?Ｌ－１），３７℃继续培养３ｈ，终止培养，吸去上清，每孔加入１５０μＬ二甲基亚砜，振荡１０ｍｉｎ在酶联免疫吸附仪上测量各孔光吸收值（ＣＰＭ）。细胞生长抑制率（％）＝（１－实验组ＣＰＭ值／对照组ＣＰＭ值）×１００％。 １．４ 流式细胞术检测细胞凋亡 待Ｂ１６－４Ａ５细胞接近对数生长期，常规消化细胞，制成２．５×１０５?ｍＬ－１细胞悬液，接种于６孔培养板中。２４ｈ后，实验组给予上述不同浓度的ｔａｕｒｏｌｉ－ｄｉｎｅ。５％的ＰＶＰ作为空白对照组。Ｂ１６－４Ａ５细胞在３７℃，ＣＯ２孵箱中培养２４和４８ｈ后，将贴壁及悬浮的细胞离心，收集后震荡、混匀，在碘化丙啶（ＰＩ）混合溶液中（５０ｍｇ?Ｌ－１ＰＩ，３．４ｍｍｏｌ?Ｌ－１ｓｏｄｉｕｍｃｉｔ－ｒａｔｅ，１．０ｍｍｏｌ?Ｌ－１Ｔｒｉｓ，０．１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００），并在４℃环境中避光培养４－６ｈ。流式细胞仪（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）进行 — ６２５ —ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ａｐｒｉｌ，２０１０，Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．４
细胞毒性T细胞作用的分子机制
第四章细胞毒性T细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性T细胞（CTL）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括NK细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL为主、Th细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL对于被感染细胞的MHC I类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。 第一节CTL作用概述 CTL即杀伤性T细胞，是一类具有CD8+表面标志、受MHC I类分子限制性杀伤功能的T细胞。CTL的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受TCR以及MHC I类分子的严格限制。CTL对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL前体的体外培养和效应CTL的分化诱导中也起着重要作用。 一、CTL的主要生物学功能 CTL对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞都表达I类MHC分子，因此，CTL原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。 二、CTL作用的MHC限制性 CTL的杀伤作用受MHC严格限制。CTL在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身MHC I类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I类分子相联系的特异性抗原多肽。 三、CTL的组成 CTL的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。因此，CTL不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T细胞群体。在组成上，它包括CD8+T细胞和CD4+T细胞。 1、CD8+ T细胞主要有TCR型CD8+T 细胞和TCR型CD8+T细胞。前者以TCR识别靶细胞表面上的MHC I类分子-肽复合物（图1 ）；后者则以TCR 识别靶细胞表面的 HLA-I HLA-II 抗原肽 抗原肽CD4+ αβ TCR CD8+
一个七十多岁黑色素瘤病人的真实经历
