微生物实验讲义[1]
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实验一微生物的认识（4学时）
一、实验目的
1、掌握显微镜的使用和保养方法
2、了解显微镜的基本原理和细菌形态
3、建立无菌概念
二、实验内容
1、学习显微镜的使用和保养
2、观察细菌的染色装片
3、微生物检查
三、显微镜的结构和使用保养
（一）显微镜的构造
普通光学显微镜机械系统和光学系统两部分组成。
1、显微镜的机械系统
（1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。
（2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。
（3）物镜转换器
Motic显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
（4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。
（5）推进器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。
（6）粗调螺旋粗动螺旋是移动载物台调节接物镜和标本间距离的机件，右手向前扭载物台下降，让标本远离物镜，反之则上升，标本接近物镜。
（7）微调螺旋用粗调螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微调螺旋做进一步调节。微调螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。
2、显微镜的光学系统
（1）集光镜卤素灯泡（12V/20W），配有电流调节螺旋通过，调节电流大小调节光照强度。
（2）聚光器由阿贝聚光透镜（数值孔径1.25）、虹彩光圈和升降螺旋组成的。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。
聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm 处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8—1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组
前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。
（3）物镜安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。
物镜的种类很多，可从不同角度来分类：
根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：
①干燥系物镜以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。
②油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为90×—100×，数值孔值大于1。
根据物镜放大率的高低，可分为：
①低倍物镜 4×/0.1，物镜视场：4.5mm；
②中倍物镜 10×/0.25；物镜视场：1.8mm；
③高倍物镜 40×/0.65；物镜视场：0.45mm；
④油浸物镜 100×/1.25 物镜视场：0.18mm；
根据物镜像差校正的程度来分类可分为：
①消色差物镜是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。
②平场物镜(Plan)。
（4）目镜10/18（后一数字表示视场数）目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。
物镜视场＝视场数/物镜的放大倍数
（二）显微镜的性能
显微镜分辨能力首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。
1、数值孔径也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。
数值孔径可用下式表示
α
2
式中：
n—物镜与标本之间的介质析射率
α—物镜的镜口角
所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。镜口角α总是小于180°。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1。
几种物质的介质的折射率如下：
空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。
2、分辨力
D可用下式表示：
D=λ/2N.A.
可见光的波长为0.4—0.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。
3、放大率：
显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜
的放大率（V）等于物镜放大率（V
1）和目镜放大率（V
2
）的乘积，即：
V=V
1×V
2
4、焦深：
在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。
(三) 显微镜的使用操作及注意事项
1、观察前的准备
显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约5cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。
2、低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。
将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。
3、高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台
上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。
4、油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
使用油镜按下列步骤操作：
1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出，4倍物镜对准光路。
2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。
5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2—3下即可，（注意向一个方向擦拭）。
6、将各部分还原，转动物镜转换器，4倍物镜对准光路，载物台下降至最低，降下聚光器，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，整理电源线，罩上显微镜罩，然后将显微镜放回。
四、细菌染色装片观察
1、观察顺序：低倍镜→（中央）高倍镜（中央）→油镜
2、绘图
（1）油镜下观察到的图像；
（2）在图像下注明菌种名称，后面括号内注明放大倍数。
五、微生物检查
1、实验室空气：打开培养皿盖，暴露1小时。37°C倒置培养2天后观察。
2、人体表面
（1）手指表面：火焰旁用手指在培养基表面轻按一下。37°C培养2天后观察。（2）头发：在培养基上放置1-2跟头发。37°C培养2天后观察。
六、实验报告要求（略）
实验二细菌一般形态观察（3学时）
