2D_DIGE蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用

分子植物育种，２００８年，第６卷，第２期，第４０５－４１２页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００８，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．２，４０５－４１２

新思路、新技术、新方法

ＮｏｖｅｌＴｈｉｎｋｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用

甄艳

许淑萍

赵振洲

施季森＊

南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京，２１００３７＊通讯作者，ｊｓｈｉ＠ｎｊｆｕ．ｃｏｍ．ｃｎ

摘要蛋白质组技术是植物基因功能鉴定和分析的强有力工具。经典的双向电泳技术是蛋白质组研究的

核心技术，但差异蛋白质组分析使其具有更大的挑战性，因此在蛋白质水平的基因表达的定量分析研究需要

更高灵敏度和更宽动力线性范围的技术。双向差异凝胶电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２Ｄ－ＤＩＧＥ）是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术，比经典的２－ＤＥ具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离，进而减少了实验条件不一致引起的误差。２Ｄ－ＤＩＧＥ结合质谱、生物信息学及高可信度的统计分析使得成功地定量、鉴定植物蛋白质成为可能。本文综述了２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组学的基本原理，实验方法，２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组的优缺点和可能解决的方法，以及该技术体系在植物研究中的应用。

关键词２－ＤＤＩＧＥ，蛋白质组技术体系，植物

ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ－ｄｉｓｐｌａｙ２Ｄ－ＤＩＧＥＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＰｌａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ

ＺｈｅｎＹａｎ

ＸｕＳｈｕｐｉｎｇＺｈａｏＺｈｅｎｚｈｏｕ

ＳｈｉＪｉｓｅｎ＊

ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００３７＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｊｓｈｉ＠ｎｊｆｕ．ｃｏｍ．ｃｎ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｓｐｏｗｅｒｆｕｌｔｏｏｌｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｓ．Ｃｌａｓｓｉｃａｌｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ｉｓａｃｅｎｔｒａｌｔｏｏｌｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｓｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｍｐａｒａ－ｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｒｅｑｕｉｒｅｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｗｉｄｅｌｉｎ－ｅａｒｒａｎｇｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２－ＤＥｉｓｎｏｖｅｌｔｏｏｌｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ａｎｄｈａｓｍｏｒｅｄｙｎａｍｉｃｓｒａｎｇｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｗｉｔｈｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎ－ｄａｒｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｏｎａｇｅｌ，ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｖａｒｉａｔｉｏｎ．２Ｄ－ＤＩＧＥ，ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄｈｉｇｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅｅｎａｂｌｅｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｂａｓｅｄ－ＤＩＧＥｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｐｒｏｃｅｄｕｒｅｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ，ｉｍａｇｉｎｇａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆ２Ｄ－ＤＩＧＥ，ｐｏｓｓｉｂｌｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｒｅ－ｓｅａｒｃｈａｎｄｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ２Ｄ－ＤＩＧＥ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｐｌａｎｔ

随着人类、拟南芥、水稻、杨树等基因组测序的完成，鉴定基因的功能已面临着巨大的挑战。蛋白质作为基因功能的主要体现者，直接在蛋白质水平上分析和鉴定蛋白的功能及其翻译后修饰和调节，将会对阐明基因的功能起到极大的推动作用，蛋白质组学应运而生。蛋白质分离的双向电泳技术和敏感快速的蛋白质鉴定技术相结合已成了植物功能基因分析的强有力工具。近年来，蛋白质组学的研

基金项目：本研究由国家林业局９４８创新项目、江苏省３３３人才工程项目、江苏省博士后基金项目和中国博士后基金项目资助

究重点已从蛋白质的鉴定到量化转移。定量的蛋白

质组学研究可定义为多个样品间蛋白质丰度相对差异的研究。尽管一些可选择的或互补的蛋白质组学技术正在发展，如同位素亲和标签和多维蛋白质鉴定技术，但双向电泳仍是当前仅有的可以同时分离大量的复杂的蛋白质混合物的关键技术。目前定量蛋白质组面临着几个主要问题。一是银染虽然比考染的灵敏度高，但其有限的动力学范围不适合蛋

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

白质的定量；二是更加敏感的银染方法又不能与基于质谱的蛋白质鉴定技术兼容。最近，电泳后的荧光染料Ｓｙｐｒｏ家族的出现提供了比银染更好的动力范围（Ｍａｌｏｎｅｅｔａｌ．，２００１）；三是电泳胶的重复性问题；最后是不同胶间的归一化问题（ＬｉｌｌｅｙａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎ，２００４）。而差异凝胶电泳（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＩＧＥ）的引入使得在同一块胶上分离两种或更多的蛋白质样品混合物，这样可以减少实验误差带来的变异。ＪｏｎＭｉｎｄｅｒ实验室最先使用这项技术（Ｕｎｌｕｅｔａｌ．，１９９７），后来被ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司进一步的优化并市场化（ＬｉｌｌｅｙａｎｄＤｕｐｒｅｅ，２００６）。

技术和方法方面的考虑对蛋白质组学研究起到了关键的作用，尤其是定量蛋白质组学。本文重点讨论基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学方法和技术，包括样品的制备、实验设计、双向电泳统计分析。此外，对基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学的优点和缺陷及在植物蛋白质组学中的应用也进行了分析。

