蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

引言

蛋白FITC标记以及葡聚糖凝胶柱是生物科学研究中常用的实验技术。蛋白FITC标记可以通过将荧光染料FITC（荧光同种异构体）与蛋白质结合，实现对蛋白质的追踪、定位以及分析等应用，并广泛应用于分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域。葡聚糖凝胶柱则是一种常见的柱层析技术，可用于分离和纯化蛋白质、核酸以及其他生物大分子。下面将详细介

绍蛋白FITC标记的步骤以及葡聚糖凝胶柱的使用。

一、蛋白FITC标记步骤

1.准备荧光染料FITC溶液：称取一定量的FITC粉末，加入适量的溶

剂（如溶于碳酸氢钠缓冲液），使其溶解成一定浓度的FITC溶液。

2.准备蛋白质样品：选取需要标记的蛋白质样品，可以是纯化的蛋白

质或者生物标志物。

3.标记蛋白质和FITC：将一定比例的FITC溶液与蛋白质样品混合，

通常在暗处、低温水浴条件下反应一定时间（如1-2小时）。注意控制反

应温度和时间，不同的蛋白质可能需要不同的条件。

4.清除未反应的FITC：使用一种合适的方法（如柱层析、超滤等）

将未反应的FITC分离出来。

5.测定标记效率：通过分光光度法测定FITC标记蛋白质的浓度和

FITC的浓度，计算标记效率。

1.制备葡聚糖凝胶柱：按照柱层析的要求，准备合适大小的玻璃柱子，并将葡聚糖填充于柱子内。葡聚糖填充量可根据样品的分离要求进行调整，通常在0.5-1.5倍柱子体积的范围内。

2.提前平衡柱子：将平衡缓冲液（可根据实验需求选择）加入柱子中，持续流通一定时间，达到柱子内外平衡。

3.样品加载：将待分离的样品溶液均匀地加入柱子上部，并加入一定

量的平衡缓冲液，形成样品层。

4.柱洗脱：将平衡缓冲液加入柱子顶部，形成洗脱缓冲液流动，逐步

冲洗样品。

5.收集分离后的样品：分离后的目标物质将会以不同时间点流出柱子，可以根据需要采集不同时间段的洗脱液。

6.分析和应用：通过分析采集的洗脱液，可以进一步对目标物质进行

定性和定量的分析。

结论

蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是一些常见的生物分子实验技术。蛋白FITC标记可以实现对蛋白质的定位、追踪和分析，而葡聚糖凝胶柱

则可以用于分离和纯化生物大分子。这两种方法在生命科学研究中具有广

泛的应用价值。通过掌握和运用这些技术，可以为生物科学研究提供强大

的支持和帮助。

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用 引言 蛋白FITC标记以及葡聚糖凝胶柱是生物科学研究中常用的实验技术。蛋白FITC标记可以通过将荧光染料FITC（荧光同种异构体）与蛋白质结合，实现对蛋白质的追踪、定位以及分析等应用，并广泛应用于分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域。葡聚糖凝胶柱则是一种常见的柱层析技术，可用于分离和纯化蛋白质、核酸以及其他生物大分子。下面将详细介 绍蛋白FITC标记的步骤以及葡聚糖凝胶柱的使用。 一、蛋白FITC标记步骤 1.准备荧光染料FITC溶液：称取一定量的FITC粉末，加入适量的溶 剂（如溶于碳酸氢钠缓冲液），使其溶解成一定浓度的FITC溶液。 2.准备蛋白质样品：选取需要标记的蛋白质样品，可以是纯化的蛋白 质或者生物标志物。 3.标记蛋白质和FITC：将一定比例的FITC溶液与蛋白质样品混合， 通常在暗处、低温水浴条件下反应一定时间（如1-2小时）。注意控制反 应温度和时间，不同的蛋白质可能需要不同的条件。 4.清除未反应的FITC：使用一种合适的方法（如柱层析、超滤等） 将未反应的FITC分离出来。 5.测定标记效率：通过分光光度法测定FITC标记蛋白质的浓度和 FITC的浓度，计算标记效率。

