美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆_表达及变应原活性测定
1964年Bernton 等［1］首次报道蟑螂是引起Ⅰ型变
态反应的一种重要昆虫变应原。此后，国内外研究者对蟑螂与变态反应性疾病(如过敏性哮喘等)的关系作了较深入的研究，认为蟑螂是仅次于屋尘和尘螨变
文章编号：1000-7423（2008）-05-0356-05
【论著】
美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达
及变应原活性测定
陈家杰1，夏立新1，刘志刚1*，刘雯2，吉坤美1
【摘要】
目的
克隆美洲大蠊（Periplaneta americana ）精氨酸激酶(arginine kinase ，AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK 。
方法
提取美洲大蠊总RNA ，设计特异引物，通过RT -PCR 克隆美洲大蠊AK 基因目的片段，
测序后将该片段克隆入原核表达载体pET -28a ，转化至大肠埃希菌（E.coli ）BL21（DE3），经异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG ）诱导表达，获重组AK 。用镍离子（Ni 2+）亲和层析柱纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -
PAGE ）分析重组AK 表达情况。用蛋白质印迹分析（Western blotting ）（变性条件）和ELISA （非变性条件）检测重组AK 变
应原与过敏患者血清IgE 结合活性，并以健康人血清为对照。
结果
测序结果表明，AK 基因含有1068bp 的开放阅
读框，编码356个氨基酸（登录号为EU429466）。与GenBank 公布的序列（登录号为AY563004）比较同源性达99.9%。
SDS -PAGE 分析表明,该变应原基因在E.coli 中主要以可溶形式高水平表达，相对分子质量约为M r 45000。重组变
应原AK 在变性与非变性条件下，与过敏患者血清IgE 均具有良好的结合活性，与健康人对照组之间的差异具有统计学意义（P ＜0.05）。
结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。
【关键词】
美洲大蠊；精氨酸激酶；基因表达；变应原活性
中图分类号：R757
文献标识码：A
Cloning ，Expression and Purification of Allergen Arginine Kinase from
Periplaneta americana and its Allergic Activity
CHEN Jia -jie 1，XIA Li -xin 1，LIU Zhi -gang 1*，LIU Wen 2，JI Kun -mei 1
(1Allergy and Immunology Institute ，Shenzhen University ，Shenzhen 518060，China ；2College of Life
Sciences ，Shenzhen University ，Shenzhen 518060，China)
【Abstract 】
Objective To clone the gene of arginine kinase （AK ）from Periplaneta americana ，produce its recombi -nant protein and investigate its allergenicity.
Method
The cDNA of AK was cloned using specific primers from the total
RNA of P.americana.The cloned gene was inserted into pMD18-T vector and digested by Bam HI and Hin d Ⅲ.The cDNA was sequenced and subcloned into pET -28a expression vector.The cloned AK cDNA gene was expressed in Escherichia coli BL21（DE3）by IPTG induction.
The recombinant AK (rAK)was purified by metal (Ni 2+)chelating affinity chromatography.
Its allergenicity was examined by both Western blotting and enzyme -linked immunosorbent assay (ELISA).
Result
The
cloned cDNA ORF sequence (Accession no.EU429466)contained 1068bp and encoded 365amino acids.Its sequence ho -mology with the published one (Accession no.AY563004)was 99.9%at nucleotide level.The allergen rAK was highly ex -pressed in E.coli BL21(DE3)as a soluble protein mainly with the molecular weight of about M r 45000under induction of IPTG and purified by 6-His -tag purification system.Both in the non -denaturalization and denaturalization conditions ，the
recombinant allergen was identified as its affinity to IgE antibodies from the cockroach -allergic patient sera by Western blotting
and ELISA.
Conclusion
The recombinant cockroach arginine kinase has been obtained with proper allergenicity.