１ＤＩＧＥ蛋白质组学原理

ＤＩＧＥ系统基于荧光差异凝胶电泳（２Ｄ－ＤＩＧＥ）技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶图像。ＤＩＧＥ系统结合了新型荧光技术、样品多路技术（ｓａｍｐｌｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）和图像分析等特有的技术，是一套优于经典的２－ＤＥ的完整的系统。ＤＩＧＥ系统的工作流程图见图１。

图１荧光差异双向电泳流程图（Ｇａｄｅｅｔａｌ．，２００３）

Ｆｉｇｕｒｅ１Ｔｈｅｗｏｒｋｆｌｏｗｏｆ２Ｄ－ＤＩＧＥｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｂｕｎｄａｎｃｅ（Ｇａｄｅｅｔａｌ．，２００３）４０６

２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ－ｄｉｓｐｌａｙ２Ｄ－ＤＩＧＥＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＰｌａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ

２ＤＩＧＥ蛋白质组学方法

２．１样品的制备

基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学样品制备的最大特点是用荧光染料共价标记蛋白质。在蛋白质标记中，有两种标记方法，即最小标记和饱和标记。在最小标记中，来源于Ｎ－羟基琥珀酰亚胺衍生的荧光染料“ＣｙＤｙｅｓ”，与蛋白质中的氨基酸残基反应，具有代表性的赖氨酸侧链的氨基基团。通常用的有三种ＣｙＤｙｅｓ染料，即Ｃｙ２、Ｃｙ３和Ｃｙ５，它们标记两个蛋白质样品和内标。质谱分析优化的标记反应表明，每个染料分子仅标记一个蛋白质分子，即使多个赖氨酸被标记，但双标记的百分率很低以至于不能检测到。结果标记的蛋白质只占整体蛋白质的３％￣５％，这样使得荧光标记有较宽的动态定量范围（Ｍａｒｏｕｇａｅｔａｌ．，２００５），即可确保避免了溶解性降低引起的问题，可使显现的蛋白质被比较精确的定量。ＣｙＤｙｅｓ染料的单个正电荷可以取代赖氨酸在中性或是酸性ｐＨ条件下的单个正电荷，这样防止了等电点的偏离和假蛋白点的出现。另外，几种ＣｙＤｙｅｓ染料的大小是匹配的，使每个标记的蛋白增加了５００Ｄａ。这样同一蛋白标记了这几种染料的任何一种后，其在２Ｄ胶上迁移位置是相同的。ＣｙＤｙｅｓ染料最小标记非常敏感，可分析５０μｇ的蛋白质样品（Ｍａｒｏｕｇａｅｔａｌ．，２００５）。这个标记系统与下游的蛋白质质谱鉴定和数据库查询是兼容的，并确保了蛋白质的定量问题。饱和标记法是相对较新的一种标记技术，仅有几篇文献报道成功运用了这项技术（Ｆｕｊｉｉｅｔａｌ．，２００６；Ｇｒｅｅｎ－ｇａｕｚ－Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，２００５；Ｓｈａｗｅｔａｌ．，２００３；Ｓｉｔｅｋｅｔａｌ．，２００５；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，２００５）。饱和标记法是标记蛋白质的半光氨酸（Ｃｙｓ）残基，并尽量饱和所有Ｃｙｓ反应位点，因此饱和标记方法需要的染料的量较多。这种标记法可分析５μｇ的蛋白质样品，其敏感性更高，蛋白质不共迁移，无须固定步骤，并可精确的监测巯基的反应过程。但是技术上有更大的挑战，因为饱和标记技术需要预先根据蛋白质中Ｃｙｓ的含量对蛋白质／染料比例进行优化才能获得较好的实验图谱，此过程比较耗时。此外，这种标记不能检测不含Ｃｙｓ残基的蛋白质。因此，仅在样品丰度成为一个限制因子时才被采用。

蛋白质样品荧光标记过程中需要注意的是不要在样品裂解液中引入带有伯胺的组分，其将与蛋白质竞争性地结合荧光染料，例如两性电解质；巯基（例如ＤＴＴ）也将会引起标记效率的降低。除了电泳前的蛋白质样品荧光标记外，其余的在样品制备过程中的注意事项和优化条件与传统的双向电泳是一致的。

２．２ＤＩＧＥ实验设计

ＤＩＧＥ在研究多个样品丰度变化方面是一个强有力的工具。在最小标记法中，用Ｃｙ３和Ｃｙ５标记不同的样品，同时将所有的生物学样品等量混合后用Ｃｙ２标记作为内标。这意味着所有样品的每一个蛋白质均被Ｃｙ２标记并呈现在一块胶上。然后把三种染料标记的蛋白质样品混合物进行电泳。如此可以将样品中的每一个蛋白质点在胶内就可与相应的内标点对应起来，保证胶板内和不同胶板间的匹配。由于一些实验误差导致的蛋白量的变异对一块胶上的每一个样品的影响是一致的，因此，一块胶上的一个样品的蛋白质点的量与另一个样品中相应的蛋白质点的量比较将不会受到影响。标记的蛋白质点与内标比较将给出标准的丰度，进而比较样品间蛋白质点丰度的变化。通过激发波长的交替照射可以显示凝胶上的蛋白质点。可通过专门设计的差异分析软件（ＤｅＣｙｄｅｒ）进行蛋白质点的差异分析。在饱和标记中，不采用Ｃｙ２作为内标，而是用Ｃｙ３和Ｃｙ５中的一种标记作内标，另一种标记样品。在差异分析实验中这种方法减少了多重分析性，但增加了胶的数量。ＤＩＧＥ正确的实验设计对产生显著性统计分析数据和减少错误检出率是极为重要的。通常情况下，为了排除实验技术的干扰因素，胶的重复量要足够以灵敏地检测蛋白质的真实表达变化。另外，为了研究实验的生物学变异，每次重复实验利用新的样品是非常必要的。同时运行多块胶，并且相同的样品用所有的染料标记后，样品加在同一块胶上进行电泳分离，这样既能指示出系统的内在误差，又可以给出显著性或倍数变化域值。在最小标记中，由于Ｃｙ２，Ｃｙ３和Ｃｙ５在不同激发波长下有着不同的荧光特性，因此，低丰度蛋白质会存在着系统偏差。染色交换平衡效应可以极大的降低低丰度蛋白质的系统偏差，例如，胶１中样品Ａ用Ｃｙ３标记，样品Ｂ用Ｃｙ５标记，Ｃｙ２标记等量的两种样品作为内标；胶２中样品Ａ用Ｃｙ５标记，样品Ｂ用Ｃｙ３标记，Ｃｙ２标记等量的两种样品作为内标。另外，整合可选择性的归一化方法可以消除低丰度偏差并增加ＤＩＡ和ＢＶＡ的灵敏性（Ｋａｒｐｅｔａｌ．，２００４）。

