免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能

第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术

第十五章免疫细胞功能检测技术

Separation and Assays for Immunocyte

第一部分目的要求和教学内容

一、目的要求

掌握：Ficoll—hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、

方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。

二、教学内容

1．免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。

2．淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。

3．淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。

4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。

第二部分测试题

一、选择题

(一)单项选择题(A型题)

1．外周血中的单个核细胞主要是指

A．淋巴细胞

B．嗜酸粒细胞

C．单核细胞一淋巴细胞

D．单核细胞

E．中性粒细胞

2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为

A． 1.030

B． 1.035

C． 1.092

D． 1.020

E． 1.077

3．用FicolI—hypaque分层液分离PBMC,分离的PBMC层位于试管的

A．血浆层之上

B．血浆层之中

C．血浆层与分层液之间

D．分层液之中

E．试管底部

4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主

要是

A．粒细胞

B．淋巴细胞

C．单核细胞

D．T细胞

E．B细胞

5．能与SRBC占合形成E花环的细胞主要是

A．T细胞

B．B细胞

C．单核细胞

D．粒细胞

E．血小板

6．用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是

A．T 细胞总数

B．Th 胞数

C．Ts细胞数

D．CD4＋细胞数

E．CD8＋胞数

7．用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是A．粒细胞

B．B 细胞

C．单核细胞

D．T 细胞

E．血小板

8．表示淋巴细胞的活力常用

A．活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比

B．活细胞浓度

C．淋巴细胞浓度

D．活细胞和总细胞的比值

E．T细胞和B细胞的比例

9．用腹腔渗出法可从动物的腹腔渗出液中分离出

A．血小板

B．B细胞

C．单核细胞

D．T细胞

E．巨噬细胞

10．活细胞经台盼蓝染色后呈

A．蓝色

B．棕色

C．红色

D．不着色

E．天青色

11．荧光标记法计数外周血B淋巴细胞，检测的特有的表面标志是A．CDl9

B．CD20

C．补体受体

D．SmIg

E．FcR

12．NK细胞特有的表面抗原是

A．CD2

B．CDl6

C．无特异的表面抗原

D．CD23

E．CD56

13．仅能使T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是A．PHA

B．PWM

C．．LPS

D．ConA

E．EBV

14．能使B细胞和T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是A．PHA

B．PWM

C．．LPS

D．SPA

E．EBV

15．检查体液免疫功能最常用的方法是

A．血清免疫球蛋白定量测定

B．溶血空斑试验

C．B淋巴细胞计数

D．淋巴母细胞转化试验

E．SmlgG测定

16．溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能A．T细胞

B．B细胞

C．中性粒细胞

D．吞噬细胞

E．NK细胞

17．测定T淋巴细胞功能的体内试验是

A．锡克试验

B．狄克试验

C．结核菌素试验

D．天然血型抗体滴度

E．血清：IgG测定

18．正常人外周血T淋巴细胞转化率为

A． <40％

B．40％～50％

C．60％～80％

D．80％

E． >90％

19．常用检测细胞毒效应的方法是

A．3H-TdR掺人法

B．125I释放法

C．51Cr释放法

D．形态学检测法

E．CD8检测法

20．包被有抗Ig抗体的亲和板，其吸附的是A．T细胞

B．B细胞

C．NK细胞

D．NKT‘细胞

E．吞噬细胞

21．Ficoll—hypaque液分离淋巴细胞是一种A．不连续密度梯度离心法

B．连续密度梯度离心法

C．亲和层析法

D．离子交换层析法

E．自然沉降法

22．Ficoll—hypaque淋巴细胞分离液的主要成分是A．聚蔗糖

B．泛影葡胺

C．聚乙二醇

D．聚蔗糖+泛影葡胺

E．聚蔗糖+聚乙二醇

23．Percoll分离液的主要成分是

A．聚蔗糖

B．泛影葡胺

C．聚乙二醇

D．聚乙烯吡咯烷酮

E．经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒

24．检测中性粒细胞杀菌功能的方法是

A．NBT还原试验

B．白细胞计数

C．溶血空斑试验

D．淋巴母细胞转化试验

E．补体介导的细胞毒试验

25．MTT比色法检测IL-2活性，下列哪项是错误的A．需要IL一2依赖细胞株

B．增殖细胞具有吸收MTT的能力

C．颜色的深浅代表细胞代谢活性的强弱

D．可反映B细胞的功能

E．可反映T细胞的功能

(二)多项选择题(x型题)