一个七十多岁黑色素瘤病人的真实经历 黑色素瘤是一种恶性程度相当高的恶性肿瘤，又称恶性黑瘤，大多原发于皮肤，也可起源于眼、鼻腔等处，早期可发生转移，转移部位多见肺、脑。那么得了黑色素瘤怎么办呢？手术后应该如何预防复发呢？我们来看下一个七十多岁黑色素瘤病人的真实经历：今年七十多岁的刘老爷子，在2010年年末检查出腿上、腹股沟上有黑色素瘤，术后疼痛，服用过各种药物，均没有很好的效果。2011年3月份查出有淋巴转移，老爷子在四月初再次动了黑色素瘤手术，切除了周围淋巴。 因为当时老爷子刚拆完线，怕还有淋巴转移，人参皂苷Rh2有抗转移功效，所以建议加量服用。一个月以后，淋巴上原来的三个点都已经不见了。得了黑色素瘤后，老爷子除了服用人参皂苷Rh2外，还在吃虫草和注射胸腺肽。自己感觉一天比一天好。 本来腿上和胳膊上有几个小包，腿上那个还挺大，有疼痛感，现在已经消失了，小一点那个会活动，不痛。胳膊上有三个，本来有疼痛感，现在也不是很痛了，也会活动了七月份的时候专家会诊，肺部和淋巴的瘤子都基本控制住了。肺部原来有几个瘤子，现在只剩三个了。现在精神、食欲、睡眠都很好。现在老爷子又开始在外面奔波了，自我感觉情况很稳定。本来是腹股沟、肺上、淋巴上都有转移，现在不仅没有增大，数量上也已经减少。 和老爷子通电话，他说前几天沈阳电视台来了一个专家，说人参不能抗癌，但是人参皂苷Rh2可以抗抗癌，而且剂量和疗效成正比。老爷子现在还到处跑，去北京做工作，忙忙碌碌的感觉让他感觉很充实！ 恶性肿瘤的侵袭和转移特性是最终导致患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个复杂的过程,而肿瘤细胞侵袭基底膜是其中的一个重要的环节。在体外重组基底膜的实验中观察到20(R)-人参皂苷Rh2可显著降低B16黑色素瘤细胞的侵袭能力，20(R)-人参皂苷Rh2的研究与开发为人类抗击癌症开辟一条新途径。
细胞毒药物使用的指南
细胞毒性药物指在生物学方面具有危害性影响的药品，可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖系统、泌尿、肝肾系统的毒害，还有致畸或损害生育功能。由于其在人体作用强度大，刺激性强，在发挥治疗作用的同时，也同时影响了正常细胞的生长繁殖。 肿瘤化疗药物几乎都是细胞毒性药物，在杀死肿瘤细胞的同时，对人体的正常细胞有一定的毒副作用，尤其是对分裂、增殖、比较快的细胞如骨髓造血细胞、胃肠道粘膜上皮细胞等。因此在有效的肿瘤化疗中，毒副作用几乎是不可避免的。另外还有一些如耳毒性抗菌素生素等，都具有细胞毒性作用。 1. 抗肿瘤药的合理应用 (1)临床医师必须熟知抗肿瘤药的抗瘤谱、药动学、不良反应、药物相互作用，使用规，合理地应用抗肿瘤药。 (2)周期非特异性药物对癌细胞的作用较强而快，高浓度下能迅速杀灭癌细胞；周期特异性药物的作用需要一定时间才能发挥其杀伤作用。周期非特异性药物的剂量反应曲线接近直线，在机体能耐受的毒性限度，其杀伤能力随剂量的增加而增加。在浓度和时限的关系中，浓度是主要因素。周期特异性药物则不然，其剂量反应曲线是一条渐近线，即在小剂量时类似于直线，达到一定剂量后不再上升，出现平台。相对来说，在影响疗效的浓度与时间的关系中，时间是主要的因素。因此，为使化疗药物能发挥最大的作用，非特异性药物宜静脉一次推注，而特异性药物则以缓慢滴注、肌注射或口服为宜。 (3)联合化疗方案中一般应包括两类以上药理作用机制不同的药物，且常用周期特异性药物与作用于不同时相的周期特异性药物配合。选药时也要尽可能使各药的毒性不相重复，以提高正常细胞的耐受性。 (4)经典的肿瘤治疗追求扩大根治的手术、强化或冲击化疗、根治性放疗等，然而往往事与愿违。迄今为止，上述治疗所能达到的最高疗效仅仅是临床治愈，肿瘤的复发和转移仍是一个难以解决的问题，且患者治疗后普遍出现生存质量下降，甚至因不能耐受继续治疗而死亡。随着治疗中的手段的进步，使癌症治疗出现了质的飞跃，已经有可能将肿瘤当成慢性病对待，就像糖尿病、高血压等慢性病那样，肿瘤患者也可带瘤长期生存。对中晚期肿瘤患者应以“提高患者生活质量，延长生命时间”为目标进行综合治疗。 2.抗肿瘤药的主要不良反应与防治原则 抗肿瘤药的不良反应涉及以下几方面： (1)骨髓抑制：表现在白细胞、血小板、红细胞和血红蛋白下降。除新碱和博来霉素外几乎所有的细胞毒药，均会导致骨髓抑制。骨髓抑制常常出现在给药后的7～10天，但是某些药物可出现得更晚，如卡莫司汀、洛莫司汀和美法仑。在一次治疗前必须检查外周末梢血象。如骨髓功能尚未恢复，应酌情减少用药剂量或推迟治疗。 对中性白细胞减少，或由此带来的发热患者，应当应用重组粒细胞集落刺激因子（G-CSF），必要时考虑给予抗菌药物治疗。 (2)消化道反应：包括食欲减退、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、腹胀、肝脏毒性等。对轻度消化道反应可口服多立酮、甲氧氯普胺进行处理，如效果不佳，可合并应用地塞米松或劳拉西泮作为补充。