ＤＩＧＥ正确的实验设计对产生显著性统计分析数据和减少错误检出率是极为重要的。通常情况下，

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为了排除实验技术的干扰因素，胶的重复量要足够以灵敏地检测蛋白质的真实表达变化。另外，为了研究实验的生物学变异，每次重复实验利用新的样品是非常必要的。同时运行多块胶，并且相同的样品用所有的染料标记后，样品加在同一块胶上进行电泳分离，这样既能指示出系统的内在误差，又可以给出显著性或倍数变化域值。在最小标记中，由于Ｃｙ２，Ｃｙ３和Ｃｙ５在不同激发波长下有着不同的荧光特性，因此，低丰度蛋白质会存在着系统偏差。染色交换平衡效应可以极大的降低低丰度蛋白质的系统偏差，例如，胶１中样品Ａ用Ｃｙ３标记，样品Ｂ用Ｃｙ５标记，Ｃｙ２标记等量的两种样品作为内标；胶２中样品Ａ用Ｃｙ５标记，样品Ｂ用Ｃｙ３标记，Ｃｙ２标记等量的两种样品作为内标。另外，整合可选择性的归一化方法可以消除低丰度偏差并增加ＤＩＡ和ＢＶＡ的灵敏性（Ｋａｒｐｅｔａｌ．，２００４）。

ＤＩＧＥ蛋白质组双向电泳过程的具体步骤：等电聚焦、胶条平衡和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与传统的双向电泳的操作过程是一致的。

２．３凝胶成像

荧光标记的蛋白质样品可用激光扫描成像。目前，用的较多的激光扫描成像系统是ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司的Ｔｙｐｈｏｏｎ系列，分别用４８８ｎｍ、５３２ｎｍ和６３３ｎｍ波长的激光对Ｃｙ２、Ｃｙ３和Ｃｙ５染料标记的蛋白图谱进行成像，相应的发射过滤波长为５２０ｎｍ、５８０ｎｍ和６７０ｎｍ。ＣｙＤｙｅＤＩＧＥ过滤器和激发器的使用并结合荧光通道间最小的交叉将给出最佳的实验结果。在Ｔｙｐｈｏｏｎ的扫描过程中，低荧光玻璃板的使用确保了胶扫描的易操作性和最大程度地减少了胶的污染（Ｍａｒｏｕｇａｅｔａｌ．，２００５）。Ｔｙｐｈｏｏｎ扫描产生的图像在质量上优于２Ｄ－Ｍａｓｔｅｒ成像系统。Ｔｙｐｈｏｏｎ有较宽的线性检测范围并且提高了Ｃｙ３和Ｃｙ５的灵敏性（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２）。

２．４双向电泳的统计分析

电泳图谱的分析是一个耗时且不易操控的过程，一直以来是蛋白质组学的一个主要瓶颈。ＤＩＧＥ蛋白质组通过比较实验组和对照组的荧光信号可以获得蛋白质表达框架。目前有几个可用的软件可对荧光胶进行归一化、定量化和统计分析。ＤｅＣｙｄｅｒＴＭ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）是基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学中常用的软件。差异分析是基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学的重要特点，它能全自动地对一块胶内的多个样品进行共找点，并全自动对多块胶进行匹配，得到蛋白质丰度的准确变化。常规检测到小于１０％的蛋白表达差异，统计学可信度达到９５％。ＤｅＣｙｄｅｒ软件平台有四部分组成，胶内差异分析模块（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｎ－ｇｅｌａｎａｌ－ｙｓｉｓ，ＤＩＡ），生物学差异分析模块（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＶＡ），批处理工具（ｂａｔｃｈｐｒｏｃｅｓｓｏｒ），ＸＭＬ工具箱（ＸＭＬｔｏｏｌｂｏｘ）。ＤＩＡ可全自动对单块胶进行背景扣除、定量、归一化等高通量分析，其检测是利用专门的算法对重叠的三幅图进行共找点，从而得到一致的、精确的比值计算。ＢＶＡ是处理多块凝胶板间的匹配问题，其利用实验设计中的内标的特点进行胶板与胶板间的比较计算出差异蛋白点的可信度水平。ＢＶＡ除了常规的实验组分析外，也可以进行多因素的实验分析。