1．淋巴细胞分离液要求符合的条件有

A．对细胞无毒

B．高渗

C．不溶于血液

D．无色

E．有合适的比重

2．与T细胞计数有关的表面抗原是

A．CD2

B．CD3

C．CD4

D．CD8

E．CDl9

3．与B细胞计数有关的表面标志是

A．SmIg

B．CDl9

C．CD20

D．CD21

E．CD2

4．符合淋巴母细胞转化的形态学特征有

A．细胞体积变小

B．核仁明显、核染质疏松

C．可见有丝分裂

D．胞浆极少，呈天青色

E．胞内可见空泡

5．用酶联免疫斑点试验检测B细胞功能的优点有

A．稳定、特异 B．可检测抗体分泌细胞

C．可检测抗体的分泌量 D．可同时进行B细胞计数 E．可同时检测不同抗原诱导的不同抗体的分泌

6．细胞免疫功能测定包括以下哪些

A．T细胞计数

B．B细胞计数

C．T细胞功能测定

D．Tc细胞效应测定

E．细胞因子测定

7．检测淋巴细胞亚群常用的方法有

A．免疫荧光法

B．流式细胞仪测定

C．酶免疫组化法

D．放射免疫法

E．免疫金染色法

8．细胞免疫功能体内试验方法有

A．细胞毒试验

B．混合淋巴细胞反应

C．皮肤试验

D．淋巴细胞增殖试验

E．接触性过敏试验

9．T细胞增殖试验常用的检测方法有 A．流式细胞仪法

B．形态学方法

C．51Cr释放法

D．MTT检测法

E．3H一FdR掺人法

10．检测吞噬细胞功能的方法有A．吞噬试验

B．杀菌试验

C．NBT还原试验

D．化学发光测定法

E．趋化功能测定法

11．淋巴细胞亚群的分离方法有A．E花环分离法

B．尼龙棉柱分离法

c．亲和板结合分离法

D．免疫磁珠分离法

E．超速离心分离法

12．T细胞数量检测包括

A.T细胞增殖试验

B．间接荧光免疫法

C．酶免疫组织化学法

D．微量细胞毒试验

E．花环技术

13．检测T细胞数量的花环试验有A．酵母菌花环试验

B．补体C3b花环试验

C．E花环试验

D．葡萄球菌花环法

E．抗体致敏细胞花环法

14．B细胞表面具有、

A．mIg

B．CD抗原

C．Fc受体

D．补体受体

E．EB病毒受体

15．B细胞数量检测的方法包括

A．mIg的检测法

B．CD抗原检测法

C．Fc受体检测法

D．补体受体检测法

E．小鼠红细胞受体检测法

16．B淋巴细胞功能的测定方法有

A．B细胞增殖试验

B．溶血空斑试验

C．酶联免疫斑点法

D．体内测定法

E．形态学检查法

17．中性粒细胞吞噬和杀菌功能的测定方法

A．形态学检查法

B．显微镜检查法

C．溶菌法

D．NBT还原试验

E．化学发光测定法

18．巨噬细胞功能的检测方法包括

A．炭粒廓清试验

B．吞噬功能检测

C．巨噬细胞溶酶体酶测定

D．细胞毒作用测定

E．巨噬细胞促凝血活性测定

(三)配伍题

问题1-3

A．红细胞层

B．粒细胞层

C．单个核细胞层

D．血浆与血小板层

E．淋巴细胞分离液层

1.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最上层是

2.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最下层是

3.采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，第二层是

问题4-6

A．淋巴细胞转化试验

B．溶血空斑试验

C．炭粒廓清试验

D．琼脂糖凝胶平板法

E．化学发光测定法

4．巨噬细胞吞噬功能的检测：

5．中性粒细胞趋化功能的检测：

6．中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测：

二、填空题

1．PBMC包括（）和（）。

2．在反相溶血空斑试验中，每一个空斑代表一个（）。

3．B细胞表面特异的标志是（）。

4．常用的测定淋巴细胞活力的方法是（）。

5．淋巴细胞转化情况的判定方法有（）、（）和（）。

6．淋巴细胞转化试验应用的同位素是（），细胞毒试验应用的同位素是（）7．分离外周血白细胞常用的方法是（）和（）。

8．去除白细胞悬液中残留红细胞的常用方法有（）和（）。

9．去除单个核细胞悬液中单核细胞的常用方法有（）和（）。

10．检测T细胞数量的花环技术包括（）（）和（）；检测B细胞数量的花环技术主要有（）和（）。

11.淋巴细胞和单核细胞的密度为（）。

12．外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为（）（）及（）层。

三名词解释

1．外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)

2．E花环试验(erythrocyte rosette test)

3．淋巴母细胞转化试验(1ymphoblast transformation assay)

4．溶血空斑试验hemolytic plaque assay)

5．四唑氮蓝还原试验(nitroblue tetrazolium recovery assay，NBT还原试验)

四、简答题

1．简述T淋巴细胞转化的试验原理和镜下淋巴细胞转化形态学特征。

2．叙述T细胞介导的细胞毒试验的原理、意义和方法分类

3．测定吞噬细胞功能有哪些常用方法?

五．论述题

简述Fic011一hypaque分离液分离PBMC的原理、步骤和注意事项。

第三部分参考答案与题解

一、选择题

(一)单项选择题(A型题)

1．C 2．E 3．C 4．B 5．A 6．A 7．D 8．A 9．E 10·D

11．D 12．C 13．A 14．B 15．A 16．B 17．C 18．C 19．C 20·B

21．A 22．D 23．E 24．A 25．D

(二)多项选择题(X型题)

1．ACDE 2．ABCD 3．ABCD 4．BCE 5．ABCDE 6．ACDE 7．ABCE 8．CE 9．BDE 10．ABCDE 11．ABCD 12．BCDE

13．CDE 14．ABCDE 15．ABCDE 16．ABCD 17．BCDE 18．ABCDE

(三)配伍题

1.D

2.A

3.C

4.C

5.D

6.E

二、填空题

1．淋巴细胞单核细胞

2．分泌Ig的细胞

3．SmIg

4．台盼蓝染色法

5．形态学方法。H—TdR掺入法MTI"检测法

6．3 H，51Cr

7．自然沉降法聚合物加速沉降法

8．无菌蒸馏水低渗裂解法0．83％氯化铵处理法

9．黏附去除法，羰基铁粉吞噬去除法

10．E花环试验葡萄球菌花环法抗体致敏红细胞花环法EA花环试验EAC花

环试验

11.淋巴细胞和单核细胞的密度为 1.077+0.001。

12．外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为_血清_，_PBMC及_粒细胞、红细胞_层。

三、名词解释

1．PBMC：外周血单个核细胞主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的

细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。

2．E花环试验：T细胞表面有特异性绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。将T细

胞与SRBc按一定比例混匀，置4h至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合

形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构，镜检计数可得总花环(Et)形成

率，亦即T细胞的百分率。

3．淋巴母细胞转化试验：细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞出现一

系列的增殖反应，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，并发生形态返祖变化，如细胞变大、胞质增多、胞质出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，这种淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化(1ymphoblast transformation)。