1.制备葡聚糖凝胶柱：按照柱层析的要求，准备合适大小的玻璃柱子，并将葡聚糖填充于柱子内。葡聚糖填充量可根据样品的分离要求进行调整，通常在0.5-1.5倍柱子体积的范围内。 2.提前平衡柱子：将平衡缓冲液（可根据实验需求选择）加入柱子中，持续流通一定时间，达到柱子内外平衡。 3.样品加载：将待分离的样品溶液均匀地加入柱子上部，并加入一定 量的平衡缓冲液，形成样品层。 4.柱洗脱：将平衡缓冲液加入柱子顶部，形成洗脱缓冲液流动，逐步 冲洗样品。 5.收集分离后的样品：分离后的目标物质将会以不同时间点流出柱子，可以根据需要采集不同时间段的洗脱液。 6.分析和应用：通过分析采集的洗脱液，可以进一步对目标物质进行 定性和定量的分析。 结论 蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是一些常见的生物分子实验技术。蛋白FITC标记可以实现对蛋白质的定位、追踪和分析，而葡聚糖凝胶柱 则可以用于分离和纯化生物大分子。这两种方法在生命科学研究中具有广 泛的应用价值。通过掌握和运用这些技术，可以为生物科学研究提供强大 的支持和帮助。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项(包含各种溶剂的溶胀系数)

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性及非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。 (5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。

葡聚糖凝胶使用说明书

葡聚糖凝胶使用说明书 一、产品名称 产品名称：葡聚糖凝胶 型号：Gel-300 二、适用范围 葡聚糖凝胶适用于生物实验室、化学实验室、制药厂等场所，用于分离、纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子。 三、使用方法 1. 准备葡聚糖凝胶和缓冲液。根据所需的分离纯化效果，选择合适的缓冲液类型和浓度。 2. 将缓冲液加入玻璃柱或层析柱中，直至填满整个柱子。 3. 加入适量的葡聚糖凝胶，使其均匀分布在柱子的底部。 4. 将样品溶液缓慢地加入柱子中，注意不要过快，以免影响分离效果。 5. 收集洗脱液，并进行分析。根据分离纯化的目的，可以采用不同的收集方法，如分步收集或集中收集。 6. 在每次使用后，及时清洗和保存凝胶柱，以延长其使用寿命。 四、注意事项 1. 在使用葡聚糖凝胶前，应仔细阅读本说明书并遵守操作规程。 2. 避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。 3. 使用过程中要避免剧烈震动或晃动，以免影响分离效果。 4. 在使用前应确认所需缓冲液的种类和浓度是否合适，避免浪

费和影响分离效果。 5. 不要使用已经过期或变质的凝胶和缓冲液。 6. 在储存和使用过程中要保持环境干燥，避免潮湿和高温。 7. 使用后要及时清洗和保存凝胶柱，以免被污染和变质。 五、常见问题及解决方案 1. 分离效果不佳：可能是由于凝胶或缓冲液质量问题、操作不当等原因引起的。解决方法是检查凝胶和缓冲液的质量和浓度是否合适，确认操作规程是否正确。若问题仍未解决，建议更换新的凝胶柱。 2. 柱子压力过高：可能是由于样品溶液中存在杂质或凝胶柱堵塞等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。同时检查凝胶柱是否堵塞，若堵塞则进行清洗或更换新的凝胶柱。 3. 柱子漏液：可能是由于接头松动或密封圈损坏等原因引起的。解决方法是重新拧紧接头或更换新的密封圈。若问题仍未解决，建议联系售后服务与支持部门寻求帮助。 4. 洗脱液中含有杂质：可能是由于样品溶液中存在杂质或缓冲液不纯等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。同时检查缓冲液的纯度是否符合要求，若不符合则更换新的缓冲液。 5. 洗脱液颜色异常：可能是由于样品溶液中含有色素或某些物质与缓冲液发生反应等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有色素或其他杂质，或者更换新的缓冲液以避免发生反应。若问题仍