然而，用ＤｅＣｙｄｅｒ软件进行统计分析也有一些漏洞，Ｆｏｄｏｒ等（２００５）对其进行了分析，并试图通过来源于微阵列分析的统计分析方法来克服这些缺陷，该方法降低了潜在的差异表达蛋白质的数量，但增加了检测的可信度（Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．，２００５）。文献中重点讨论三个漏洞和其潜在的解决方法，首先ＤｅＣｙｄｅｒ软件中传统的ｔ－ｔｅｓｔ的应用可能不是平行分析许多蛋白质差异表达的最佳方法。另一个Ｍｏｄｅｒａｔｅｄｔ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ方法值得推荐。该方法是依据分层次的、混合古典或贝式模型，且在特定的假设条件下遵循ｔ分布；其二是分析ｔ－ｔｅｓｔ结果时，通常当概率值ｐ小于０．０５时定义为具有显著性差异，然而基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学分析的蛋白质数量大约为２０００个，这就意味着用小于或等于０．０５的概率值时，每分析１０００个蛋白质点将产生５０个可能的假阳性。因此，需要更加严谨的标准进行差异显著性分析，以减少错误判别率。目前常用的、严谨的校正方法是Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正法。该方法通过对所有的检测样品进行分析，增加未校正ｐ值来进行多重显著性检测。另一个严谨性略差，但实用的方法是假阳性率的计算和构建连续性的ｐ值程序来控制假阳性率的期望值。其三是Ｄｅ－Ｃｙｄｅｒ软件倍数变化分析的评价显示在胶板内和胶板间的标准对数丰度分布具有系统偏差（Ｈｏｏｒｎｅｔａｌ．，２００６）。Ｋａｒｐ等（２００４）给出了提高ＤＩＧＥ精确性和灵敏性分析的一些建议。其中对ＤＩＡ方法有两种选择，其一是表达比率法，包括以下几个方面：ＤｅＣｙｄｅｒＴＭ软件编码蛋白质点；用过滤器排除Ｖｏｌｕｍｅ值小于４００００的蛋白质点；在ＤｅＣｙｄｅｒＴＭ软件中再设置一次数据归一化；用±２作为显著性表达比率域值，其可增加可信度，但减少灵敏度。其二是Ｚ得分法，包括利

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用ＤｅＣｙｄｅｒＴＭ的ＤＩＡ编码蛋白质点并给出蛋白点的Ｖｏｌｕｍｅ信息；计算附加补偿和缩放归一化转换参数比例；用特定的方程计算每一个蛋白质点的Ｚ分数值；利用－２．３２和＋１．５２的Ｚ分数值作为域值来计算具有９０％可信度的显著性变化（Ｋａｒｐｅｔａｌ．，２００４）。Ｋｒｅｉｌ等（２００４）研究表明特定染料偏差尤其存在低丰度蛋白点中，建议用补偿或是比例标准化的方法给于矫正（Ｋｒｅｉｌｅｔａｌ．，２００４）。通常条件下，无论用何种统计方法进行差异分析，均有必要用其它的方法对其变化进一步的验证，例如，免疫杂交等。最终，ＤＩ－ＧＥ的统计分析结果将会获得一系列研究人员所感兴趣的蛋白质，这些蛋白质在实验组和对照组之间应表现出显著的变化。

荧光染料标记的蛋白质比未标记的蛋白质在分子量上有明显的迁移（ＣｙＤｙｅ染料的分子量和疏水性影响的双向电泳过程中蛋白质的迁移），大部分未标记的蛋白在标记蛋白的偏下方，可能导致要切取目标蛋白点的污染。因此，在切取目标蛋白质点进行质谱鉴定前，需要跑一块斑点切取胶，大量未标记的蛋白质的上样量达１ｍｇ，并用考马斯亮兰或ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ染色（Ｈｏｏｒｎｅｔａｌ．，２００６；ＬｉｌｌｅｙａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎ，２００４）。

３２Ｄ－ＤＩＧＥ的在植物蛋白质组学中的应用

到目前为止，已有一些关于植物材料的基于ＤＩ－ＧＥ蛋白质组学研究报道，但不多，这些研究主要涉及到一些植物亚细胞结构的蛋白质组学研究。Ｂｏｈｌｅｒ等（２００７）用２Ｄ－ＤＩＧＥ和ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ相结合的差异蛋白质组学技术，研究了植物膜中富含鞘脂类和甾醇类的抗去污剂膜域（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ－ａｎｄｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈｍｅｍｂｒａｎｃｅｄｏｍａｉｎｓ，ＤＲＭｓ）蛋白的量。这些ＤＲＭｓ与其它膜成分分开较困难，因此较难纯化，但由于ＤＲＭｓ在ＴｒｉｔｏｎＸ１００中的溶解性不同，使得ＤＲＭｓ中的蛋白可被分离、纯化。通过ＤＩＧＥ的平行比较分析发现ＤＲＭｓ大量富集了特异的蛋白，包括糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白质（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓ－ｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ）和ｓｔｏｍａｔｉｎ／ｐｒｏ－ｈｉｂｉｔｉｎ／ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ反应蛋白家族蛋白，这表明ＤＲＭｓ来源于质膜域，但实验中没有发现完整的膜蛋白，表明ＤＲＭｓ样品的制备过程中产生特定系列的膜蛋白。质膜中包含植物甾醇类和富含鞘脂类的脂域，对于这些域相关的蛋白质进行深入研究将为了解植物细胞极性和细胞表面过程提供了重要的、新的实验方法（ＬｉｌｌｅｙａｎｄＤｕｐｒｅｅ，２００６）。