4．溶血空斑试验：该方法用于检测实验动物抗体形成细胞数目。其基本原理是抗体

形成细胞分泌的Ig与SRBc上的抗原结合，在补体作用下出现溶血反应。方法是将SRBC

与其免疫的小鼠脾细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，或者将吸附有已知抗原的SRBc与待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，温育一定时间，抗体形成细胞

释放的抗体会使周围SRBc致敏，并在补体作用下出现肉眼可见的溶血空斑，每一空斑中

央含有一个抗体形成细胞，因此空斑数量即代表抗体形成细胞数。

5．NBT还原试验：活化的中性粒细胞与NBT一起温育，由于中性粒细胞吞噬杀菌过

程中产生超氧阴离子(O2-)，使被吞进细胞内的NBT由原来呈淡黄色还原成不溶性的蓝

黑色颗粒，沉积在细胞浆中，称为NBT阳性细胞。光学显微镜下计数NBT阳性细胞，其

百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。

四、简答题

1．T淋巴细胞转化试验原理：T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原

刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。因此可借助形态学方法观测淋巴细胞形态变化情况，3H一胸腺嘧啶核苷(3H—FdR)掺入法测定DNA合成情况，或MTT比色法测定线粒体代谢活性即可判定淋巴细胞转化程度。

镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。

(1)淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大3～4倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松，呈细网状，可见分裂现象。

(2)过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为12～15μm，胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。

(3)正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，

嗜碱性强。

3．细胞毒T细胞(CTL)在体外能特异性杀伤带有相同抗原的某些敏感传代瘤细胞株(靶细胞)。将适当的靶细胞悬液按一定比例与受检淋巴细胞混合，培养数小时后观察靶细胞的破坏情况可判断受检者的CTL杀伤能力，进而判断其细胞免疫状态。常用方法

有形态学检查法和51Cr释放法。

CTL杀伤功能测定是体外检测机体细胞免疫功能的一种常用方法。利用靶抗原与淋巴细胞的相互关系阐明靶细胞的抗原性；用于判断肿瘤患者的预后及免疫治疗效果；观察药物、肿瘤抗原以及其他抗原对CTL杀伤功能的影响；鉴定淋巴细胞的功能性亚群等。4．吞噬细胞功能测定从趋化、吞噬和杀菌三个方面进行检测。常用的方法：趋化功能测定的有滤膜渗透法、琼脂平板法，吞噬功能测定的有吞噬试验，杀菌功能测定的有

NBT还原试验、杀菌功能试验、化学发光试验等方法。

五.论述题

2．Ficoll—hypaque分离液分离PBMC的原理：血液单个核细胞包括淋巴细胞和单核

细胞。人外周血单个核细胞的密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.090～1.093。利用密度为1.077±0.001的Ficoll—hypaque分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底，据此可将血液中的单个核细胞与其他细胞分离开。

Ficoll—hypaque：分离液分离PBMC的步骤：

(1)取静脉血，加肝素溶液抗凝，再加入等量Hanks液，混匀。

(2)取分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界

面。稀释血液与分层液的容积比例以2:1—3:l为宜。

(3)置水平离心机中离心2000r／min 20min。

(4)离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层

液层、白雾状单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。

(5)用滴管直接吸出单个核细胞层，置于另一离心管中。

(6)加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000r／min 10min。离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗涤2次。

(7)用含10％～20％，灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。

注意事项：

(1)将血液适当稀释，减低血液黏稠度有利于提高单个核细胞的收获率。

(2)温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。

(3)分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。

(4)将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。

(5)分离时的转速与时间应根据不同标本作相应调整。离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间。

免疫细胞表面标志Mark

辅助性T细胞的典型表面标志：CD3+CD4+CD8-。（Th1主要分泌IL-2，IFN-γ或TNF-β等辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反应；Th2主要分泌IL-4/5/6/10等辅助体液免疫、参与速发型超敏反应） 细胞毒性T细胞的典型表面标志是CD3+CD4-CD8+。（CD3+CD8+CD30-可认定为Tc1细胞；CD3+CD8+CD30+可认定为Tc2） 调节性T细胞：自然存在的，其典型标志为CD4+CD25+Foxp3+ （最重要的分子标记是一种转录因子Foxp3） 成熟B细胞均表达CD19，B1细胞CD19+CD5+，B2细胞CD19+CD5- NK细胞的典型标志：CD3-CD16+CD56+。 单核-巨噬细胞的典型表面标志为CD14。 人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83，但不表达MPS T/B/NK细胞的典型表面标志（CD14/3/19和CD20/16/56）。

小结 淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法， 而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面 标志是CD抗原。 进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。 但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群 指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特 异。 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以分为：辅助性T 细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B细胞所特有，是鉴定B 细胞可靠的指标，以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1和B2两个亚群； 目前多以CD3一、CD16+、CD56+作为NK细胞的典型标志。