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用 一、蛋白FITC标记 1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中（如PBS缓冲液），使其浓度为1 mg/ml。 2. 准备蛋白溶液：将待标记的蛋白溶解在PBS缓冲液中，使其浓度 为1 mg/ml。 3. 将FITC溶液加入蛋白溶液中：将适量的FITC溶液加入蛋白溶液中，使其FITC蛋白的浓度为10 μg/ml。溶液要充分混合，可以轻轻摇 晃或使用旋转器。 4.反应：将反应溶液在室温下孵育30分钟至1小时。反应时间可以 根据实验需要进行调整。 5.停止反应：将反应溶液加入适量的停止溶液中，如甘氨酸溶液。停 止溶液可以中和未反应的FITC，并保护标记的蛋白不被降解。 6.蛋白FITC标记的纯化：可以通过蛋白层析或其他纯化方法将蛋白FITC标记纯化。 葡聚糖凝胶柱是一种常用的蛋白层析方法，用于分离和纯化蛋白。 1.准备葡聚糖凝胶柱：将葡聚糖凝胶柱放入层析柱中，并用适量的缓 冲液（如PBS）均匀填充柱内。 2.样品加载：将待分离的蛋白样品加入层析柱中，样品可以预先进行 适当的处理，如去除杂质、调整pH值等。

3.缓冲液洗脱：通过加入适量的缓冲液（如PBS），将未结合的蛋白 从凝胶柱中洗脱。可以通过监测洗脱液的吸光度或测定蛋白浓度来确定洗 脱的程度。 4.目标蛋白洗脱：通过加入适量的洗脱缓冲液（如含有高浓度盐的缓 冲液），将目标蛋白从凝胶柱中洗脱。可以根据实验需要选择不同的洗脱 条件，如改变盐浓度、改变pH值等。 5.纯化目标蛋白：通过收集洗脱的蛋白样品，可以进行进一步的纯化 步骤，如使用其他层析方法、电泳等。 葡聚糖凝胶柱的使用可以根据实验需要进行调整，如选择不同的凝胶 柱大小、调整缓冲液成分和流速等。通过葡聚糖凝胶柱的分离和纯化，可 以获得纯度较高的蛋白样品，用于后续的实验分析。 总结： 蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是常见的蛋白实验技术。蛋白 FITC标记可以用于检测蛋白的位置和定量，通过将FITC与蛋白共价结合。葡聚糖凝胶柱可以用于蛋白的分离和纯化，通过选择适当的柱和缓冲液， 可以得到纯度较高的蛋白样品。这两种技术在蛋白研究中具有重要的应用 价值，对于深入了解蛋白的结构和功能具有重要意义。

FITC蛋白标记方法

FITC蛋白标记方法 FITC（fluorescein isothiocyanate）是一种常用的荧光染料，可用 于蛋白标记。蛋白标记是指将特定的蛋白质与荧光染料结合，使其能够在 荧光显微镜下被观察到。以下是一种常用的FITC蛋白标记方法： 1.准备工作： -FITC染料：FITC染料可从商业供应商购买，也可以通过化学合成得到。 -蛋白质：选择需要标记的蛋白质。常用的蛋白质包括抗体、酶、载 体蛋白等。 -缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）。 -处理液：选择适当的处理液，如甲醛或乙醛。 2.染色： -将蛋白质溶解在适当的缓冲液中，使其浓度达到所需浓度。 -将FITC染料溶解在适当的溶剂中，制备一定浓度的染料溶液。 -将蛋白质溶液与染料溶液按照一定比例混合，使其充分混合。 -在室温下孵育反应混合物，通常需要30分钟至1小时。 3.停止反应： -在反应结束后，加入一定浓度的停止剂，如甲醛或乙醛，停止反应。 -孵育反应混合物一段时间，通常需要10分钟至30分钟。 4.分离和清洗：

-使用适当的方法，如离心或柱层析，将标记的蛋白质从混合物中分 离出来。 -使用适当的缓冲液进行多次洗涤，以去除未结合的染料和其他杂质。 5.储存： -将标记的蛋白质溶解在适当的缓冲液中，制备一定浓度的溶液。 -将溶液储存在低温和避光的条件下，以延长其保存时间。 需要注意的是，FITC蛋白标记方法可以根据具体实验的需要进行调 整和优化。例如，可以根据蛋白质的性质和目标细胞的特点，选择适当的 缓冲液、处理液和停止剂。此外，在染色和清洗的过程中，需要注意避免 蛋白质的降解和损失。 FITC蛋白标记方法广泛应用于生物学研究中，例如细胞标记、分子 定位、蛋白质相互作用的研究等。通过将FITC染料与蛋白质结合，可以 实现对特定蛋白质在细胞或组织中的可视化观察，从而揭示其在细胞生物 学和生物化学过程中的功能和调控机制。