一、实验目的
1、巩固显微镜的使用和细菌的涂片方法
2、掌握细菌的单染色和革兰氏鉴别染色技术
二、实验内容
1、细菌单染色
2、革兰氏染色
三、原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
染色种类：
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
复染色是用两种或两种以上的染料，常用于鉴别微生物，如革兰氏染色、芽孢染色和抗酸染色等。
负染色：使微生物背景着色，如细菌荚膜染色。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
四、操作
（一）单染色
1、涂片（直径1厘米左右）；
2、干燥：自然干燥或在酒精灯上方；
3、热固定：使细胞质凝固，杀死微生物，固定细胞形态，使细胞固定在载玻片上。涂菌面朝上，通过火焰2－3次，涂片反面以不烫手为宜，温度过高会破坏细胞形态；
4、染色：约2分钟，期间不要使染液干涸；
5、水洗：不要直接冲洗涂面（滴下水无色为止）；
6、干燥：自然干燥或吸水纸洗干（不要擦掉菌体），完全干燥后镜检。（二）革兰氏染色
1、涂片：混合涂片
2、晾干：同简单染色法。
3、固定，与简单染色法相同
4、结晶紫色染色：加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染色液染色1分钟。
5、水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
6、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
7、水洗：用水洗去碘液。
8、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至载玻片下沿流出液无色，立即水洗。
9、复染：滴加蕃红复染2min。
10、水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
11、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
12、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
革兰氏阳性菌：染成蓝紫色；
革兰氏阴性菌：染成（浅）红色
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
2.涂片过厚，可造成脱色不完全而成假阳性。
3、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
4、菌龄：G+菌如白葡萄球菌，培养时间不超过24h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验报告
1、绘出革兰氏染色两种细菌的形态图，注明染色结果；
2、回答相关思考题。
思考题：
1、固定的作用，应注意那些问题？
2、为何制片完全干燥后才能用油镜观察？
3、革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
实验三细菌特殊结构观察（3学时）
一、实验目的
1、掌握细菌芽孢的染色方法
2、了解常用的几种特殊染色在微生物形态分类中的重要性
二、实验内容
1、细菌的芽孢染色
2、细菌鞭毛、荚膜染色装片观察
三、芽孢染色原理
细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。
四、操作——Schaeffer-Fulton氏染色法
1、制片
按常规涂片、干燥、固定
涂片应偏向载玻片一端，取菌不宜太少，因部分或大部分菌芽孢未形成
2、染色：
（1）加数滴5%孔雀绿染液于涂片处（染料以铺满涂片处为度），用竹夹夹住载玻片一端，在酒精灯火焰上加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热时温度不能太高，期间要随时添加染液，切勿让标本干涸。
（2）水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。
（3）复染：用蕃红液染色2min。
（4）水洗后晾干或吸干。
（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。
染色结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。
五、实验报告
1、绘图表示芽孢杆菌的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊形状。
2、回答思考题P33（3）。
实验四放线菌形态观察（2学时）
一、实验目的
1、了解放线菌的形态结构
2、学习放线菌的观察方法
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。紧贴固体培养基表面或深入培养基内部生长的叫基内菌丝（基丝），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（气丝），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产基丝而无气丝。光镜下直接观察时，气丝在上层，较粗且色暗，基丝在下层，较细且较透明。孢子丝依种类不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。油镜下观察，孢子有各种形状。
扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，用镊子取出盖玻片放在洁净的载玻片上直接观察。
三、实验内容
1、观察插片法培养放线菌的形态结构
2、观察放线菌装片
三、操作步骤
1、扦片培养（教师提前做好）
2、镜检用镊子小心拔出盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦掉，然后将有菌的一面朝上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。
注意：光线宜暗些便于观察。
3、染色装片观察。
四、实验报告
绘图说明所观察到的放线菌的主要形态。
实验五霉菌的形态观察（2学时）
一、实验目的
1、了解霉菌的形态结构
2、学习霉菌的观察方法
二、实验原理
霉菌菌丝也分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。许多分枝的菌丝相互交织在一起称菌丝体。霉菌菌丝的直径比放线菌约粗几倍到十几倍，用低倍镜即可观察。
用乳酸石炭酸棉蓝染液制成的制片特点是：细胞不变形；具防腐作用，不易干燥，可长时间保存；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差，便于观察；必要时用树胶封固制成永久装片。
三、实验内容
1、霉菌的直接制片观察
2、根霉、毛霉、曲霉、青霉的装片观察
四、操作步骤
1、直接装片观察
（1）根霉、毛霉、曲霉、青霉2－5天马铃薯琼脂培养物（教师准备）。
（2）在载玻片上加一端乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的溶液中，用解剖针小心将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
2、染色装片观察
在低倍镜下（必要时换高倍镜）观察根霉、毛霉、曲霉、青霉的染色装片。
五、实验报告