细胞表面标志 PCR array 芯片

Cell Surface Markers PCR Array Catalog No.PAHS-055A（人） 细胞表面标志物PCR芯片 The Human Cell Surface Markers RT2Profiler?PCR Array profiles the expression of84genes relevant to research at the cell surface marker level.These markers have been used in studies including:1)determination of the extent of leukocyte infiltration among cancer tissues;2)characterization of cell populations isolated from patients with chronic inflammatory diseases such as atherosclerosis,asthma,inflammatory bowel disease,and arthritis;3)determination of T-and B-cell lineage and clonality;4) characterization of leukocyte populations for use in the prognosis of disease stage and progression;and5)analysis of the composition of immune infiltrates and their association with organ https://www.wendangku.net/doc/009425988.html,ing real-time PCR,you can easily and reliably analyze expression of a focused panel of genes related to cell surface markers with this array. 细胞表面标记物RT2Profiler?PCR Array可以同时检测84个研究中至关重要的细胞表面标志物的表达水平。这些标志物主要用于以下研究：1）确定肿瘤组织中白细胞浸润的程度；2）对于慢性炎症病人，如动脉粥样硬化、哮喘、炎症性肠病和关节炎等，可通过细胞表面标记物对细胞分型；3）确定T细胞和B细胞谱系和克隆系；4）对白细胞进行分型，从而预测疾病的发展阶段及进展；5）分析免疫浸润的原理和与器官排斥反应的关系。利用实时定量PCR，你可以方便并且可信地对与TNF信号相关的基因进行同时检测。 B-cell Surface Markers: Activated B-cells:CD28,CD38,CD69,CD80,CD83,CD86,DPP4,FCER2,IL2RA,TNFRSF8,CD70(TNFSF7). Mature B-cells:CD19,CD22,CD24,CD37,CD40,CD72,CD74,CD79A,CD79B,CR2,IL1R2,ITGA2,ITGA3,MS4A1,ST6GAL1. Other B-cell Surface Markers:CD1C,CHST10,HLA-A,HLA-DRA,NT5E. T-cell surface markers: Cytotoxic T-cells:CD8A,CD8B1. Helper T-cells:CD4. Activated T-cells:ALCAM,CD2,CD38,CD40LG,CD69,CD83,CD96,CTLA4,DPP4,HLA-DRA,IL12RB1,IL2RA,ITGA1,TNFRSF4,TNFRSF8,CD70(TNFSF7). Other T-cell Surface Markers:CD160,CD28,CD37,CD3D,CD3G,CD3Z,CD5,CD6,CD7,FAS,KLRB1,KLRD1,NT5E,ST6GAL1. Natural Killer(NK)Cell Surface Markers:CD2,CD244,CD3Z,CD7,CD96,CHST10,IL12RB1,KLRB1,KLRC1,KLRD1,NCAM1. Monocyte and Macrophage Cell Surface Markers: Activated Macrophages:CD69,ENG,FCER2,IL2RA. Other Monocyte and Macrophage Surface Markers:C5R1,CD163,CD40,CD63,CD74,CD86,CHST10,CSF1R,DPP4,FCGR1A,HLA-DRA,ICAM2,IL1R2, ITGA1,ITGA2,S100A8,TNFRSF8,CD70(TNFSF7). Endothelial Cell Surface Markers:ENG,ICAM2,NOS3,PECAM1,SELP,TEK,VCAM1,VWF. Smooth Muscle Cell Surface Markers:MYH10,MYH9,MYOCD. Dendritic Cell Surface Markers:CD1A,CD209,CD40,CD83,CD86,CR2,FCER2. Mast Cell Surface Markers:C5R1,FCER1A,FCER2,TPSAB1. Fibroblast(Stromal)Surface Markers:ALCAM,COL1A1,COL1A2. Epithelial Cell Surface Markers:CD1D,KRT18,KRT5,KRT8,TACSTD1. Adipocyte Surface Markers:RETN. B细胞表面标记物、T细胞表面标记物、自然杀伤细胞表面标记物、单核细胞和巨噬细胞表面标记物、内皮细胞表面标记物、平滑肌细胞表面标记物、树突状细胞表面标记物、肥大细胞表面标记物、成纤维细胞（基质细胞）表面标记物、表皮细胞表面标记物、脂肪细胞标记物

免疫细胞分离及检测技术

第十三章免疫细胞分离及检测技术 本章考点 1.免疫细胞的分离 2.淋巴细胞表面标志的检测 3.淋巴细胞功能检测技术 4.免疫细胞检测的临床意义 第一节免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。 2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种 （1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。 图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷 （2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。 图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷

临床医学检验技师考试辅导临床免疫学和免疫检验 第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术练习题