FITC蛋白标记方法

FITC蛋白标记方法 蛋白质标记是生物学研究中常见的实验手段，用于研究蛋白质的功能、定位、相互作用等。FITC（fluorescein isothiocyanate）是一种常用的 蛋白质标记剂，具有较强的荧光信号和化学稳定性，可广泛应用于免疫染色、流式细胞术、免疫组化和蛋白质定位等实验中。本文将介绍FITC蛋 白质标记方法及其应用。 一、FITC蛋白质标记方法 1.FITC与蛋白质直接偶联法： 此方法将FITC直接与蛋白质反应，形成共价键连接。一般会选择天 然氨基酸残基（如赖氨酸和组氨酸）中的氨基或脯氨酸中的酚羟基进行反应。实验步骤如下： a. 蛋白质溶液与FITC按照一定比例混合，通常蛋白质的浓度为1-5 mg/mL，FITC的浓度为1-10 mg/mL。 b.在室温下轻轻摇动反应管，使FITC与蛋白质充分混合，保持一定 的反应时间，一般不超过2小时。 c.反应结束后，通过凝胶过滤、柱层析等方法去除未反应的FITC。 d.反应产物即为FITC标记的蛋白质。 2.亲和层析法： 此方法利用具有亲合配体（如抗体、亲和素等）的亲和树脂与要标记 的蛋白质结合，然后再将FITC与亲和树脂上的蛋白质结合。实验步骤如下：

a. 将亲和树脂与要标记的蛋白质混合，使其结合。反应系统中的蛋白质的浓度通常为1-5 mg/mL。 b.通过洗涤的方式去除未结合的蛋白质以及其他杂质。 c.加入FITC溶液，与亲和树脂上的蛋白质反应。反应温度和时间根据蛋白质和FITC的特性进行调整。 d.反应结束后，通过洗涤的方式去除未结合的FITC。 e.用适当的缓冲液将FITC标记的蛋白质洗脱出来。 3.生化交联法： 此方法将生化交联剂与蛋白质反应，在反应完成后再将FITC与交联后的蛋白质结合。实验步骤如下： a. 将生化交联剂与蛋白质反应，形成交联的复合物。反应系统中的蛋白质的浓度通常为1-5 mg/mL。 b.通过洗涤的方式去除未交联的蛋白质以及其他杂质。 c.加入FITC溶液，与交联后的蛋白质反应。反应温度和时间根据蛋白质和FITC的特性进行调整。 d.反应结束后，通过洗涤的方式去除未结合的FITC。 e.用适当的缓冲液将FITC标记的蛋白质洗脱出来。 二、FITC标记蛋白质的应用 1.免疫染色：

凝胶色谱柱操作

凝胶色谱柱操作 1、溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um 的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2 小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。 2、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4 的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的 上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀

葡聚糖凝胶色谱柱

葡聚糖凝胶色谱柱 概述 葡聚糖凝胶色谱柱（dextran gel filtration column）是一种分离生物大分子的常见方法之一。它是利用生物大分子在不同孔径的凝胶中的分布系数不同，实现分离的原理。具体来说，大分子无法进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留更长时间，而小分子能够进入凝胶孔隙，因此在表面上滞留时间更短，从而实现分离。 实验过程 使用葡聚糖凝胶色谱柱进行分离实验的步骤如下： 1. 制备样品：将所需的大分子混合液或生物组织样品制备好。 2. 将样品滴到色谱柱顶部，并保持柱顶刚好覆 盖样品。 3. 添加移液管中的洗脱液，并在细流下加缓冲液。 4. 在必要的时候，可 以连续添加洗脱液、缓冲液和样品，直到滤出大分子为止。 5. 收集样品，并进行 下一步实验。 应用领域 葡聚糖凝胶色谱柱广泛应用于生物化学和分子生物学领域。常见的应用包括：1. 分离蛋白质：通过分离分子量不同的蛋白质来研究其结构和功能。2. 分离核酸：通过分离不同长度的DNA片段和转录产物来研究基因的组成和调控机制。 3. 分离 糖类：例如分离化合物，如淀粉和糖原，以研究其结构和功能。 4. 生物大分子纯化：通过纯化生物大分子（如酶和抗体）来研究其特性和应用。 常见问题解答 葡聚糖凝胶色谱柱可以重复使用吗？ 可以。只要正确使用和保持清洁，色谱柱可以反复使用多次，提供不断稳定的 分离能力。 色谱柱如何保养？ 在每次使用后，应使用清洁试剂对色谱柱进行冲洗，以防止残留的生物大分子 或洗脱液。还应防止色谱柱干燥，避免损坏凝胶。 如何选择正确的分离柱？ 对于不同种类的分析样品，应选择不同孔径的凝胶柱。一般来说，较小的分子 要使用较小的孔径凝胶柱，而较大的分子要使用较大的孔径凝胶柱。此外，应选择适当的缓冲液，以保证生物大分子的稳定性和稳定性。