Ｋｕｂｉｓ等（２００３；２００４）用基于ＤＩＧＥ蛋白质组学阐明了前蛋白质输入叶绿体的机制，在此研究中需要制备相对纯的叶绿体样品。ＤＩＧＥ蛋白质组学研究工作是在Ｃｙ２出现前开展的，并涉及到定量蛋白质的平行比较。通过对比多种ＴＯＣ易位子亚基的野生型和突变型拟南芥的叶绿体蛋白，探究各种易位子复合物对输送蛋白类型的特异性（Ｋｕｂｉｓｅｔａｌ．，２００３；２００４）。

大麦硫氧还蛋白ｈ异构体ＨｖＴｒｘｈ１和ＨｖＴｒｘｈ２有不同的时空分布和动力学特性。为了改进已建立的目标蛋白硫氧还蛋白的鉴定技术，采用了双向电泳和高灵敏性的Ｃｙ５染料硫醇荧光标记，结果所观察到的标记蛋白质点的数量增加了１０倍。这项技术也提供了在大麦种子蛋白质组中所鉴定蛋白质硫醇基团的一些信息（Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，２００４）。

内质网是储存蛋白质和脂生物合成的主要场所（细胞器），这些储存复合物的最大合成时期出现在种子发育期，而种子萌发期则降解。Ｍａｌｔｍａｎ等（２００７）用２Ｄ－ＤＩＧＥ并结合ＰＭＦ和ＭＳ／ＭＳ定量和鉴定了蓖麻种子发育和萌发过程内质网蛋白质的差异。９０个蛋白质点在种子发育时期呈上调趋势，所鉴定的１９个蛋白质大部分是种子储藏物合成的中间产物和蛋白质折叠相关蛋白。在萌发种子内质网中１５个蛋白质点上调，其中所鉴定的五个蛋白质中一个为苹果酸合成酶，认为其可能是内质网乙醛酸循环途径中的一个组分。在尿素溶解的内质网蛋白质中没有检测到参与复合脂合成的蛋白，表明它们可能是完整的膜蛋白（Ｍａｌｔｍａｎｅｔａｌ．，２００７）。

除了在植物组织、器官方面的研究外，ＤＩＧＥ蛋白质组学在研究植物生物和非生物胁迫下的生理和生化方面有着无比的优越性。Ｎｄｉｍｂａ等（２００５）采用２Ｄ－ＤＩＧＥ技术和ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ相结合分离和鉴定了拟南芥悬浮培养细胞盐胁迫和高渗胁迫反应蛋白。通过ＣｙＤｙｅ荧光染料标记共检测到２９４９个蛋白质点，并且这些蛋白质点在八块ＣｙＤｙｅ标记的蛋白质组胶上完全匹配。利用ＤｅＣｙｄｅｒＢＶＡ软件对处理和对照样品的蛋白质点丰度统计分析，共获得２６６个蛋白质点在丰度方面表现出显著的变化。２Ｄ－ＤＩＧＥ和ＤｅＣｙｄｅｒ差异分析软件相结合在分析蛋白质组变化方面有许多优越性（Ｎｄｉｍｂａｅｔａｌ．，２００５）。Ａｍｍｅ等（２００６）利用引入内标的２Ｄ－ＤＩＧＥ技术监测两种冷胁迫条件下蛋白质的渐进变化，通过ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ和ＭＳ／ＭＳ鉴定了许多以往研究中未得到的蛋白质点，这表明ＤＩＧＥ蛋白质组学方法在进一步更加深入研究冷胁迫蛋白质组方面是有效的（Ａｍｍｅｅｔａｌ．，２００６）。

有关木本植物的２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组学研究较２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用

ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ－ｄｉｓｐｌａｙ２Ｄ－ＤＩＧＥＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＰｌａｎｔＲｅｓｅａｒｃｈ

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分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

少，国内黄华宏等（２００６）利用ＤＩＧＥ蛋白质组学研究了矮化杉木的突变机理，所得到的２９个差异蛋白质可能与杉木矮化突变发生有关。国外仅见Ｂｏｈｌｅｒ等（２００７）利用ＤＩＧＥ蛋白质组学研究了杨树叶子臭氧胁迫下的碳代谢变化。目前，我们实验室正利用ＤＩ－ＧＥ技术开展树木种子发育过程中和体细胞胚胎发生过程中蛋白质组学研究。

４ＤＩＧＥ蛋白质组学缺点和可能的解决方法

每一项技术都有其自身的缺陷，ＤＩＧＥ蛋白质组学在极端等电点或分子量的蛋白质的分离、低丰度蛋白质和疏水蛋白质（膜蛋白）的鉴定存在一定的缺陷。蛋白质的共迁移现象为准确定量一个混合蛋白质点中的一个蛋白质丰度带来难度，但可通过选用窄范围的ＩＰＧ胶条或蛋白质样品的预分级分离来提高蛋白质的分离和鉴定。尽管实际上所研究的蛋白质样品的完整蛋白质组应展现在２Ｄ胶上，但通过质谱来鉴定低丰度蛋白仍非常困难，即使优化的质谱的鉴定率也仅达到５０％或更少。主要原因是因为蛋白质点的切取和质谱鉴定的特性，例如，蛋白质点的切割时可能切取斑点的外周，接下来的洗涤过程可能会稀释样品，胰蛋白酶酶解可能不完全，样品不处于ＭＡＬＤＩ点样盘中心或是质谱仪的灵敏度不高等因素，均会影响的蛋白质的质谱鉴定。用基于ＬＣ－的蛋白质组学技术将会减少影响蛋白质的质谱鉴定的因素，因为通常ＬＣ与质谱仪直接耦连的（ＬＣ－ＭＳ）。通常，提高低丰度蛋白质鉴定的策略主要包括提高蛋白质的浓度、应用富集策略、疏水复合物包被ＭＡＬＤＩ点样盘和应用灵敏度高的质谱分析仪等方法（Ｈｏｏｒｎｅｔａｌ．，２００６；Ｑｉｎｅｔａｌ．，２００５）。