绘图说明四种霉菌的形态特征。
实验六酵母菌形态观察及死活细胞鉴别（2学时）
一、实验目的
1、了解酵母菌的形态和无性繁殖方式
2、掌握活细胞染色观察微生物的方法
二、实验内容
1、酵母菌的活细胞染色
2、压滴法观察统计酵母菌的死亡率
三、原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，大多数酵母以出芽方式行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。美蓝是一种无毒性的染料，其氧化型呈蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，因细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，故可通过美蓝染色来鉴别酵母菌是死细胞还是活细胞。
四、操作
1、在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环取少许少量酵母菌苔放在溶液中，混合均匀。
注意取液不要过多或过少，防止溢出或产生气泡。
2、用镊子取一块盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后慢慢放下使其盖在菌液上。
注意不能平着放下，以免产生气泡，如菌液太多，可用滤纸吸去多余菌液。
3、将制片放置约3分钟后镜检，遵循先低倍镜而后高倍镜的顺序观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区分死活细胞。
依据下式计算死亡率（一个视野）：
死亡率（％）＝死细胞数/细胞总数×100
芽出率（％）＝出芽细胞数/细胞总数×100 （不作统计）
◆肝糖拉观察：
将一滴碘液置于载玻片中央，挑少许酵母菌苔，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的肝糖粒呈深红色。
注意须在营养丰富培养基上培养的酵母，在光镜下观察到的是一片红色。
五、实验报告
1、绘制所观察到的酵母菌形态图
实验七、微生物大小测定（3学时）
一、实验目的
掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法
二、微生物大小测定原理
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm 长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，
由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
三、实验内容
1、目镜测微尺的标定
2、酵母菌的测定
四、操作
1、目镜测微尺安装
将目镜测微尺刻度朝下放在镜筒内隔板上，旋上目镜透镜，插入镜筒内（已装）。
2、镜台测微尺刻度面（数字）朝上，置于载物台上。
3、校正
先用低倍镜观察，调节焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推进器，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合刻度线之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。然后由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。
目镜测微尺每格长度（μm）＝两重合线间镜台测微尺格数×10
两重合线间目镜测微尺格数
将目镜测微尺标定结果填入后面表格（1）中。
注意：（1）镜台测微尺有刻度一面须朝上放置，如放反无法对焦。
（2）视野必须暗些，否则难找到镜台测微尺的刻度线。
（3）换高倍镜和油镜时要小心，防止与镜台测微尺碰撞损坏镜头。
4、菌体大小测定
（1）水浸片的制做
（2）酵母菌的测量（长径×短径）
（3）要测定10个细胞并且在读数时估读半个格。
将镜台测微尺和菌体测定结果填入相应的表格中。
五、实验报告
1、目镜测微尺的校正结果；
2、菌体的测量结果；
3、回答P51思考题（1）、（2）。
实验八、微生物数量测定（3学时）
一、原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中格（中格用三线隔开），而每个中格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中格（中格之间用双线分开），而每个中格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
细胞数/ml ＝80小格内的细胞数/80×400×1000×10×菌液稀释倍数。
二、操作
1、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，由盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，勿使气泡产生，
4．静置约5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度，否则不易看清计数室方格线。
5．计数室由25个中格组成，除了要数四个角上中格内的菌数外，还需数中央l个中格的菌数（即80个小格）。如菌体位于方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6．每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。7．计数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
三、实验报告
1、报告计数结果
2、回答P56思考题（1）。
实验九培养基的制备及消毒灭菌（4学时）
一、实验目的
学习掌握微生物培养基的配制方法，学习掌握各种灭菌操作技术。
二、实验内容
1、LB培养基的配制及灭菌
2、基本培养基的配制及灭菌
3、玻璃器皿的包扎及灭菌
三、操作步骤
（一）培养基配制
1、液体LB培养基P246
（1）50mL×2瓶/组（使用150mL三角瓶中），封口膜封口，包扎。
（2）5mL×1支/组试管
2、LB固体平板×2个/组
3、基本培养基（P116）
（1）液体基本培养基
50mL×1个/组三角瓶（洗涤用）
50mL×1个/组三角瓶（含氨苄青霉素40～60μg/mL）（事先配制0.1%氨苄青霉素溶液，灭菌后冷至50℃左右加入）
（2）基本培养基固体平板×2个/组
（二）其它试剂配制
1、PB缓冲液（P120）200 mL/组（分装三角瓶）
2、20种氨基酸混合液5 mL/组（试管）
3、内装9mL无菌水试管×4支/组（稀释备用）
（三）玻璃器皿的包扎
1、1mL移液管×4支/组（稀释用）
2、5mL移液管×2支/组
3、2mL移液管×1支/组
4、0.2mL移液管×30支
5、玻璃棒×1支/组
6、培养皿×10个
7、50mL×1个/组离心管（套管和盖子分别）包扎
8、5mL×1个/组离心管（套管和盖子分别）包扎
9、磁力搅拌转子（单独包扎）
10、玻璃涂棒、镊子若干把
11、枪头
（四）灭菌
1、干热灭菌
2、高压蒸汽灭菌
注：一组配制液体LB培养基；二组配制固体LB培养基；三组配制液体基本培养基；四组配制固体基本培养基；五组配制PB缓冲液；六组玻璃器皿的包扎。
实验十大肠杆菌营养缺陷型的筛选
一、实验目的
了解微生物诱变育种的基本方法，重点掌握紫外线在诱变中的应用以及营养缺陷型的诱变、浓缩、分离筛选与鉴定的方法。
二、实验材料
大肠杆菌（E.coli）斜面菌种。