FITC标记蛋白质的方法

FITC标记蛋白质的方法 FITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用于标记蛋白质的荧光染料。FITC 标记蛋白质的方法主要包括化学共价结合和生物亲和结合两种。 化学共价结合是FITC标记蛋白质最常用的方法之一、该方法利用FITC分子中的异硫氰基与蛋白质中的氨基酸侧链上的羟基、胺基、硫醇基等反应，形成稳定的共价键。常用的化学共价结合方法有直接标记和间接标记两种。 直接标记方法是将FITC直接与蛋白质反应制备成FITC-蛋白质共价偶联物。该方法简单快速，但容易引起蛋白质的损伤和聚集，从而影响蛋白质的功能和结构。 间接标记方法则采用二步法，在第一步中，将FITC标记到与蛋白质特异结合的二抗上，形成FITC-二抗共价偶联物；在第二步中，该FITC-二抗与蛋白质发生特异性的抗原-抗体反应，从而实现FITC标记蛋白质的目的。该方法操作简单，不容易损伤蛋白质的结构和功能，因此在很多领域中被广泛应用。 除了化学共价结合，生物亲和结合也常用于FITC标记蛋白质。生物亲和结合方法利用具有亲和性的结合分子在非共价方式下结合FITC和蛋白质，形成等效标记。常用的生物亲和结合方法有亲和标记系统、酶标记系统和金标记系统。 亲和标记系统是一种利用富含半化合金属离子的亲合树脂，在存在FITC和蛋白质的条件下实现FITC标记的方法。该方法在选择亲合树脂时需要考虑其对蛋白质的亲和性、将FITC与蛋白质结合后的稳定性以及标记后的蛋白质能否保持其结构和功能。

酶标记系统是一种利用酶标记物将FITC标记到蛋白质上的方法。常 用的酶标记物有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和逆转录酶等。该方法对于 需要进一步进行酶活性检测或者需要与其他酶标记物共同使用的试验有很 大的应用价值。 金标记系统是一种利用金纳米颗粒将FITC标记到蛋白质上的方法。 金纳米颗粒具有很高的表面增强拉曼散射（SERS）信号，可以增加FITC 标记物的检测灵敏度。该方法可以应用于免疫组化检测、免疫荧光显微镜 等领域。 总结起来，FITC标记蛋白质主要有化学共价结合和生物亲和结合两 种方法。化学共价结合方法包括直接标记和间接标记，生物亲和结合方法 包括亲和标记系统、酶标记系统和金标记系统。研究者们可以根据样本特性、实验目的和设备条件等选择适合的标记方法，以实现对蛋白质的定量、定位、追踪等研究。

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为

20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，

fitc标记蛋白质方法

fitc标记蛋白质方法 FITC（Fluorescein Isothiocyanate）是一种常用的荧光染料，常用于标记蛋白质。下面将详细介绍FITC标记蛋白质的方法。 FITC标记蛋白质的方法主要分为两个步骤：1）蛋白质的准备，2）FITC的标记。 1）蛋白质的准备： a.选择目标蛋白质：根据实验需求选择要标记的蛋白质，可以是纯化的蛋白质或者从细胞提取的蛋白质。 b. 确定蛋白质浓度：使用BCA或者Bradford等方法确定蛋白质的浓度，以便后续计算FITC的用量。 2）FITC的标记： a.准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中，常用的溶剂包括二甲基亚砜（DMSO）或者甲醇。根据蛋白质的浓度和需要的标记比例确定FITC的用量。 b.混合FITC和蛋白质：将FITC溶液与蛋白质混合，通常以FITC：蛋白质的比例为1:10-1:50。 c.反应条件：将FITC和蛋白质在适当的反应条件下混合，反应时间通常为1-2小时，反应温度为室温或者4°C。 d.反应停止：添加一定浓度的胺类化合物（如甘氨酸、赖氨酸等）停止反应，以保证FITC只与蛋白质中的氨基反应。