对严重呕吐或处理效果不佳者，可给予5-羟色胺3(5HT3)受体拮抗剂，包括昂丹司琼、格拉司琼、雷莫司琼、托烷司琼和帕洛诺司琼。为预防迟发症状，可口服地塞米松，可以单独使用，或与甲氧氯普胺、苯海拉明联合应用。 (3)口腔黏膜反应：如咽炎、口腔溃疡、口腔黏膜炎，黏膜反应是肿瘤化疗中常见的一种并发症，多数情况都与氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和蒽环类抗生素有关。防止和处理这些并发症，应进行有效的口腔护理(经常洗漱口腔)。 (4)脱发：抗肿瘤药引起的脱发几乎在1或2周后产生。对于脱发，迄今尚无药理学上的防治方法，国外曾探索使用冰帽等措施。
细胞毒药物使用指南
细胞毒性药物指在生物学方面具有危害性影响的药品,可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖系统、泌尿、肝肾系统的毒害,还有致畸或损害生育功能。由于其在人体内作用强度大,刺激性强,在发挥治疗作用的同时,也同时影响了正常细胞的生长繁殖。 肿瘤化疗药物几乎都就是细胞毒性药物,在杀死肿瘤细胞的同时,对人体的正常细胞有一定的毒副作用,尤其就是对分裂、增殖、比较快的细胞如骨髓造血细胞、胃肠道粘膜上皮细胞等。因此在有效的肿瘤化疗中,毒副作用几乎就是不可避免的。另外还有一些如耳毒性抗菌素生素等,都具有细胞毒性作用。 1、抗肿瘤药的合理应用 (1)临床医师必须熟知抗肿瘤药的抗瘤谱、药动学、不良反应、药物相互作用,使用规范,合理地应用抗肿瘤药。 (2)周期非特异性药物对癌细胞的作用较强而快,高浓度下能迅速杀灭癌细胞; 周期特异性药物的作用需要一定时间才能发挥其杀伤作用。周期非特异性药物的剂量反应曲线接近直线,在机体能耐受的毒性限度内,其杀伤能力随剂量的增加而增加。在浓度与时限的关系中,浓度就是主要因素。周期特异性药物则不然,其剂量反应曲线就是一条渐近线,即在小剂量时类似于直线,达到一定剂量后不再上升,出现平台。相对来说,在影响疗效的浓度与时间的关系中,时间就是主要的因素。因此,为使化疗药物能发挥最大的作用,非特异性药物宜静脉一次推注,而特异性药物则以缓慢滴注、肌内注射或口服为宜。 (3)联合化疗方案中一般应包括两类以上药理作用机制不同的药物,且常用周期特异性药物与作用于不同时相的周期特异性药物配合。选药时也要尽可能使各药的毒性不相重复,以提高正常细胞的耐受性。 (4)经典的肿瘤治疗追求扩大根治的手术、强化或冲击化疗、根治性放疗等,然而往往事与愿违。迄今为止,上述治疗所能达到的最高疗效仅仅就是临床治愈,肿瘤的复发与转移仍就是一个难以解决的问题,且患者治疗后普遍出现生存质量下降,甚至因不能耐受继续治疗而死亡。随着治疗中的手段的进步,使癌症治疗出现了质的飞跃,已经有可能将肿瘤当成慢性病对待,就像糖尿病、高血压等慢性病那样,肿瘤患者也可带瘤长期生存。对中晚期肿瘤患者应以“提高患者生活质量,延长生命时间”为目标进行综合治疗。 2、抗肿瘤药的主要不良反应与防治原则 抗肿瘤药的不良反应涉及以下几方面: (1)骨髓抑制:表现在白细胞、血小板、红细胞与血红蛋白下降。除长春新碱与博来霉素外几乎所有的细胞毒药,均会导致骨髓抑制。骨髓抑制常常出现在给药后的7～10天,但就是某些药物可出现得更晚,如卡莫司汀、洛莫司汀与美法仑。在一次治疗前必须检查外周末梢血象。如骨髓功能尚未恢复,应酌情减少用药剂量或推迟治疗。 对中性白细胞减少,或由此带来的发热患者,应当应用重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF),必要时考虑给予抗菌药物治疗。 (2)消化道反应:包括食欲减退、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、腹胀、肝脏毒性等。对轻度消化道反应可口服多潘立酮、甲氧氯普胺进行处理,如效果不佳,可合并应用地塞米松或劳拉西泮作为补充。对严重呕吐或处理效果不佳者,可给予5-羟色胺3(5HT3)受体拮抗剂,包括昂丹司琼、格拉司琼、雷莫司琼、托烷司琼与帕洛诺司琼。为预防迟发症状,可口服地塞米松,可以单独使用,或与甲氧氯普胺、苯海拉明联合应用。 (3)口腔黏膜反应:如咽炎、口腔溃疡、口腔黏膜炎,黏膜反应就是肿瘤化疗中常见的一种并发症,多数情况都与氟尿嘧啶、甲氨蝶呤与蒽环类抗生素有关。防止与处理这些并发症,应进行有效的口腔护理(经常洗漱口腔)。 (4)脱发:抗肿瘤药引起的脱发几乎在1或2周后产生。对于脱发,迄今尚无药理学上的防治方法,国外曾探索使用冰帽等措施。