细菌基本培养基、LB培养基（固体和液体）、PB缓冲液（pH7.0）、氨苄青霉素、氨基酸混合液。
台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯（30W）等。
三、实验步骤
（一）细菌悬液的制备
取一环大肠杆菌（E.coli）斜面菌种接入装有5mLLB液体培养基的试管中，37℃，200r/min培养12-16h,(观察生长情况酌情延长时间)（4℃
保存）。
摇匀，取上面培养液0.5mL，接入含有50mLLB液体培养基的三角瓶中，37℃，200r/min培养2-4h，将培养液转移到离心管中，（用三角瓶
中剩余的残液进行细胞计数），盖上离心机盖子，平衡（称重）后离心
（3000r/min,10min），弃上清液，菌体用约20mL PB洗涤，离心，弃上
清液，再用一定量的PB悬浮细胞，使细胞浓度控制在107-108/mL。
注：洗涤前的细胞数量除以107-108/mL即得稀释倍数。
（二）诱变处理（红灯下操作）
在超净工作台下用5mL无菌吸管取上述悬浮液5mL于直径6cm培养皿中，用镊子放入搅拌子，将培养皿放在磁力搅拌器上，在搅拌状态下
（勿打开搅拌器加热旋钮）接受紫外线照射9min，照射完毕立即离心，
弃上清液，注入2mL PB缓冲液，用玻棒搅动悬浮细胞，黑塑料袋包裹避
光4℃保存（也可直接进行下面操作而不保存）。
（三）营养缺陷型的浓缩
将上述处理过的细菌悬液接入(直接倒入)50mLLB液体培养基中，37℃，200r/min避光培养2-4h（观察生长情况，可以酌情延长），离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，然后用4mL基本培养基悬浮细胞（4℃保存）。
用无菌吸管取2mL细胞悬液接入50mL（内含氨苄青霉素）基本培养基中，37℃，200r/min培养3-4h（4℃保存）。
计数，离心（操作同前），用PB洗涤一次，再用一定量的PB制成细胞悬液（使细胞浓度控制在102个/mL），吸取0.2mL，涂布LB固体平板，静置片刻后37℃，倒置培养12-16h（4℃保存）。
（四）营养缺陷型的挑选和鉴定
吸取0.2mL 氨基酸混合液到固体基本培养基平板上，用玻棒涂平制成含20种氨基酸基本培养基。
将LB平板上形成的每个菌落用用接种针分别点种在基本培养基和含氨基酸基本培养基上（次序位置不可混淆，每点种一个菌落接种针须灭菌一次），37℃培养12—16h。在基本培养基上不生长而在含氨基酸基本培养基相应位置生长的菌落即可确定为氨基酸营养缺陷型。
四、注意事项
1、操作的各环节要无菌操作。
2、培养箱及离心机等仪器设备用后如实填写使用记录。
实验十一乳酸发酵及成品中乳酸菌的检测（6学时）
一、实验目的
了解发酵的一般原理，学习酸奶制作，掌握活菌计数方法，并对酸奶中微生物进行检测
二、实验原理
酸奶是以脱脂乳粉或牛奶为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。奶中的乳糖经乳酸菌发酵产生乳酸使得pH下降，当pH下降到4.7以下时，牛奶中的酪蛋白发生凝固而使奶液成凝乳状态（牛奶中含蛋白质大约为3％，酪蛋白占其总量的85％，等电点是4.7）在发酵过程中还产生一些风味物质，如乙醛、二乙酰等，这些风味物质与加入的蔗糖共同构成酸甜可口，具有独特口味的酸奶。
酸奶按照凝固状态分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶。
三、实验内容
1、酸奶制作
2、酸奶中乳酸菌的检测
四、实验步骤
（一）酸奶制作
1、培养基制备
取6000 ml鲜牛奶，加入蔗糖使成浓度6％，在85℃下灭菌10min，冷却至42℃。
2、接种倒入市售酸奶600 ml，接种量10％。
3、分装灭菌后奶瓶，每瓶装量约200ml，封口，橡皮筋捆扎。
4、发酵前发酵，42－43℃，3－6h，凝乳后转入后发酵。2－5℃，12－24h。
5、品尝鉴定
从凝乳情况、口感、香味和异味等方面给予评价。
（二）乳酸菌检测
1、改良MC培养基制备
蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，1%中性红溶液5mL。
将上述7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加入中性红溶液。分装6个三角瓶，121℃灭菌20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃备用。
2、其它所需物品
培养皿5个/组
移液管1mL12支＋3支/组，
装无菌水9mL试管，1支/组，
装无菌水9mL试管，9支/3组。
含225mL无菌水的三角瓶一个，分装，灭菌。
不锈钢样杓一个，包扎灭菌。
3、操作步骤
（1）熔化培养基，50℃保温备用。
（2）无菌操作称取25g样品放入含225mL无菌水的三角瓶中制成10－1菌悬液（全班做一个）。
（3）用1mL灭菌吸管吸取上述菌悬液沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水试管中，（注意管尖不要接触管内液体），摇匀（以后每次稀释都要注意），制成10－2菌悬液；
（4）另取一支1mL灭菌吸管吸取10－2菌悬液，按上述操作次序，作10倍递增稀释液，每次换用一支吸管。如此反复，制成10－4菌悬液，
（3）和（4）每两个小组做一个。
（5）稀释倒平板（以小组为单位）
分别吸取10－3和10－4两个稀释度的菌悬液1mL注入培养皿中，然后将冷至50℃的培养基倒入约15mL，转动培养皿混匀，每个梯度做两个平皿，另外一个培养皿用无菌水作对照。待琼脂凝固后倒置培养。
（6）培养温度36℃,72h取出，菌落计数。
4、结果计算
假如10－3的平板菌落数为30个，则1g酸奶中乳酸菌的数量为：
30×103＝3×104个/g
实验十二产淀粉酶菌株的分离（6学时）
一、实验目的
学习掌握微生物分离技术，锻炼学生综合运用微生物实验知识的能力。
二、实验原理
土壤中分布着能产淀粉酶的芽孢杆菌，通过土壤悬液的稀释、加热土壤悬液，杀死非芽孢细菌、平板分离可获得细菌的单菌落，经革兰氏染色、芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌。
将单菌落点接在淀粉平板上，能产淀粉酶的芽孢杆菌水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，滴加碘液，在淀粉平板菌落周围出现无色水解圈，不产淀粉酶的菌株其菌落周围未水解的淀粉遇碘呈蓝色。
三、实验材料
1、淀粉培养基（自配）
2、革兰氏染色液
3、芽孢染色液
四、实验方法（提示）
1、土壤悬液制备。采集土样，用10倍稀释法稀释，选择合适稀释度，加热处理稀释液以杀死无芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。
2、用涂布平板法分离单菌落。37℃培养24－48小时，挑取表面干燥、粗糙、不透明、污白色或微带黄色的菌落。
3、鉴定。通过芽孢染色判断菌落是否为芽孢杆菌。从已判断为芽孢杆菌的菌落处，分别点接淀粉平板，培养，卢戈氏碘液检测菌落周围出现的水解圈。
五、实验要求
1、以实验小组为单位，查阅相关资料，参考提供的方法，在下周实验课提交电子版的设计实验方案（要细化每一操作步骤）并作陈述。实验方案的可行性及合理性评分。（占此次总成绩30%）。
2、筛选出1～2株产淀粉酶的芽孢杆菌。（占此次总成绩40%）。
3、实验报告以小组为单位撰写，格式符合设计性实验报告的要求。（占此次总成绩30%）。
实验十三环境微生物的分离纯化（6学时）
一、实验目的