e.去除未反应的FITC：使用柱层析、胶体电泳或者超滤等方法去除 未反应的FITC，以得到纯化的FITC标记蛋白质。 在FITC标记蛋白质的过程中，需要注意以下几点： 1）FITC的选择：FITC是一种常用的荧光染料，但也可以选择其他荧 光染料，根据实验的需要选择适合的染料。 2）标记比例：根据蛋白质的浓度和需要的标记比例确定FITC的用量，过多的FITC会影响蛋白质的活性，过少的FITC则可能导致标记效率低。 3）反应条件：反应时间和温度的选择会对标记效果产生影响，需要 根据实验的要求进行优化。 4）去除未反应的FITC：未反应的FITC会对实验结果产生干扰，需 要进行彻底的去除。 FITC标记蛋白质的应用非常广泛，可以用于免疫细胞化学、流式细 胞术、免疫组化等实验中。通过FITC标记，可以使蛋白质在可见光下发 射绿色荧光，从而实现对蛋白质的检测和定位。 总结起来，FITC标记蛋白质的方法主要包括蛋白质的准备和FITC的 标记两个步骤。在标记过程中需要注意FITC的选择、标记比例、反应条 件和去除未反应的FITC。FITC标记蛋白质是一种简单、快速、可靠的方 法来标记蛋白质的FITC，需要按照以下步骤进行操作： 步骤1：蛋白质的准备 1.选择要标记的蛋白质，可以是纯化的蛋白质或者从细胞提取的蛋白质。 2. 使用合适的方法确定蛋白质的浓度，例如BCA或Bradford方法。

荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法

荧光素FITC标记抗体的原理和操作方法 中文名称：异硫氰酸荧光素酯 中文别名：荧光素-5-异氰酸酯; 异硫氰酸荧光酯异构体; 异硫氰酸荧光橙红; 异硫氰酸荧光红; 异硫氰酸荧光黄; 异硫氰酸荧光素（同分异构体I）; 荧光素5-异硫氰酸盐,异构体1,95%; 异硫氰酸荧光素异构体1.95+%; 异硫氰酸荧光素 英文名称：Fluorescein isothiocyanate isomer I 英文别名：Fluorescein isothiocyanate, isomer 1; 5-FITC; 5-Isothiocyanato fluorescein; FITC; FITC-CELITE(R); FITC ISOMER; FITC 'ISOMER I'; FITC, ISOMER I; FLUORESCEIN ISOMER I ISOTHIOCYANATE; 2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-5-isothiocyanatobe nzoic acid CAS号：3326-32-7 EINECS号：222-042-0 分子式：C21H11NO5S 分子量：389.3807 InChI：InChI=1/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24 )3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h 1-9,23H,(H,25,26) 分子结构： 密度： 1.46g/cm3 熔点：360℃ 沸点：735.6°C at 760 mmHg 闪点：398.7°C 水溶性：practically insoluble 蒸汽压： 1.02E-22mmHg at 25°C 【FITC标记原理】 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或