第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术 一、A1 1、已知细胞中的黏附能力最大的为 A、树突状细胞 B、单核细胞 C、B细胞 D、T细胞 E、红细胞 2、免疫细胞检测技术中外周血单个核细胞指的是 A、有核细胞 B、淋巴细胞 C、单核细胞 D、淋巴细胞和单核细胞 E、幼稚细胞 3、下列关于T细胞亚群的分离，说法错误的是 A、原理是根据相应细胞的不同标志加以选择性纯化 B、凡根据细胞的表面标志进行纯化得到所需要的细胞群是阳性选择法 C、选择去除不需要的细胞群，仅留下所需要的细胞为阴性选择法 D、E花环沉降法是最先进的细胞分选技术 E、尼龙毛柱分离法是常用的分离方法 4、下列有关转化的淋巴细胞的形态描述中，错误的是 A、细胞变大 B、出现空泡 C、核仁消失 D、染色质疏松 E、胞质扩大 5、检测T细胞数量的试验是 A、溶血空斑试验 B、SmIg荧光抗体染色试验 C、巨噬细胞或白细胞移动抑制试验 D、E玫瑰花环试验 E、计算盘直接计数 6、溶血空斑形成试验中，空斑的大小表示 A、抗体生成细胞的多少 B、抗体生成细胞的种类 C、细胞的大小 D、抗体生成细胞产生抗体的多少 E、吞噬细胞的活性 7、做自然杀伤细胞毒试验，敏感而常用的是哪种细胞株 A、小鼠T细胞肿瘤细胞株 B、人肺癌细胞 C、K562细胞系 D、小鼠细胞毒T细胞系

E、L929细胞株 8、具有抗肿瘤效应的第一道防线是 A、TC细胞 B、中性粒细胞 C、TH细胞 D、B细胞 E、NK细胞 9、下列不属于自然杀伤（NK）细胞检测方法的是 A、酶释法和放射性核素法 B、酶释法和荧光分析法 C、放射性核素法和荧光分析法 D、放射性核素法和荧光分析法和酶释法 E、反向溶血空斑实验和酶释法 10、可刺激B淋巴细胞增殖转化的刺激物是 A、PWM B、PHA C、ConA D、MHC E、BCG 11、用于临床评价病人免疫状况的试验中，评价T细胞功能的试验是 A、血清免疫球蛋白检测 B、溶血空斑试验 C、淋巴细胞转化试验 D、膜表面Ig测定 E、EA花环试验 12、关于单个核细胞说法错误的是 A、单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞 B、单个核细胞的体积、形态、比重与其他细胞不同 C、可利用单个核细胞的体积不同，按照密度梯度来分离 D、在进行密度梯度分离时，单个核细胞比重比溶液的比重大 E、多核粒细胞比重比单个核细胞比重大 13、采用密度梯度分离法分离得到的细胞主要为 A、单核细胞和粒细胞 B、单核细胞 C、淋巴细胞 D、淋巴细胞和单核细胞 E、淋巴细胞和粒细胞 14、利用E花环沉降法可分离 A、单核细胞和B细胞 B、浆细胞和粒细胞 C、B细胞和T细胞 D、B细胞和粒细胞 E、B细胞和吞噬细胞 15、对分离细胞的保存说法错误的是

免疫细胞的分离及其表面标志检测技术题库1-0-8

免疫细胞的分离及其表面标志检测技术题 库1-0-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]从单个核细胞中去除单核细胞最便捷的方法是（） A.E花环沉淀法 B.尼龙棉吸附法 C.亲和板结合法 D.黏附贴壁法 E.免疫磁珠 单核细胞具有黏附玻璃、塑料、尼龙毛的特性，通过黏附贴壁法可去除单个核细胞中的单核细胞，从而获得纯淋巴细胞。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]能长期保存分离细胞的方法是（） A.含10%～20%灭活小牛血清的Hanks B.液氮深低温（-196℃）保存 C.Tc-199 D.RPMI1640 E.4℃保存 液氮深低温-196℃能长期保存分离细胞，需加入二甲亚砜作为保护剂。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]哪一种分化抗原又称作绵羊红细胞受体（） A.CD2 B.CD3 C.CD4 D.CD8 E.CD28 CD2表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞结合，又称绵羊红细胞受体。https://www.wendangku.net/doc/009425988.html,/ 英超直播

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]细胞毒T细胞的标志性抗原为（） A.CD3+、CD4+、CD8+ B.CD3+、CD4+、CD8- C.CD3+、CD4+、CD25+ D.CD3-、CD4-、CD8+ E.CD3+、CD4-、CD8+ CD3+、CD4-、CD8+为细胞毒T细胞；CD3+、CD4+、CD8+为辅助性T细胞；CD3+、CD4+、CD25+为调节性T细胞。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]单核巨噬细胞的典型的表面标志是（） A.CD2 B.CD3 C.CD14 D.CD16 E.CD28 单核巨噬细胞的典型的表面标志是CD14。

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

免疫功能评估报告

免疫功能评估 解读 重庆斯德姆生物技术有限公司干细胞与再生医学技术研究院重庆再生医学与健康技术研究院

2018 年美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James P.Alison) 和日本免疫学家本庶佑 (Tasuku Honjo) 因为在抑制消极免疫调节机制的研究 中发现了新癌症疗法作出的贡献，荣获年度诺贝尔生理学或医学奖。 詹姆斯·艾利森发现阻断CTLA-4 能够激活免疫系统的T 细胞，激活的 T 细胞会重新攻击癌细胞。 本庶佑首先鉴定PD-1 为活化 T 淋巴细胞上的诱导型基因，这一发现为 PD-1 阻断建立癌症免疫治疗原理作出了重大贡献。曾在201 3 年被《 Science 》评为年度十大科学突破之首。