【Key words 】
Periplaneta americana ；Arginine kinase ；Allergen ；Gene expression
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30571625)，and a Guangdong Provincial Science and Technology Fund (No.2003A3080502)
*Corresponding author ，E -mail ：lzg@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html,
基金项目:国家自然科学基金(No.30571625);广东省科技计划重点
专项资助(No.2003A3080502)
作者单位:1深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳518060；
2深圳大学生命科学学院，深圳518060*
通讯作者,E -mail:lzg@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html,
应原的主要室内变应原［1］。过敏体质者吸入蟑螂的分泌物、排泄物及尸体的降解产物等，可引发Ⅰ型变态反应，如鼻炎及哮喘等多种变态反应性疾病［1］。
居家环境中的蟑螂主要以美洲大蠊（Periplaneta americana）和德国小蠊（Blattella germanica）为主。无脊椎动物体内的精氨酸激酶(arginine kinase，AK)可能是一种变应原，国外已经验证虾、蛾等AK具有变应原性［2，3］。Nitat等［4］分离出美洲大蠊AK，并证实该蛋白与25例对美洲大蠊过敏患者血清IgE均有阳性反应，认为AK是美洲大蠊主要变应原之一。
本研究构建重组美洲大蠊AK表达载体，并检测该重组蛋白在变性和非变性条件下的变应原性，以便为研究过敏性疾病的免疫诊断和治疗提供参考。
材料与方法
1材料
1.1美洲大蠊纯培养(存活)美洲大蠊由深圳市疾病预防控制中心提供。无菌水充分洗涤虫体，滤纸吸干水份，用焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液处理过的剪刀剪取虫体组织，称重后分装，液氮中冻存，备用。1.2质粒和菌株载体pMD18-T购于宝生物工程（大连）有限公司，pET-28a(+)购于美国Novagen 公司。大肠埃希菌（E.coli）Top10和BL21（DE3）由本实验室保存。
1.3主要试剂LA-Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ和Hin dⅢ限制性内切酶，T4DNA连接酶和DNA标志物(DL2000)均为宝生物工程（大连）有限公司产品。蛋白质标志物及预染蛋白质标志物为美国Fermentas 公司产品。RNA酶（RNase）和溶菌酶为上海生工生物工程有限公司产品。生物素标记的羊抗人IgE、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)等购自深圳晶美生物工程有限公司。RNA提取试剂盒购于德国Qia-gen公司，cDNA第1链合成逆转录试剂盒（AMV first strand cDNA synthesis kit）购于美国Bio Basic Inc.（BBI）公司，质粒小量提取试剂盒［plasmid mini kit Ⅰ(100)］和琼脂糖凝胶回收试剂盒［gel extraction kit(50)］购于美国OMEGA公司。其他试剂均为进口分析纯。
1.4血清来源美洲大蠊过敏患者血清和健康人血清,取自海南省海口市人民医院，确诊依据患者病史,如哮喘、过敏性鼻炎和过敏性皮炎,以及皮肤针刺试验结果。根据皮肤针刺试验风团块大小判定患者过敏程度。14例患者(9～38岁，女6例、男8例)血清，对蟑螂变应原皮肤针刺试验结果均为‘++’以上。而4个健康人(4～14岁，女1人、男3人)血清，对蟑螂变应原皮肤针刺试验结果均为阴性反应。
2方法
2.1引物根据GenBank提供的美洲大蠊AK的mRNA 序列（登录号为AY563004）设计特异性引物，上游引物为5′-GTCGCGGATCCATGGTGGACGCCGCAGTT C-3′，下游引物为5′-GCGACAAGCTTTAGAGCGAG CTC TCCAGCT-3′。其中分别插入Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位点及保护性碱基。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2.2总RNA提取和RT-PCR扩增目的基因片段取少许备用美洲大蠊组织，于液氮中充分研磨，称取约100mg置于无RNA酶的离心管，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行RT-PCR扩增，获得目的基因片段。即用cDNA第1链合成逆转录试剂盒以总RNA为模板逆转录合成第1链。取2μl合成产物为模板，进行PCR扩增，条件为94℃5min；94℃50s，52℃50s，72℃1min，共31个循环;72℃10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
2.3美洲大蠊AK重组克隆载体pMD18-T-AK的构建将上述PCR产物回收、纯化，与pMD18-T载体连接，构建重组载体pMD18-T-AK。用氯化钙法［5］将连接产物转入E.coli Top10受体菌，克隆载体pMD18-T-AK。通过含氨苄青霉素（Amp）的LB平板进行抗Amp筛选，挑取菌落（含重组质粒）进行PCR扩增验证。取4个阳性菌落克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