葡聚糖凝胶柱的使用方法

葡聚糖凝胶柱的使用方法： 1 预处理 称取Sephadex G-2550－100目约5g,加入蒸馏水100ml,置室温下3h进行溶胀; 2 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15;柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝约200目尼龙布垫底或购买类似规格的商品柱;然后将柱垂直安装好,先加入1/3柱体积蒸馏水,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入,使它们在柱内自然沉降;同时大开下口慢速流出蒸馏水;装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹;否则,必须到出重装,装好后,用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离; 3 加样 加样前,首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出,直到柱内液面与凝胶表面相齐或留一极薄液层为止;然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要让溶液把凝胶冲松浮起,加完样品后,打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐,再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次,待全部进入层析柱后,即可进行洗脱; 4 洗脱与收集 洗脱时,用蒸馏水作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干;本实验洗脱液流出的速度应控制在－min;洗脱液的收集采用分管连续顺序收集,每管收集3ml,共收集10管;据经验,4或5号管核苷酸浓度最大,可作为层析鉴定的样品液;但因层析柱长度的差异,管号会有变化,必要时可用紫外检测A260nm,找出浓度最大的管号; 5 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后,必须反冲疏松一次,平衡后再使用;若使用数次,就需要再生处理;用L L NaCl 溶液浸泡,然后用蒸馏水洗至中性备用;若实验完毕,将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干,再用95%乙醇洗两次,在60℃烘箱中烘干,回收保存; 实验五. 葡聚糖凝胶层析 实验目的 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理; 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术; 实验原理 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术,这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法;层析的固定相载体是凝胶颗粒,目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose; 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1,2—环氧丙烷交

FITC标记蛋白质

FITC标记蛋白质 Product Numbers: Synonym: FITC Appearance: yellow powder Storage Temperature 2-8 °C Molecular Formula: C21H11NO5S Molecular Weight: 389.4 Excitation: λmax = 495 nm Emission: λmax = 525 nm Fluorescein isothiocyanate (FITC，异硫氰酸荧光素) is widely used to attach a fluorescent label to proteins via the amine group. The isothiocyanate group reacts with amino terminal and primary amines in proteins. It has been used for the labeling of proteins including antibodies and lectins. FITC-N=C=S + N-H2-protein →FITC-NH-S-C-N-H-protein Preparation Instructions FITC is tested for solubility and solution appearance at 1 mg/mL in acetone to give a clear yellow solution. It is soluble in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) at 5 mg/mL. It is soluble in water at less than 0.1 mg/mL in water, at 20 mg/mL in ethanol and at 9 mg/mL in 2-methoxyethanol. An organic solvent for stock solution is advised, since FITC decomposes in water. FITC is diluted in basic buffer for coupling procedures immediately prior to use. Storage/Stability The products are light-sensitive, and should be stored dry and in the dark at 2 °C to 8 °C. Procedure of Labeling Protein with FITC 1.Preparation before experiment: 1)配100mL，0.1M PH=8.5的SB缓冲液(0-5℃保存，且不超过一周，最好现配现用)； 2)准备好A,B,C,D四个石英比色皿； 3)取一小容量瓶，事先用锡箔纸将其完全包住以避光； 4)用超纯水注满D=15mm，L=300mm的柱层析分离吸附柱，过夜浸泡，同时检测其是否漏液， 第二天再用PBS浸泡7-8h； 5)用DIW浸泡葡聚糖Sephadex G-50过夜(1g Sephadex G-50配5mLDIW)，使其溶胀，打开孔状

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC 标记及葡聚糖凝胶柱使用 荧光素FITC 标记抗体 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC 在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r 氨基与荧光素的硫碳胺键 (thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG 分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG 分子可结合2～8个分子的FITC ，其反应式如下: FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC -NS-C-N-H2-蛋白质 FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以 荧光标记 步骤： (1)试剂和材料 ①0．01mol ／L(pH7．2)PBS 配法中，校定pH 至7．2。NaCI18g 、Na2HP04 1．15g ，溶于2000ml 蒸馏水 ②0．1mol ／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol ／LNa 2CO 3(5．3％)10ml 加入0．5mol ／LNaHC03(4．2％)90ml ，混合后，校定pH 至9．0。 ③3％碳酸钠水溶液配法 称5g 无水碳酸钠充分溶解于50ml 灭菌蒸馏水中即成。 ④其他试剂和材料 l ％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 (2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol ／LNaCl)及缓冲液(0．5mol ／LNaHC03—Na 2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质1-5mg ，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。 ②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃下电磁搅拌12～14h 。 ③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler 试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 ④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01％，分装在lml 安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20℃保存可达 2年以上。

有关FITC标记的事项

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 荧光的基本知识 一、荧光现象 （一）荧光的产生 一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。 荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。 可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为光致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。 （二）荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。 荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度） 发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。 （三）荧光的猝灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧光的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。 常见荧光色素