2011 年美国免疫学家和遗传学家布鲁斯·博伊特勒(Bruce A.Be utler) 、卢森堡科学家朱尔斯·霍夫曼 (Jules A.Hoffmann) 和加拿大生 物学家拉尔夫·斯坦曼(Ralph M.Steinman) 三名科学家发现免疫系统 激活的关键原理，革命性地改变人们对免疫系统的理解，从而分享年 度诺贝尔医学奖。 布鲁斯·博伊特勒和朱尔斯·霍夫曼发现了关键受体蛋白质， 称为Toll 样受体（ Toll-like receptors ， TLR ）。 拉尔夫·斯坦曼在上世纪 70 年代第一个发现 DC(树突状细胞 )。D C 是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞，具有强大的活化T 细胞能力，在获得性免疫启动中发挥重要的“信使”作用，从而引起一系列反应，制 造出抗体和“杀手”细胞等“武器”杀死被感染的细胞以及入， 侵的病原体。

〉〉〉安全防御系统 居家地点不同，保护住家安全的方法就不同。有些公寓有看门卫，有些房子建有栅栏，如果你有城堡，就需要配备一条护城河和一支弓箭部队，或者你可以选择其他一些特殊的家庭防御装置，比如安装锁、电子安全系统，养一只狗。 无论你选择的防御方法是什么，输入通行密码也好，用链条拴门也罢，还是要那种看门护院狗，其中的原因都在于你想要一个的安全 系统来保护你家里所有有价值的东西，从相册、立体声音响设备到传 家宝以及孩子们。 你的身体内也有自己的安全体系来抵御入侵者。皮肤和骨骼能在车祸中或是遇到打偏的高尔夫球时保护体内器官，头发保护头皮不受 紫外线侵害，眼睑保护眼球以防伸向眼睛的指头，但是你体内最重要 的安全系统是一个隐形的系统，你无法感觉或是看见它，而它却承担着抵御入侵病原体和帮助你康复的重任，这个系统就是人体的防御系统。 〉〉〉人体防线 人体有三道防线构成的防御系统，主要功能是抵御病原体的攻击。是由皮肤、黏膜、黏膜分泌物、杀菌物质 (如溶菌酶 )、免疫器官、免疫细胞、免疫活性物质等构成。 第一道防线 是由皮肤和黏膜构成的，他们不仅能够阻挡病原体侵入人体，而

免疫细胞知识

免疫细胞 简介 免疫细胞（白细胞）是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要角色。组成 免疫器官 类型:扁桃体、淋巴结、胸腺、脾、骨髓等。 功能:免疫细胞生成、成熟、或集中分布的场所。 免疫细胞 吞噬细胞:①与体液中的杀菌物质构成人体的第二道防线，参与非特异性免疫。 ②摄取和处理抗原，参与细胞免疫和体液免疫。 淋巴细胞:①T细胞 ②B细胞 免疫活性物质 抗体、淋巴因子及溶解酶等。

种类 T淋巴细胞———胸腺依赖淋巴细胞，简称T细胞，来源于骨髓的多能干细胞，是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中抵御疾病感染、肿瘤形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种:与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。

B淋巴细胞——简称B细胞。来源于骨髓的多能干细胞。是由骨髓中的淋巴干细胞分化而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。 K淋巴细胞——抗体依赖淋巴细胞，直接从骨髓的多能干细胞衍化而来，表面无抗原标志，但有抗体IgG的受体。发挥杀伤靶细胞的功能时必须有靶细胞的相应抗体存在。靶细胞表面抗原与相应抗体结合后，再结合到K细胞的相应受体上，从而触发K细胞的杀伤作用。凡结合有IgG抗体的靶细胞，均有被K细胞杀伤的可能性。因此，也可以说K细胞本身的杀伤作用是非特异性的，其对靶细胞的识别完全依赖于特异性抗体的识别作用。K细胞约占人外周血中淋巴细胞总数的 5~10%，但杀伤效应却很高。当体内仅有微量特异性抗体，虽可与抗原结合，但不足以激活补体系统破坏靶细胞时，K细胞即可发挥其杀伤作用。K细胞在腹腔渗出液、脾脏中较多，淋巴结中较少，胸导管淋巴液中没有，表明K细胞不参加淋巴细胞的再循环。但K细胞的杀伤作用在肿瘤免疫、抗病毒免疫、抗寄生虫免疫、移植排斥反应及一些自身免疫性疾病中均有重要作用，产生的免疫应答有免疫防护及免疫病理两种类型。如靶细胞过大(寄生虫或实体瘤)，吞噬细胞不能发挥作用或靶细胞表面被抗体覆盖，T细胞不能接近时，K细胞仍能发挥作用。肾移植中的排斥反应，机体自身免疫性疾病的受累器官或组织的破坏，都可能与K 细胞有关。 NK淋巴细胞（自然杀伤细胞）——是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK 细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15%，在脾内约有3%~4%，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等。