2.4美洲大蠊AK重组表达载体pET-28a-AK的构建将上述PCR产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体（连接反应体系为:pMD18-T1μl、DNA3μl、T4DNA 连接酶1μl、T4DNA缓冲液1μl及双蒸水4μl）。用一步法［6］将连接成的重组质粒转化E.coli Top10感受态细胞。转化的E.coli Top10通过含Amp的LB平板进行抗Amp筛选，挑取菌落（含重组质粒）于LB/Amp 液体培养基培养，提取质粒，并用Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切鉴定，送上海生工生物工程有限公司测序。测序后的AK基因片段用Bam HⅠ和Hin dⅢ双酶切亚克隆到pET-28a(+)质粒载体，获得重组表达载体，命名为pET-28a-AK。具体反应条件参照产品说明书。
2.5重组表达载体pET-28a-AK在E.coli BL21（DE3）中诱导表达将重组表达载体pET-28a-AK转化入表达菌E.coli BL21（DE3）中，并从卡那霉素平板上挑取阳性菌落，置20ml LB液体培养基（含卡那霉素终浓度为50μg/ml）的试管中培养，37℃200r/min过夜。第2天接种2次，按1∶50吸取菌液置50ml LB 液体培养基（含卡那霉素同上）的三角瓶中，培养
1～2h。待菌液吸光度（A600值）达0.4～0.6时转入大瓶培养，当A600值达0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG,终浓度为0.1mmol/L）诱导表达4～6h。其中，诱导表达5h，抽样监测表达情况。即：取1ml菌液，4℃离心弃上清，加1ml双蒸水重悬，离心弃上清，重复1次,最后沉淀重悬于50μl双蒸水。取10μl与2倍体积的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液混匀，煮沸10 min,取10μl进行电泳，检测表达情况。同时，分别取菌体进行超声、离心，分别取上清和沉淀进行电泳，判断表达产物的可溶性。
2.6重组AK的分离纯化AK末端连接pET-28a(+)载体上的6个组氨酸，以融合蛋白形式表达。针对6个组氨酸标签，采用镍离子（Ni2+）亲和层析法［6］纯化
AK蛋白。参照美国GE Healthcare Bio-science公司组氨酸标签（His-tag）纯化说明书进行。装好螯合琼脂糖凝胶（chelatingsepharose）柱，按常规螯合镍离子Ni2+，用平衡缓冲液（20mmol/L Tris·HCl，pH7.5）平衡层析柱，加样品、平衡至基线。用40和200mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱峰液。经SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。2.7重组AK变应原活性测定用考马斯亮蓝染色，测定纯化的重组AK的浓度［7］。将纯化的重组AK进行SDS-PAGE，于350mA70min条件下转移到硝酸纤维素膜（NC膜）。取14例对美洲大蠊过敏患者混合血清作为一抗，4名健康人混合血清为阴性对照，参照杨慧等［8］方法进行蛋白质印迹（Western blotting）分析。
通过ELISA测定纯化后的AK蛋白与特异IgE抗体的结合性。每个酶标孔加入不同稀释度的重组AK 蛋白，4℃过夜。用2%小牛血清（BSA）封闭，将对美洲大蠊过敏患者血清（1∶4）作为一抗，同时用健康人血清作为阴性对照。生物素标记的羊抗人IgE抗体（1∶1000）为二抗，37℃孵育2h，再与链霉亲和素标记的HRP进行反应，加过氧化氢(H2O2)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色，用自动酶标仪检测A490值。检测3次，取平均值作图。
3统计学分析
ELISA实验测定3次，平均值以‘x±s’表示。数据用2003Microsoft Excel软件进行方差分析和χ2检验。
结果
1美洲大蠊AK RT-PCR扩增目的基因片段自美洲大蠊提取总RNA为模板，用特异性引物通过RT-PCR扩增的产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约1100bp的条带，大小与理论值相符(图1)。2美洲大蠊AK载体的构建与序列分析
2.1重组克隆载体的构建将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体上，挑取阳性克隆进行Bam HⅠ/Hin dⅢ双酶切鉴定，所得插入片段约为1100bp，与上述RT-PCR扩增产物一致(图2)。
序列分析结果表明，4个阳性菌落克隆测序结果完全一致。美洲大蠊AK cDNA克隆含有长度为1068bp 的开放阅读框，编码356个氨基酸。该序列在GenBank 中登录号为EU429466,与其以往公布的序列（登录号为AY563004）相比，有4个核苷酸区别：第57位、第207位、第488位（T→C）及第506位（C→T）。同源性达99.9%。但其氨基酸的序列未改变。
2.2重组表达载体pET-28a-AK的构建表达载体pET-28a-AK经Bam HⅠ和Hin dⅢ双酶切的电泳结果表明，pET-28a-AK插入的目的基因片段约为1100
M12
2000
1000
750
500
250
100
bp
1100
bp
M：DNA标志物，1、2：美洲大蠊AK。
M：DNA marker，1，2：AK of Periplaneta americana.