完整的膜蛋白，尤其是带有多个跨膜域的膜蛋白的双向电泳分离是非常困难的。原因是这些蛋白质需要强的去污剂溶解，例如ＳＤＳ，但其会影响等电聚焦过程。硫尿（离液剂）、尿素和两性离子去污剂的引入在一定程度上增加了膜蛋白的溶解性，但不能根本解决这个问题。在一些情况下，其他去污剂，例如寡聚乙烯氧（ｏｌｉｇｏｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ），十二烷基磺基甜菜碱（ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ），磺基甘氨酸三甲内盐（ａｍｉｄｏｓｕｌｐｈｏｂｅｔａｉｎｅ），十二烷基麦芽糖苷（ｄｏｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ）和油醇聚氧乙烯（１０）醚（ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｍｏｎｏｈｅｘａｄｅｃｙｌ）的应用对膜蛋白的溶解有很好的效果。仅有少数的文献报道了膜蛋白复合物的分离方法，例如蓝绿温和胶凝胶电泳（ｂｌｕｅｎａｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）和Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相结合分离膜蛋白（Ｓｃｈ!ｇｇｅｒｅｔａｌ．，１９９１）；有报道利用双重ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离膜蛋白，一维是６Ｍ尿素的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，二维是无尿素的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｒａｉｓｅｔａｌ．，２００４）；其它分离膜蛋白的２－ＤＥ方法是使阳离子ＰＡＧＥ和阴离子ＰＡＧＥ结合，一向用阳离子去污剂ｂｅｎｚｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｎ－ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｏｎｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ分离，二向是用ＳＤＳ分离。因为蛋白质在这两个系统中显示不同的迁移特性，并具有高的分辨率，且完整膜蛋白的溶解性很好（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，１９８９）。Ｈｅｌｌｉｎｇ等（２００６）利用ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４相分级分离、富集Ｔ细胞的膜蛋白后，依据ＣＴＡＢ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离方法，并结合灵敏度高的荧光饱和标记ＤＩＧＥ（２Ｄ－Ｃ／Ｓ－ｓａｔ－ＤＩＧＥ）分离Ｔ细胞的膜蛋白。ＣＴＡＢ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ原理基于一向用阳离子去污剂ＣＴＡＢ管状胶分离，二向是用ＳＤＳ分离。此方法不仅在样品制备方面有很好的重复性，而且在蛋白质分离的重复性也很好，其有利于样品（甚至微量样品）的差异蛋白质组的有效统计分析。

除了技术方面的考虑外，结合不同的方法学将有助于克服基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学的缺陷。例如，对一些重要的通道和泵膜蛋白的特性有很好的了解，但却很少了解细胞内信号级联反应如何调节这些蛋白质的。因此，目标蛋白质组学和基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学的结合将会解决这些问题。在目标蛋白质组学中，利用已知的抗体通过一系列免疫杂交实验研究特定条件下相应膜蛋白的调节变化。随后，用基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学鉴定参与这些膜蛋白调节的细胞内蛋白（ＫｎｅｐｐｅｒａｎｄＭａｓｉｌａｍａｎｉ，２００１）。另一个新的方法是将蛋白质组学分析和生物信息学途径分析相结合，即将基于ＤＩＧＥ的蛋白质组学鉴定的蛋白质作为输入数据来进行途径分析，可得到其它几个蛋白，其中包括参与特定细胞过程的低丰度调节蛋白和转录因子。这些计算机模拟鉴定的假设蛋白质可通过免疫杂交实验验证在细胞过程中的上调或下调方式（Ｈｏｏｒｎｅｔａｌ．，２００６）。

ＤＩＧＥ的最主要的一个问题是需要大量的资金投入来组建这个系统，需要荧光扫描系统和软件差异分析系统，并且ＣｙＤｙｅｓ染料的价格不菲。目前这些因素均一定程度地限制了ＤＩＧＥ的蛋白质组学的广泛应用。

５展望

２Ｄ－ＤＩＧＥ技术的引入和创新是蛋白质差异表达技术真正意义上的变革，其可以通过统计可信度检测到蛋白质表达的微小差异，并且饱和标记进一步增加了检测的灵敏度和减少了样品的需求量。蛋白

４１０

质组学和其它组学技术（基因组学、转录组学和代谢组学）的发展、整合与生物信息学相结合使得在系统水平上研究生物学成为可能，其中全面的、定量分析蛋白质变化和蛋白质翻译后的修饰研究则是至关重要的。定量同位素编码亲和标签（ＩＣＡＴ）可精确地用于分析不同样品中蛋白质表达量的差异，但是在破译鸟枪蛋白质组产生的复杂的质谱变的非常困难。不含半光氨酸的蛋白和转录后修饰的蛋白在ＩＣＡＴ方法中均检测不到，而２Ｄ－ＤＩＧＥ技术以其特有的能力提供了蛋白质修饰信息。因此，在蛋白质组学研究中２Ｄ－ＤＩＧＥ具有巨大的优势，并且随着２Ｄ蛋白质组定量分析技术的发展及自动化过程的提高，其应用的范围和前景将越来越广泛。