骨髓间充质干细胞的主要表面标志

骨髓间充质干细胞的主要表面标志 1 骨髓间充质干细胞的发现和来源 骨髓组织中有多种细胞成分，除基质细胞等已经分化的细胞外，还含有两类多潜能干细胞：造血干细胞和间充质干细胞。1987 年Friedenstein 等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下可分化为多种类型的细胞，而且经过20－30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞, 故称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs),或间质祖细胞(MPCs)，是成人多能干细胞的一类。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)，或骨髓基质成纤维细胞(Marrow stromal fibroblast，MSF)。Friedenstein AJ , Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow o steogenic stem cells: in vit ro cult ivat ion and t ransp lantat ion in diffusion chambers. Cell T issue Kinet, 1987, 20 (3) : 263-267] 2 鉴于其强大的增殖能力及多向分化潜能，可在体外长期培养和遗传背景较稳定，而且用自体干细胞诱导构建的组织不涉及伦理问题，也不存在MHC限制，所以骨髓间充质干细胞日益受到重视。但是与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs的数量非常少，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少。因此，如何简便有效地从骨髓中获取高纯度的MSCs显得尤为重要，寻找高度特异性的MSCs的表面抗原也就成为MSCs研究中的一项重要任务和目标。 不仅如此，一种同样来源于骨髓、贴壁生长、被认为更原始（可以分化为MSCs）也具有更强增殖能力的干细胞也被鉴定，它就是多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell (MAPC) or mesodermal progenitor cell(MPC)）[Reyes, M., Lund, T., Leuvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., Verfaillie, C.M. (2001) Purification and in vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98, 2615-2625]，因能和MSCs一起被纯化而统称BM stromal stem cell。 3 利用流式细胞仪的研究显示,MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：实验地点：实验人： 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1)健康小鼠 2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3)70%乙醇 4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 5)0.2%台盼蓝 6)细胞计数板、计数器 7)离心机 8)显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 ●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 ●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液 ●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，

用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 ●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min， 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。 然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 ●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞 悬液。 3.3计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml 3.4计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为： 324-16/324×100%=95.1% 在理论范围之内 4实验结果 4.1研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2白细胞计数 在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题:起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。后来我们

干细胞表面标记

Marker Name Cell Type Significance Blood Vessel Fetal liver kinase-1 (Flk1) Endothelial Cell-surface receptor protein that identifies endothelial cell progenitor; marker of cell-cell contacts Smooth muscle cell-specific myosin heavy chain Smooth muscle Identifies smooth muscle cells in the wall of blood vessels Vascular endothelial cell cadherin Smooth muscle Identifies smooth muscle cells in the wall of blood vessels Bone Bone-specific alkaline phosphatase (BAP) Osteoblast Enzyme expressed in osteoblast; activity indicates bone formation Hydroxyapatite Osteoblast Minerlized bone matrix that provides structural integrity; marker of bone formation Osteocalcin (OC) Osteoblast Mineral-binding protein uniquely synthesized by osteoblast; marker of bone formation Bone Marrow and Blood Bone morphogenetic protein receptor (BMPR) Mesenchymal stem and progenitor cells Important for the differentiation of committed mesenchymal cell types from mesenchymal stem and progenitor cells; BMPR identifies early mesenchymal lineages (stem and progenitor cells) CD4 and CD8 White blood cell (WBC) Cell-surface protein markers specific for mature T lymphocyte (WBC subtype) CD34 Hematopoietic stem cell (HSC), satellite, endothelial progenitor Cell-surface protein on bone marrow cell, indicative of a HSC and endothelial progenitor; CD34 also identifies muscle satellite, a muscle stem cell CD34+Sca1+ Lin- profile Mesencyhmal stem cell (MSC) Identifies MSCs, which can differentiate into adipocyte, osteocyte, chondrocyte, and myocyte CD38 Absent on HSC Present on WBC lineages Cell-surface molecule that identifies WBC lineages. Selection of CD34+/CD38- cells allows for purification of HSC populations CD44 Mesenchymal A type of cell-adhesion molecule used to identify specific types of mesenchymal cells c-Kit HSC, MSC Cell-surface receptor on BM cell types that identifies HSC and MSC; binding by fetal calf serum (FCS) enhances proliferation of ES cells, HSCs, MSCs, and hematopoietic progenitor cells Colony-forming unit (CFU) HSC, MSC progenitor CFU assay detects the ability of a single stem cell or progenitor cell to give rise to one or more cell lineages, such as red blood cell (RBC) and/or white blood cell (WBC) lineages

项目十七 T淋巴细胞表面标志和功能检测

项目十七T淋巴细胞表面标志和功能检测 一、E花环形成试验 (Erythrocyte rosette formation assay) 【实验原理】 人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。此试验用于计数T细胞数量，进而可判断机体细胞免疫状况。由于T 细胞的异质性，其中在4℃放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et 花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4℃作用，立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。 【试剂和器材】 1．肝素抗凝剂用Hanks液将肝素配成500U/ml，分装，每管0.1ml，置4℃备用。 2．淋巴细胞分离液(密度为1.077±0.001)。 3．小牛血清56℃加热灭活30min，按2:1比例与沉积SRBC混合，置37℃30min，离心，收集血清备用。 4．0.5％SRBC悬液取脱纤维或Alsever液保存的羊血，用5～10倍量生理盐水洗3 次。第3次2500r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水配成0.5％的SRBC悬液(约108个细胞/ml)。 5．0.8％戊二醛取30.25ml 4.5 g/L NaCl 盐水，加入1ml 25％戊二醛即可。 6．姬姆萨-瑞氏染液取磷酸缓冲液(PB：1/15 mol/L, pH7.0～7.4)10ml，加入姬姆萨染液6滴及瑞氏染液1滴。 7．Alsever液、Hanks液(无Ca2+和Mg2+, pH7.2～7.4)、PB(1/15 mol/L, pH7.0～7.4)、生理盐水。 8．离心机、水浴箱、电冰箱、显微镜、离心管、载玻片、盖玻片、吸管、吸球、注射器。 【步骤和方法】 1．淋巴细胞悬液的制备取2ml肝素抗凝血，加入2ml Hanks液，叠加于2ml 淋巴细胞分离液上，水平离心2000 r/min 20 min。取出单个核细胞层，用4~5倍Hanks液洗2次，每次离心1000r/min 10min。弃去上清液，留下沉淀细胞约0.2ml。 2．Et花环试验 (1)取0.2ml 0.5％SRBC悬液和0.1ml小牛血清，加入到沉淀细胞管中混匀，置37℃水浴5min。 (2)取出离心500 r/min 5min，置4℃1~2h或过夜。 (3)沿管壁加入0.8％戊二醛0.2 ml，置4℃20min。 (4)弃上清，留约0.2ml，轻轻吹吸混匀沉淀细胞。 (5)结果观察①湿片法观察：取1滴细胞悬液滴加于载玻片上，加入少许姬姆萨-瑞氏染液染色，加盖玻片后高倍镜下观察。②干片法观察：取细胞悬液涂片，自然干燥，用姬姆萨-瑞氏染液染10min，水洗，干燥后高倍镜或油镜下观察。 3．Ea花环试验与Et花环试验基本相同，不同之处是SRBC悬液的浓度为0.1％，SRBC与淋巴细胞混合之比为10:1~20:1，混合后立即离心1000r/min 5min。加入戊二醛固定，染色，观察均与Et花环试验相同。 【结果判定】 淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，SRBC不着色，凡结合3个SRBC或以上者为E花环形成