图1美洲大蠊AK的RT-PCR产物电泳图
Fig.1RT-PCR products of arginine kinase(AK)
of Periplaneta americana
M12
2000
1000
750
500
250
bp
1100
bp
M：DNA标志物，1、2：pMD18-T-AK/Bam HⅠ+Hin dⅢ。
M：DNA marker，1，2：pMD18-T-AK/Bam HⅠ+Hin dⅢ.
图2美洲大蠊AK克隆载体质粒的Bam HⅠ+Hin dⅢ双酶切鉴定Fig.2Restriction analysis for pMD18-T-AK with
Bam HⅠand Hin dⅢof Periplaneta
americana
bp ，同预期大小一致（图3）。同时再对阳性克隆pET -28a -AK 进行DNA 序列测定，以确保插入的目的
片段准确无误。结果表明所构建的重组质粒的表达产物带有6个组氨酸标签，可用于蛋白质纯化和鉴定。
3重组表达载体pET -28a -AK 的诱导表达与分离纯化重组表达菌经0.1mmol/L IPTG 诱导后，进行
SDS -PAGE ，可见约M r 45000条带。将菌体超声破
碎后，检测结果表明，重组蛋白主要分布于上清，为可溶性高表达。利用融合蛋白上的6个组氨酸标签进行纯化，用200mmol/L 的咪唑进行洗脱，收集洗脱峰液。进行SDS -PAGE ，得到纯化的重组蛋白（图4）。
4重组AK 的变应原活性测定
4.1Western blotting 分析
Western blotting 分析结果
表明，过敏患者血清在约M r 45000处有一明显识别条带，而健康人血清则无（图5)。表明重组AK 在变性
条件下具有良好的与IgE 结合活性，具有变应原性。
4.2ELISA 检测结果表明，在非变性天然条件下该重组蛋白也具有良好的变应原活性（表1）。
讨论
变态反应性疾病是临床上的常见病、多发病，世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10%～30%，
M ：蛋白质标志物，1：诱导前，2：诱导后，3：超声后沉淀，4：超声后上清液，5：纯化的重组蛋白。
M ：Protein marker ，1： E.coli Bl21(DE3)/PET -28a -AK before in -duction ，2： E.coli Bl21(DE3)/PET -28a -AK after induction by IPTG for 4hrs ，3：Precipitation after ultrasonic treatment ，4：Supernatant after ultrasonic treatment ，5：Purified recombinant protein with affinity chromatography.
图4重组AK 的诱导表达与分离纯化Fig.4Expression and purification of rAK
M r 116000660004500035000
250001800014000
M 1234
5
M ：蛋白质标志物，1：过敏患者血清，2：健康人血清。
M ：Protein marker ，1：Sera of allergic patients ，2：Sera of healthy persons.
图5重组AK 与美洲大蠊过敏患者血清IgE 反应的
Western blotting 分析
Fig.5Western blotting analysis of rAK binding with IgE in sera
from patients allergic to Periplaneta americana
M r 1000007000055000400003500027000
1500010000
M 1
2
表1
ELISA 检测重组蛋白的变应原活性
Table 1Allergenicity of the recombinant protein detected by ELISA
酶标孔蛋白量Protein content (ng)
过敏患者血清Sera of allergic patients （A 490）健康人血清Sera of healthy persons （A 490）0.0150.553±0.04530.191±0.0043
0.15
0.671±0.03470.221±0.0078
1.5
0.765±0.03260.243±0.0043
15
1.003±0.01470.254±0.021
150
1.136±0.02780.270±0.0247
15001.399±0.09220.288±0.0273
不同稀释倍数重组蛋白的变应原活性
Allergenicity of recombinant protein at different dilution 检测项目
Detection item
106
105
104
103
102
10注:P 值均<0.05。
Note:P<
0.05.