1、学会微生物培养基的配制方法
2、学习并掌握各种无菌操作技术
3、学会从菌落及培养特征区分细菌、放线菌和霉菌
二、实验原理
制药工程专业微生物实验讲义
实验1: 显微镜的使用及细菌形态的观察（2学时） 目的要求 (1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 (2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 1.基本原理 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示： NA＝n·sinα 式中 NA=数值孔径； n=介质折射率； α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则： 以空气为介质时： NA=1×0．87=0．87 以水为介质时： NA=1．33×0．87=1．15 以香柏油为介质时： NA=1．52×0．87=1．32 显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。 式中λ=光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。 2.材料及器材 显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、各种细菌微生物制片标本、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等。
大学微生物实验复习题
2014微生物实验复习题 一、名词解释： 菌苔：如果把大量分散的纯种细胞密集地接种在固体培养基的较大表面上，结果长出的大量“菌落”已相互连成一片，这就是“菌苔”。 菌落：将单个细菌（或其他微生物）细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面（有时为内层），当它占有一定的发展空间处于适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆，此即菌落。 芽孢：是一些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，壁厚、透性低、不易着色。 荚膜：是一些细菌细胞外的一层胶状粘液物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料亲和力低。 细菌：细菌是单细胞原核微生物，基本形态为球状、杆状、螺旋状。 天然培养基：是指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。例如：牛肉膏蛋白胨、麦芽汁培养基。 合成培养基：组合培养基又称合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。例如：高氏一号培养基。 半组合培养基：又称半合成培养基，指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如：马铃薯蔗糖培养基。 液体培养基：一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模地培养微生物。 固体培养基：一类外观呈固体状态的培养基。根据固态的性质又可分为：固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基和滤膜。 半固体培养基：是指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态培养基。例如：“稀琼脂”。
二、理论书内容： 1、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌各菌落的比较。 菌落特征微生物类别 单细胞微生物菌丝状微生物 细菌酵母菌放线菌霉菌 主要特征菌 落 含水状态很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥 外观形态 小而凸起或大而平 坦 大而凸起小而紧密 大而疏松或大而 致密 细 胞 相互关系 单个分散或有一定 排列方式 单个分散或假丝状丝状交织丝状交织形态特征 小而均匀，个别有 芽孢 大而分化细而分化粗而分化 参考特征 菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明 菌落与培养基结 合程度 不结合不结合牢固结合较牢固结合菌落颜色多样 单调，一般呈乳脂 或矿烛色，少数红 色或黑色 十分多样十分多样 菌落正反面 颜色的差异 相同相同一般不同一般不同菌落边缘一般看不到细胞 可见球状，卵圆状 或假丝状细胞 有时可见丝状细胞可见粗丝状细胞 细胞生长速度一般很快较快慢一般较快气味一般有臭味多带酒香味常有泥腥味往往有霉味
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
2012基础生物学实验考试--微生物学复习资料
一．名词解释 1．微生物的纯培养物：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。 2．菌落：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见的、有一定形态的子细胞生长群体。 3. 灭菌：是指物体中包括芽孢在内的所有微生物都被杀死或消除。 4. 消毒：杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的措施，消毒可起到防止感 染或传播的作用。 5.无菌技术：在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或 其自身污染环境的技术。 6. 鉴别培养基：在培养基中加入能与特定微生物的代谢产物发生特征性化学反 应的化学物质，用于鉴别不同类型微生物。 7. 选择培养基：根据不同微生物的营养需求或对某种化学物质敏感性不同，在 培养基中加入相应营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长， 将所需微生物从复杂的微生物群体中选择分离出来。 8. 基础培养基：含有一般微生物生长所需基本营养物质的培养基。 9. 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称为化学限 定培养基。 10. 平板划线法：用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量 随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。保温培养后，在固体培养 基表面得到生长分离的微生物菌落。 11. 稀释倒平板法：将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培 养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的 微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。 12．平板菌落计数法：将适当稀释的样品涂布于琼脂培养基表面，培养后活细胞能形成菌落，通过计算菌落数能知道样品中的活菌数，该方法称为平 板计数或菌落计数。 二．填空题（每空1分，共20分） 1. 用培养平板进行微生物纯培养分离的方法包括：、、。
微生物学实验讲义
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