随着定量蛋白质组学是基于ＤＩＧＥ和ＬＣ的平台的发展，及结合基因组学、强有力的生物信息学等领域将成为植物系统生物学研究的下一个重要的焦点。２Ｄ－ＤＩＧＥ通过研究植物组织、器官、亚细胞及生物与非生物胁迫的蛋白质的变化来揭示生理或病理的变化，并且可定性和功能性分析标志性蛋白质及代谢框架。２Ｄ－ＤＩＧＥ蛋白质定量分析技术的发展和应用极大的促进了蛋白质组学研究，与其他蛋白质组技术相互整合和互补，为生命科学研究提供了一个有效的工具。

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４１１

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

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《分子植物育种》在２００７年粮食作物类期刊影响因子排名第４

《分子植物育种》已成为农业科学领域的一份重要期刊，每年刊登作物遗传育种、生物技术及分子生物学类的大量研究报告和研究综述，《分子植物育种》２００６年影响因子０．９１８，在重要粮食作物类期刊中影响因子排名名列前茅。

序号１

２

３

４

５刊名

玉米科学

中国水稻科学

麦类作物学报

分子植物育种

杂交水稻

影响因子

１．６８３

１．６１０

１．０３３

０．９１８

０．７１７

序号

６

７

８

９

１０

刊名

中国稻米

杂粮作物

大麦与谷类科学

ＲｉｃｅＳｃｉｅｎｃｅ

福建稻麦科技

影响因子

０．６３４

０．３３５

０．３０１

０．１５０

０．１３０

４１２

蛋白质组学研究方法选择及比较

蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：

●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。

蛋白质组学研究的完整解决方案

蛋白质组学研究的完整解决方案 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。 为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System） 该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征： * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃ * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统 * 提供超纯的相关化学试剂和药品

比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2　应万涛1,2　钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所　北京　100850;2北京蛋白质组研究中心　北京　102206) 摘　要　比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词　比较蛋白质组学　稳定同位素标记　体内代谢标记　体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract　C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords　C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新　男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。　3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.wendangku.net/doc/098715060.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受

蛋白质组学在植物科学研究中的应用

蛋白质组学在植物科学研究中的应用 1. 植物群体遗传蛋白质组学 1.1遗传多样性蛋白质研究 基于基因组学的一些遗传标记，如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)等，已经广泛地应用于植物遗传研究中。与基因组学的遗传标记相比，由于蛋白质组学的研究对象是基因表达的产物，是介于基因型和表型之间的特性，因而蛋白质组学标记是联系基因多样性和表型多样性的纽带，具有独特的意义。 通过蛋白质组比较来检测遗传多样性的变化已有许多成功的尝试。Barrenche等(1996年)比较了6个欧洲国家的23种橡树，分析了幼苗的总蛋白质，共得到530种蛋白质，其中101个具有多态性。实验结果显示种内和种间的距离非常接近，并且证实无梗花栎(Quercus petraea)和夏栎(Quercus robar)两个种的遗传分化水平很低。Picard等(1997年)利用2D-PAGE 分析了亲缘关系很近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性，发现品系间的多态性很低并且7个蛋白可以用于基因型的鉴定。David等(1997等)也利用2D-PAGE技术比较了栽培于不同环境下但起源于同一种群的小麦，结果所有的种群都与原种群有差别，David等认为，这不是由随机漂移引起，而是由适应其各自的气候条件而形成。 1.2 突变体的蛋白质组学研究 突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一，应用蛋白质组学的方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究可以揭示一些植物生理生态过程的机制。具体做法通常是对在相同条件下栽培的突变体及野生型植物的2D-PAGE图谱进行比较，受到影响的蛋白质通过质谱法或Edman测序法进行鉴定，为研究表型突变背后的生化过程提供有价值的信息。