第二十四章免疫细胞的分离与检测Chapter24SeparationandAssays

第二十四章免疫细胞的分离与检测 Chapter 24 Separation and Assays for Immunocyte 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：Ficoll-hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 二、教学内容 1。免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。 2。淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。 3。淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。 4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1．外周血中的单个核细胞主要是指 A．淋巴细胞B．嗜酸性粒细胞C．单核细胞-淋巴细胞 D．单核细胞E．中性粒细胞 2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为 A．1.030 B．1.035 C．1.092 D．1.020 E．1.077 3．用Ficoll-hypaque分层液分离PBMC，分离的PBMC层位于试管的 A．血浆层之上B．血浆层之中C．血浆层与分层液之间 D．分层液之中E．试管底部 4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主要是A．粒细胞B．淋巴细胞C．单核细胞D．T细胞E．B细胞 5．能与SRBC结合形成E花环的细胞主要是 A．T细胞B．B细胞C．单核细胞D．粒细胞E．血小板 6．用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是 A．T细胞总数B．Th细胞数C．Ts细胞数D．CD4+细胞数E．CD8+细胞数 7．用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是： A．粒细胞B．B细胞C．单核细胞D．T细胞E．血小板 8．表示淋巴细胞的活力常用 A．活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比B．活细胞浓度C．淋巴细胞浓度 D．活细胞和总细胞的比值E．T细胞和B细胞的比例

T细胞分离

T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。 免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。 粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。 有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为： 巨噬细胞或单核细胞〉树突状细胞二抗体产生细胞〉B淋巴细胞〉T淋巴细胞二红细胞。 粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。 E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。 尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。 一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC 外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。 目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 (ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation )，用此方法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%, B淋巴细胞占4?10%。 ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求

免疫细胞的分离与计数

实验五免疫细胞的分离与计数 一、实验原理 外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）包括淋巴细胞与单核细胞，其中T细胞约占50-70%，B细胞约占10-15%，单核细胞约占10-25%，还有部分NK细胞和其他细胞。常规的促分裂原诱导的T细胞增殖试验和特异性抗原诱导的T细胞增殖试验可直接用PMBC作为靶细胞，其中混杂的单核细胞可作为抗原提呈细胞促进细胞增殖。对于要求较高纯度T细胞的试验，可以从PMBC中再纯化T细胞。因此，分离和获取外周血单个核细胞（PMBC）是检测T细胞免疫功能的基础。目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法直接分离PMBC。 用来分离人和动物外周血PMBC的分离液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）—泛影酸葡甲胺（Urografin）(F/H)分离液。当将抗凝血叠加在淋巴细胞分离液表面水平离心后，由于红细胞、粒细胞、单个核细胞、血浆等的比重不同，会出现分层现象，即在离心管中出现5层：最上层是血浆（内含血小板），血浆层和淋巴细胞分离液层之间是PMBC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黄层。吸取血浆与淋巴细胞分离液层之间的白色细胞，即为所需的PMBC。 二、实验目的 1. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的技术与细胞计数法。 2. 掌握脾细胞的分离与计数方法。 三、试剂与材料 1.比重为1.077±0.001kg/L的淋巴细胞分离液； 2.无菌Hank’s液（4。C冰箱保存，临用时将PH值调至7.3-7.6）； 3.1%台盼蓝染液； 4.柠檬酸钠抗凝剂； 5.含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液； 6.仪器设备：血细胞计数板（hemocytometer）、计数器、显微镜、水平离心机、无菌 注射器、碘酒、酒精、无菌试管、无菌吸管、微量移液器和无菌枪头。 四、操作步骤 1.在一15mL无菌离心管中加入适量的柠檬酸钠溶液，采集鸡静脉血，迅速轻柔混匀； 2.取1mL抗凝血与等体积的无菌Hank’s液混匀； 3.再取一无菌试管，加入1mL淋巴细胞分离液； 4.然后将2mL稀释的血液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上； 5.将试管置于水平离心机中，2000rpm，离心20min； 6.用毛细吸管轻轻插到上层（血浆层）与中间层（分层液）之间的乳白色浑浊的PMBC 层，吸取PMBC，然后移入另一试管中； 7.加入5倍体积以上的Hank’s液，轻轻混匀，1500rpm，离心15min，吸弃上清液。 重复洗涤细胞2次； 8.末次离心后，弃上清，加入1mL含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液，重悬细胞；