微生物学实验报告
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
水处理微生物学实验讲义
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
微生物实验复习题
兽医微生物学实验复习题 1、兽医微生物实验室注意事项是什么？ 答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序 2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？ 答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。 3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？ 答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂， 4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？ 答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。 5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？ 答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。 6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？ 答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止 注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢 2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜 7、微生物绘图要求有哪些？ 答：①绘出一个视野，圆形。 ②细菌大小比例合理，必须标明名称。 ③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。 ④绘图一律用铅笔。 8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？ 答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。 9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。 注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。固定方法：火焰固定和化学固定。 10、细菌染色的原理是什么？ 答：细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 11、试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。革兰氏染色的原理是什么？ 答：原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈蓝紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
微生物学实验讲义
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
最新工业微生物学实验考卷A0708答案
工业微生物学实验考卷A0708答案
一、填空题（共30分，其中8和11小题每空1分，其余每空0.5 分） 1. 显微镜物镜的放大倍数可由外形来辨别，镜头长度越短，口径越大，放大倍数越低。物镜的放大倍数都标在镜头上，常用的低倍镜为_ 10 ×、20×；高倍镜为 40 ×、45×；油镜为90×、 100 ×。若20×的目镜与45×的物镜配合使用，显微镜的总放大倍数为900倍，一般用 45×20 表示。 2. 新玻璃器皿含有游离碱，一般先将其浸于 2%盐酸溶液中浸泡数小时，然后用自来水清洗干净；用过的培养皿或试管若含有废弃 培养基或菌体，需先经高压蒸气灭菌或沸水煮沸后，倒掉污 物，方可清洗。 3. 微生物培养基的分类方法和种类很多，如按培养基中凝固剂含量的多少可分为固体、半固体和液体培养基；按照 培养基的原料来源可分为合成、半合成和天然 培养基，如PDA培养基根据其原料来源属于其中的半合成培养基。 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢8
4. 固体培养基的配制过程可简单描述为：配料（称量）→溶解→校正pH→加凝固剂→融化→分装→加棉塞、包扎→灭菌→无菌检查，其中最后一步非常关键，可检测培养基的是否可用。 5．培养基的灭菌一般多采用高压蒸气灭菌，灭菌压力为0.1Mpa，即 121 ℃，时间20 min，若培养基中含糖成分的含量较高，一般多采用过滤除菌或减压灭菌，减压灭菌时温度为 115 ℃。 6．对不同的微生物进行斜面接种时，常根据需要采用不同的接种方法，如细菌和放线菌多采用密波状蜿蜒划线，酵母菌多采用中央划线法，用来观察菌种的形态和培养特征；霉菌多用点接法。 7．利用显微镜观察不同的微生物常采用不同的制片方法，如细菌需经过固定和染色后利用油镜（物镜）观察；酵母菌需制备水浸片，不需要染色，高倍镜下观察；霉菌制片时需要乳酸苯酚油作为一种介质，防止菌丝成团影响观察；另外，在观察假丝酵母和青霉菌时，需对菌体作小室培养以便观察到完整的菌体形态。 8．微生物学中可根据细菌的生理生化实验结果对未知菌进行鉴定，如利用MR实验和V-P实验可检测微生物利用葡萄糖产酸能力；明胶液化实验可检测细菌是否产蛋白酶；硝酸盐还原实验可检测细菌 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢8
口腔微生物实验讲义
口腔微生物学实验指导 （2005年） 前言 口腔微生物学实验课是本课程学习过程中的重要环节。其目的在于加深和巩固对理论知识的理解和体会；掌握和熟悉口腔微生物学研究技术和方法，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，为今后工作打下良好基础。 一、标本的采集与运送 口腔是人体与外界相通的器官，存在多种微生物群。从口腔中可分离培养到各种需氧、微需氧或厌氧、兼性厌氧的细菌。口腔微生物的分离培养是确定各种细菌最常用的方法。（一）口腔标本取材与运送原则 口腔微生物培养检查的临床标本主要有唾液、龈沟液、龈上菌斑、龈下菌斑，感染根管组织，牙槽脓肿的脓液，颌面间隙感染的脓液或分泌物等。 以上标本的采集应根据其培养目的来确定采集方法及注意事项。需氧菌采用棉拭子法，厌氧菌采用厌氧采集技术，尽量减少标本与空气的接触及培养物的放置时间，以提高厌氧菌的检出率。在采取标本中必须无菌操作。 口腔临床标本的微生物学检查，大多数与厌氧菌有关，在标本采集后，要求立即用厌氧方式运送到培养箱中孵育。脓液或唾液标本可直接用注射器针筒运送，大多数标本均应加入具厌氧条件的还原转送液运送到实验室。减少氧敏感细菌在运送过程中死亡，保证厌氧菌的检出。 （二）几种常见标本的采集方法 1.唾液： 最佳采集时间为晨间起床后，刷牙洗漱前或两餐之间。（10：00 am或4：00pm）。在采集标本前令受检者用温开水清漱口中的食物残渣，然后自然排出唾液于无菌容器中，至少采集0.5—1ml。然后塞好管口，立即送检。 2.牙菌斑： 按菌斑的位置可分为龈上菌斑和龈下菌斑两大类。龈上菌斑指牙颈部龈缘以上牙面的牙菌斑，龈下菌斑指牙龈缘内侧被牙龈所覆盖牙面上的菌斑。 （1）龈上菌斑的采集： 适用于牙龈炎和早期牙周炎的细菌分离。受检者用温开水漱口后，用菌斑指示剂显示出龈上菌斑，然后在无菌纱球局部隔湿的情况下，用无菌匙形器采集，转至有还原转移液的无菌试管中送检。 （2）龈下菌斑的采集： ①取菌器采集：有带充气导管的采集器（见图1）及Moore 00取菌器。受检者经温开水漱 口后，用取菌器采集，放入有还原转送液的无菌试管中送检。 ②灭菌纸尖采集法：温开水漱口，刮除龈上菌斑，采集部位用纱球隔湿，用无菌镊子将灭 菌滤纸尖直接插入龈沟或牙周袋内（见图2），放置数秒后取出放入还原转送液，加盖后尽快送检。该法较简便，但易被唾液污染。 ③匙形洁牙器采集：温开水漱口后，用菌斑指示剂显示菌斑，并除去龈上菌斑。在隔湿条 件下，将无菌匙形洁牙器伸入龈沟或牙周袋内，刮取龈下菌斑，然后将菌斑置入盛有小玻璃珠和还原转送液的无菌管中，加盖液体石蜡后立即送检。该方法简捷方便，但不易