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用

第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化

蛋白质组学复习资料

蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简

植物蛋白质组学研究进展

植物蛋白质组学研究进展 摘要 蛋白质组学是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域。该文简要介绍了蛋白质组学产生的科学背景、研究方法和研究内容。蛋白质组学研究方法主要有双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交系统、植物蛋白质组数据库等。其应用的范围包括植物群体遗传学、在个体水平上植物对生物和非生物环境的适应机制、植物的发育和组织器官的分化过程，以及不同亚细胞结构在生理生态过程中的作用等诸多方面。同时对植物蛋白质组学的发展前景进行了展望。 关键词双向电泳质谱蛋白质组植物蛋白质组学 1 蛋白质组学概念、内容及其产生背景 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组一词是由英文单词蛋白质的前半部分加上基因组的后半部分组合而成，它是指基因组表达产生的所有相应的蛋白质，即细胞或组织或机体全部蛋白质的存在及活动方式。蛋白质组学一词是由澳大利亚学者威尔金斯和威廉姆斯在1944 年意大利召开的一次科学会议上首次提出，并由Wasinger等第一次在出版物中使用。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，从整体蛋白质水平上，在一个更加深入、更加贴近生命本质的层次上去探索和发现生命活动的规律和重要的生理、病理现象等。 1.2植物蛋白质组学的研究内容 蛋白质组学研究主要包括蛋白质的表达模式和蛋白质的功能模式两个方面。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要是研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。常规的方法是提取蛋白质，经2D-E分离形成一个蛋白质组的二维图谱，通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等，再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定，建立起细胞或组织或机体在所谓“正常生理条件下”的蛋白质组图谱和数据库。然后，在此基础上，可以比较分析在变化了的条件下蛋白质组所发生的变化，如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等，从而发现和鉴定出特定功能的蛋白质及其基因。 1.3植物蛋白质组学的产生背景 蛋白质组学是在基因组学的研究成就和高通量的蛋白质分析技术得到突破的背景下产生的新兴学科，基因组研究的发展是蛋白质组学产生的重要前提。 基因组研究是生物科学近十几年来的研究热点。人类基因组计划被誉为20世纪的3大科技工程之一，并取得了辉煌的成就。2000 年6月科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。2001年2月，中、美、日、德、法、英等( 国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果，宣告了一个新的纪元———后基因组（即功能基因组）时代的到来。 植物基因组学的研究主要集中在拟南芥和水稻（两种模式植物上。2000年12月美、英等国科学家宣布测出拟南芥基因组的完整序列，这是人类首次全部破译高等植物的基因序列。2002 年是水稻基因组学研究取得重大成就的一年，首先中国的科学家和syngenta 公司的科学家分别发表籼稻和粳稻基因组“工作框架图”，继后日本和中国的科学家又分别公布了粳稻第0 号和第F 号染色体的全序列以及籼稻粳稻基因的“精细结构图”，被认为是基因组学研究的又一个重要里程碑。 基因组密码的破译，拉开了生命科学研究的序幕，但是，要真正揭示生命活动的奥秘，基因组研究本身又无能为力。因为，基因组仅仅是遗传密码和遗传信息的载体，在生命活动

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳

第35卷　第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 　收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 　基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002)　作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 　引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄　艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏　南京　210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化

蛋白质组学及其主要技术

蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复

植物蛋白质组研究方法

第31卷第3期湖南农业大学学报(自然科学版) V ol．31 No．3 2005年6月Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Jun．2005 文章编号：1007-1032(2005)03-0342-05 植物蛋白质组研究方法 龙桂友a，刘 杰b，饶力群b (湖南农业大学 a.园艺园林学院；b.生命科学与技术学院，湖南长沙 410128) 摘要：蛋白质组研究是后基因组时代的热点领域．介绍了蛋白质组概念提出的背景，蛋白质组与基因组的联系与区别，蛋白质组研究的内容，重点综述了植物蛋白质组研究的技术．双向凝胶电泳仍为蛋白质分离的核心技术，该技术在某些方面作了改进和发展；生物质谱是蛋白质鉴定的关键技术，进一步发展了生物传感芯片质谱及蛋白质芯片技术；对蛋白质组研究的信息处理依赖于生物信息学的发展，介绍了国内外相关的蛋白质数据库及建立数据库主要应用的图像软件． 关键词：植物蛋白质组；双向凝胶电泳；生物质谱；蛋白质数据库；蛋白质芯片 中图分类号：Q51 文献标识码：A Methods of Plant Proteome Research LONG Gui-you a，LIU Jie b，RAO Li-qun b (a.College of Horticulture and Landscape；b.College of Life Science and Technology，HNAU，Changsha 410128，China) Abstract: Proteome research is one of the most active fields in the post-genomic era．In this paper is an attempt to introduce the scientific background of the origination of proteome，the content of proteome research and the distinction between proteome and genome．This article focuses on reviewing the methods of plant proteome study，which include the improved two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis that is the core technique of protein separation，bio-mass spectrometry that is the critical tool of protein identification and the protein database that is the main means of protein information processing．It also makes a description of some last developed techniques in proteome research such as biosensor chip mass spectrometry and protein chip，2D image analysis software． Key words: plant proteome；two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis；bio-mass spectrometry；protein database；protein chip 澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams 于1994年首先提出了蛋白质组的概念，即基因组表达的全部蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织或细胞基因组的全部蛋白质产物的表达谱[1~3]．随着人类基因组研究工作的进一步深入，生命科学将进入后基因组时代，基因组学的研究重点从结构基因组学过渡到功能基因组学[4]．蛋白质组学作为后基因组计划的一个重要组成部分，成为生命科学的最前沿研究领域 [5~8]． 蛋白质组与基因组有紧密的联系，但二者也存在着根本的区别．从基因到mRNA再到蛋白质，最后体现生命功能的是蛋白质，基因组决定了细胞的遗传特性，但是基因的遗传信息最终要通过蛋白质的功能来表达．组成某一有机体的所有细胞共享一个特定的基因组，但由于基因组内各个基因表达的条件和表达的程度随时间、地点、环境、条件而不同，因而其表达的最终产物蛋白质组便处于一个新陈代谢的动态变化中，即使同一种细胞的生长与活动，也因不同时期、不同条件其蛋白质也处在不断的变化之中．人类基因只有3~4万个，而蛋白质却有25万种[9]，一个基因可以产生多种蛋白质，而且形式各异，功能不同．因而仅以基因组水平很难认识生命活动的全部过程，尚需借助蛋白质组学研究以诠释生命的全部内涵[2，3]． 收稿日期：2004-10-10 基金项目：湖南省科技重大专项(04NK1005) 作者简介：龙桂友(1963-)，男，汉族，湖南永兴人，博士研究生，湖南农业大学副教授．