M
12
20001000750500250
100
bp 1100
bp
M ：DNA 标志物，1、2：pET -28a -AK/Bam H Ⅰ+Hin d Ⅲ。M ：DNA marker ，1，2：pET -28a -AK/Bam H Ⅰ+Hin d Ⅲ.
图3美洲大蠊AK 表达载体质粒的Bam H Ⅰ+Hin d Ⅲ双酶切鉴定Fig.3Restriction analysis for pET -28a -AK with Bam H Ⅰand Hin d Ⅲ
of Periplaneta americana
并且随着人们生活方式的变化和环境污染，发病率有不断上升趋势，世界卫生组织认为是当前世界性的重大卫生学问题［9］。美洲大蠊排泌物和尸体降解物是一种常见的、重要的吸入性变应原［10］。美国的一项调查表明，476例哮喘儿童患者，蟑螂过敏原测试阳性达36.8%。进一步分析表明，对蟑螂过敏且暴露于室内高水平蟑螂过敏原的哮喘儿童患者，住院率约为其他患儿的3.4倍［11］。在我国，蟑螂过敏原临床体外检测研究发现，199例患者中有57.9%对蟑螂过敏原呈阳性反应［12］。因此，深入研究美洲大蠊变应原具有重要意义。
目前，我国临床上仍广泛使用美洲大蠊粗浸液对过敏患者进行诊断和特异性免疫治疗。粗浸液组份复杂，易降解及受外源性物质污染，进行标准化十分困难，因此严重影响了治疗的安全性和一致性［13］。重组变应原具有纯度高、可排除病原微生物污染以及容易标准化等优点。利用基因工程技术在体外大量表达具有变应原性的重组变应原，是目前变态反应性疾病诊断与脱敏疫苗研究的新途径之一。
本研究表达了可溶性重组美洲大蠊AK，该重组蛋白在变性和非变性条件下均保持了良好的变应原性。因而，无论是从替代国产粗浸液抗原提高临床诊断的敏感性与特异性考虑，还是从研制用于治疗变态反应性疾病的分子疫苗来考虑，本研究获得的具有变应原活性的重组美洲大蠊AK，都具有重要意义。
此外，AK广泛存在于无脊椎动物体内，对其能量的代谢、贮藏和利用具有重要的调节作用［4］。本研究获得的美洲大蠊AK基因与以往GenBank公布的基因具有99.9%同源性，表明不同地区美洲大蠊基因仅存在微小差异。而两者氨基酸序列完全一致，这在某种程度上表明AK序列在美洲大蠊是高度保守的。
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(收稿日期:2008-02-20编辑:富秀兰)
木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶的基因克隆及表达 木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。 木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。见表2。 3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高
小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性
植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html, 收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性① 张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018) 摘要 Rubisco 活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco 活性的酶, 我们利用PCR 技术, 从小麦(Triticum aestivum )叶片cDNA 文库中克隆得到Rubisco 活化酶基因cDNA 片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot 表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco 活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco 活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco 活化酶, 小麦, 衰老 Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in Wheat ZHANG Guo LI Bin ZOU Qi ② (Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University , Tai’an 271018) Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned from wheat (Triticum aestivum ). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content and Rubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence Rubisco 是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP 的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco 的活性, 如:底物RuBP 本身就是Rubisco 的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco 易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco 成为光合速率的限制因子, 因 而也成为提高作物光合效率的研究目标。 Salvucci 等(1985)发现了Rubisco 活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase 活性; 也有人认为RCA 是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco 的活化状态实际是Rubisco 的失活速率和RCA 活化Rubisco 速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/0a9322386.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
目的基因的克隆表达
目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环
（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记
目的基因的克隆与及表达
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中