微生物实验复习
微生物实验复习 1.微生物实验室的注意事项是什么? 答:防止病原微生物的散布，防火，节约，标记，记录，安全，清洁与秩序。 2.观察常用什么显微镜?它主要有哪几部分组成? 答:观察细菌常用普通光学显微镜(油镜)。它主要有光学部分和机械部分组成，光学部分由目镜、物镜、反光镜和聚光器组成:机械部分由镜座、镜筒、镜臂、转换器，镜台、粗细调节器。 3.使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种? 答:加拿大树胶、二甲苯、石蜡、松柏油、甘油、水、香油 4.观察细菌时显微镜的操作步骤是什么?注意事项是什么? 答:操作步骤:放置好显微镜;调节好光源;低倍镜观察，高倍镜观察，油镜观察;清洁显微镜;还原显微镜。 注意事项: 5.制备细菌染色标本片时应注意哪些事项? 答:1)接种环要充分灭菌，避免带入新的细菌 2)加蒸馏水时，应用接种环取少量蒸馏水于载玻片上，否则自然干燥的时间会 过长。 3)钓菌时，试管口要在酒精灯附近，避免新的细菌进入菌种内 4)火焰固定时，热干燥的时间不宜过长，以不烫手为度 5)水洗时，先用蒸馏水冲洗平放的玻片，再冲斜放着的玻片 6)制片完成后，要待玻片完全干燥后才能油镜进行镜检 6.图片固定的意义何在?固定时应注意什么问题? 答:意义:a。除去抹片的水分，涂抹材料能很好的贴附在玻片，上，以免水洗时易被冲掉b.使抹片易于着色或更好的着色，因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强c.可杀死抹片中的微生物 固定时注意事项:1)火焰固定时只略作加热进行固定，但不能太热，以不烫手为度，同时加热时间和加热温度也应控制好，以保持细胞形态结构的完整性。2)化学固定时，若作姬姆萨染色就不用火焰固定，而用甲醇固定。 7.细菌染色的原理是什么? 答:细菌的等电点较低，约在pH2-5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易于带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 8.试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。 答:1)加草酸铵结晶紫染色液1-2min，水洗;2)加革兰氏稀碘液1-3min,水洗;3)加95%酒精脱色0.5min，水洗;4)10倍稀释石碳酸复红液复染10-30s，水洗5)结果：蓝紫色:革兰氏阳性菌；红色:革兰氏阴性菌 9.试述培养基制备的原则和要求。 答:原则: 要求:1)培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质;2)培养基的材料和装培养基的容器应没有抑制细菌生长的物质;3)培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求;4)所制培养基应该透明;5)培养基必须彻底灭菌，不得含有任何活的细菌。 10.试述普通肉汤培养基的制备方法及期途。 答:成分:牛肉膏3-5g;蛋白胨10g;氯化钠5g;水1000mL; 用途:1)用作细菌的液体培养;2)检查细菌的发育状况，以及形成的沉淀物、菌膜、
微生物学实验复习提纲教案资料
微生物学实验复习提纲 1.研究微生物学的基本技术有哪些（显微镜技术、无菌技术、纯种分离技术和纯种培养技术） 2.细菌培养基的配制过程？ 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面 3.制造接种环、接种针的金属常用铂或镍,原因是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却. 4.灭菌吸管的包装的注意事项：（1）吸管必须干燥;(2)在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm 长的棉花（不能用脱脂棉）。作用是避免外界及口中杂菌吸入管内，并防止菌液等吸入口中。 5.空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌。则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。 6.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。 7.酵母的死细胞和活细胞可通过哪些方式鉴别？ 答：1.、用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，死细胞为蓝色2、平板菌落计数法 8.细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物的菌落各有何特点？ 答：细菌：湿润、光滑、透明、粘稠、易挑起、质地均匀、菌落各部位的颜色一致等。 放线菌：质地致密、丝绒状或有皱折、干燥，不透明，上覆盖有不同颜色的干粉（孢子），菌落正反面的颜色常不一致，基内菌丝与培养基结合较紧，难以挑起。 酵母菌：菌落与细菌的相仿，比细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润、粘稠、易被挑起，其颜色多为乳白色，少数为红色。同时会散发出悦人的酒香味。 霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致等。 9.培养基按化学成分、物理状态、用途划分可分为哪几种类型？ 答：化学成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基物理状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基用途：基础培养基、鉴别培养基、选择培养基 10.实验常用的凝固剂是哪一种？固体培养基、半固体培养基及液体培养基加凝固剂琼脂的量为多少？琼脂在什么温度下溶化？什么温度下凝固？ 答：常用凝固剂是琼脂，分别为1—2%，0.5% 96°C下融化，40°C凝固 11.配制培养基时应遵循哪些原则？配制培养基的一般方法和步骤是什么？配制培养基时不可用铜锅或铁锅，原因是什么？调pH一般用什么试剂调？配制pH低的琼脂培养基时，应怎样配制？ 答：原则：目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约方法：生态模拟、参阅文献、精心设计、试验比较 用磷酸缓冲液和碳酸钙做调节剂 12.培养基分装时，液体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？固体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？半固体分装高度以试管的多少为宜？ 答：液体：试管高度的1\4,三角瓶的试管高度的1\2,固体：试管高度的1\5，三角瓶的1\2，半固体：试管高度的1\3 13.培养基灭菌时外用牛皮纸包扎的目的是什么？ 答：防止灭菌时冷凝水润湿棉塞 14.摆斜面的正确方法是什么？ 答：试管口搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 15.棉塞的作用是什么？正确的棉塞要求是什么？棉塞的长度多少在管口外，多少在管内为
工业微生物学实验试卷A0809答案
2008-2009学年第 一学期本科试卷 课程名称:工业微生物学实验(A) 答案 第 1 页 （共 8 页） 学 院: 专 业: 学号: 姓名: ―――――――――――――装――――――――――――订――――――――――――线―――――――――――――― 题号 一 二 三 四 五 六 七 八 总成绩 得分 得分 一、名词解释（共20分，每小题4分） 1. 无菌操作：培养基经灭菌后，用经过灭菌的接种工具在无菌条件下接种含菌材料于培养基上，这一操作称为无菌操作。 2. 培养基：是人工配制的能满足微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。 3. 假菌丝: 酵母生长旺盛时，出芽形成的芽细胞尚未脱离母细胞又长出了新芽，容易形成成串的细胞。如果各细胞之间连接处面积小于细胞直径，形成的这种藕节状的细胞串称为假菌丝。 4. 大肠菌群: 大肠菌群系指一群在37℃、24h 能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 5. 细菌菌落总数: 指被检样品通过一定的处理方法，培养一段时间后，每毫升或每毫克样品中所含细菌的菌落数。由于经过适当稀释的样品中每个细胞可形成一个单菌落，所以菌落数即是细菌活菌总数。 得分 二、判断题（共10分，每题1分） 1．无菌吸管上端塞入棉花的主要目的是为了防止菌液吸入口中（ A ）。 A.错 B.对
年级：06级专业：生物工程（本科）课程号：S040101046 2．稀释平板计数时，细菌，放线菌，真菌的计数标准是选择每皿中菌落数在30-300个的稀释度进行计数（ A ）。 A.错 B.对 3．为了满足微生物对微量元素的需要，配制培养基所用的水最好使用自来水（ B）。 A.错 B.对 4．实验室通常使用血球计数板测酵母菌的总菌数或霉菌的孢子数（ B ）。 A.错 B.对 5．浸油的油镜镜头可用软的卫生纸擦净（ A ）。 A.错 B.对 6．稀释平板计数通常采用的是二倍稀释法（ A ）。 A.错 B.对 7．使用手提灭菌锅灭菌后，为了尽快排除锅内蒸汽，可直接打开排气阀排气（ A ）。 A.错 B.对 8．镜台测微尺每小格的实际长度是10微米（ B ）。 A.错 B.对 9．用血球计数板计数时，任数5个大方格(80个小格)的菌数即可（ A ）。 A.错 B.对 10．测微生物的细胞大小时，需要校正的是镜台测微尺每格的实际长度（ A ）。 A.错 B.对 15分，每空0.5分） 1. 检查乳品和饮料是否含有大肠杆菌(E.coli)等肠道细菌，可采用___伊红美兰 ____培养基，在这种培养基平板上___能分解乳糖产酸的菌_（大肠菌群）_____会形成具有___金属_______光泽的紫黑色小菌落。 第 2 页（共8 页）
(整理)工业微生物育种复习资料.
第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素；提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一 6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重
组 接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、突变型的种类：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。 第四章工业微生物诱变育种 一、物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行 1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。紫外诱变照射后在冰
微生物学教程-周德庆第三版-期末复习资料
微生物学教程-周德庆第三版-期末复习资料
1.曲颈瓶实验巴斯德否认了自然发生学说 2.微生物发展的五个时期：史前期（朦胧阶段）；初创期（形态描述阶段），列文虎克---微生物的先驱者；奠基期（生理水平研究阶段），巴斯德---微生物学奠基人（显微镜的发现），科赫--细菌学奠基人；发展期（生化水平研究阶段）布赫纳---生物化学奠基人；成熟期(分子生物学水平研究阶段) 3.巴斯德的成果：①彻底否定了自然发生说②证实发酵由微生物引起③发明了狂犬病毒减毒疫④苗制备方法⑤发明巴氏消毒法 4.微生物有哪五大共性？其中最基本的是哪一个？为什么？①.体积小，面积大；②.吸收多，转化快；③.生长旺，繁殖快；④.适应强，易变异；⑤.分布广，种类多。其中，体积小面积大最基本，因为一个小体积大面积系统，必然有一个巨大的营养物质吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的交换面，并由此而产生其余 4 个共性 5.细菌的三个形态杆菌，球菌，螺旋菌 6.细菌的一般构造：细胞壁，细胞膜，细胞质，核区。特殊构造：鞭毛，菌毛，性菌毛，糖被（微荚膜，荚膜），芽孢 7.细菌的细胞壁的功能：①固定细胞外形和提高机械强度，保护细胞免受外力的损伤；②为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需；③阻拦酶蛋白或抗生素等有害物质进入细胞；④赋予细菌特有的抗原性和致病性(如内毒素)，并与细菌对抗生素和噬菌体的敏感性密切相关。 8.肽聚糖由肽和聚糖，肽聚糖单体构成，①、四肽尾，由四个氨基酸分子按L 型与D型交替方式连接而成，接在N-乙酰胞壁酸上。②、双糖单位：N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键连接，溶菌酶水解此键。③、肽桥：甘氨酸五肽，肽桥变化甚多，由此形成了“肽聚糖的多样性”） 9.磷壁酸是革兰氏阳性菌的特有成分，（主要成分是甘油磷酸或核糖醇磷酸），是噬菌体的特异性吸附受体； 10.外膜是革兰氏阴性菌的特有结构（位于壁的最外层，成分：脂多糖LPS（类脂A：是革兰氏阴性菌致病物质内毒素的物质基础，是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体；核心多糖；O-特异侧链）；磷脂和若干外膜蛋 11.假肽聚糖的β-1,3-糖苷键被水解。 12.缺壁细胞：实验室中形成：自发缺壁突变：L型细菌 人工方法去壁：彻底除尽（原生质体） 部分去除（球状体） 自然界长期进化中形成：支原体 13.试述革兰氏染色的机制 程序染液 G+ G- 初染结晶紫紫色紫色 媒染碘液蓝紫色蓝紫色 脱色乙醇95% 蓝紫色无色 水洗 H2O 蓝紫色无色 复染番红蓝紫色红色 14.PHB：聚羟基丁酸酯，细胞内含物之一，具有贮藏能量，碳源及降低细胞内渗透压作用。 15.鞭毛分为L环，P环，S-M环，C环。 16.何谓“拴菌”试验？他的创新思维在何处？