微生物胞外多糖生物合成研究进展

药　物　生　物　技　术

Pharmaceutical Biotechnology　2002,9(6):369～373

微生物胞外多糖生物合成研究进展

王玲燕,李　元Ξ

(中国医学科学院医药生物技术研究所,北京　100050)

摘　要　微生物胞多外糖(EPSs)在食品和医药等方面具有很大的应用价值,近年来,有关EPSs生物合成研究,以及参与EPSs生物合成的基因蔟的不断发现,为EPSs的开发应用展示了更为广阔的前景。

关键词　微生物胞外多糖;生物合成;基因簇

中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2002)06-0369-05

细胞表面的多糖可由许多细菌产生,它们能吸附在细胞膜表面作为脂多糖(LPS)的O2抗原,作为荚膜多糖(CPS)在细胞周围形成一荚膜,或者作为胞外多糖(Ex opolysaccha2 ride,EPS)完全分泌出去,微生物EPS是一种长链,高分子质量聚合物,其独特的物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业倍受青睐,尤其是它在医药领域所具有的巨大应用潜能正日愈引起人们的广泛关注。目前,有关微生物EPSs的研究主要集中在如下几个方面。

1　微生物EPSs的应用

在有微生物存在的自然环境中,多糖具有多种生物功能,它们可以在发病和共生中起作用,防止细胞干燥,或免受其它环境压力,或使细菌易于粘附在固体表面[1,2]。在人为环境中,有些微生物EPSs作为生物工程产品已被普遍接受,而另外一些还处在发展阶段。这些EPSs或是由于它们相对于其他的的EPSs具有独特的物理学特性,例如这些聚合物能够溶解或分散在水中,使溶液产生加稠,凝固和乳化效应;或是由于它们生产成本低,使用安全。例如由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris Pv1Campestris)产生的黄原胶(xanthan),鞘氨醇单胞菌(S phingomonas)分泌的S phingans,包括gellan,wellan,rhamsan和sphinganS288,可用作食品粘稠剂和稳定剂,醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)产生的Acetan可在食品工业上用来生产甜食和制醋[3,4]。

乳酸细菌(Lactic acid bacterial,LAB),能产生大量的胞外多糖并分泌到介质中。例如链球菌(Streptococus salivarius ssp1Thermophilus,S1Thermophilu)是一种嗜热乳酸菌,它在乳制品的发酵生产上具有突出的作用。在酸奶生产过程中,嗜热链球菌(S1Thermophilus)产生EPS导致产品粘度和质地提高,即抗机械强度提高和凝固敏感性降低,因而在那

些禁止在酸奶中添加化学稳定剂的国家,使用EPS生产菌株就显得尤其重要[5]。乳酸细菌产生的EPS也为开发天然添加剂诸如稳定剂,粘稠剂,乳化剂,胶化剂和水化剂等提供了一个宝贵的资源。

更为有意义的是,随着微生物胞外多糖的不断发现和研究的深入,微生物EPSs在医药领域展现出广阔的应用前景。G oven等的研究表明,铜绿假单胞菌(P seudomonas aeruginosa)产生的藻酸盐(alginate)在病人肺囊性纤维变性发病机理中具有重要作用,铜绿假单胞菌感染呼吸道后,会产生大量的藻酸盐,这是导致囊性纤维变性高发病率和死亡率的主要原因[6]。由Acetobacter xylinum和其它G-菌产生的β2D2葡聚糖,即一种细菌纤维素,可用于烧伤、患慢性皮肤溃疡或其它组织拉伤病人的伤口包扎,故称为“BioFill”。这种纤维素在湿润条件下有很强的机械强度,故暂时可作为皮肤替代品。它具有透氧性,高水容量,可明显地促进皮肤组织的再生,同时减少感染。(123)2β2D2葡聚糖具有抗滤过性毒菌和细菌感染的能力,以及抗肿瘤活性,促进非特异性免疫系统的功能[7]。

来源细菌诸如链球菌(Streptococcus equi和Streptococcus zooepidermicus)的透明质酸在水溶液中具有明显的硬度和有限的机械柔韧性,故可替代人和动物来源的透明质酸,用于眼睛和关节的外科手术,并与人体免疫系统相容。同时这种透明质酸具有较高结合水和保持水能力,可用于化妆品的制备,用作假肢的保护套,防止手术后粘连[4]。

另外,通过鼠模型研究表明LA B产生的EPSs可能对健康有利,即EPSs具有免疫促进,抗肿瘤,降胆固醇活性[8～11]。

2　微生物EPSs的生物合成

963

Ξ收稿日期:2002-01-23

基金项目:国家863计划(2001AA214091)

作者简介:王玲燕,1969生,女,江西奉新人,博士研究生,研究方向为基因工程药物。　Ξ通讯作者:李元,中国医学科学院医药生物技术研究所,北京10005,T el:010*********

微生物胞外多糖在结构上和CPS 相似,都由成百上千个相同的寡糖重复单元聚合而成。不同的EPSs 的重复单元各不相同,包括组成的单糖的种类和数量不同,糖苷键的连接方式的不同。目前,有很多种EPSs 结构已被鉴定,这些EPSs 的产生菌比较广泛,包括醋酸杆菌(Acetobacter ),假单胞菌(P seudomonas ),鞘氨醇单胞菌(Sphingomnas ),链球菌

(Streptococcus ),乳球菌(Lactococcus ),乳杆菌(Lactobacil 2lus )

[12]

。

Fig 1　Proposed pathway for xanthan gum synthesis

尽管这些EPSs 表现出很少的共同特性,但由重复单元组成的多糖的生物合成途径基本相同,甚至和LPS 的O 2抗原以及一些CPS 的生物合成途径也很相似,即通过糖基转移酶(G lycosyltrans ferase ,G TF )将单糖从核苷酸糖顺序性转移而装配到脂类载体上形成重复单元,随后是这些重复单元的聚合和输出,形成细胞表面多糖[13,14]。乳球菌产生多糖的生物合成过程是从EPS 前体的胞内合成开始的,即核苷酸糖,接着在脂载体上形成重复单元。例如,乳酸乳球菌

Lactococcus lactis NIZ O B40产生的EPS 的重复单元由2∶2∶1∶

1的葡萄糖,半乳糖,鼠李糖和磷酸组成[15]。核苷酸糖

UDP 2葡萄糖,UDP 2半乳糖,dT DP 2鼠李糖是五糖单元生物合

成的单体供体,EPS 形成的最后步骤很可能是重复单元通过细胞膜运到胞外层,几百个到几千个重复单元聚合,最后形成EPS [16]。

目前,有关xanthan 的生物合成机理研究的更为广泛也最为清楚[3],故可作为研究EPSs 合成的一个范例。X anthan 的生物合成过程如图1所示,首先是核苷酸糖的合成,然后,在引发葡萄糖基转移酶(G umD )的作用下,将葡萄糖磷酸从核苷酸糖UDP 2glucose 连到脂载体上,特异性糖基转移酶(G um M ,G umH ,G umK 和G umI )将糖基核苷酸糖转移到脂连载体上,之后,G umF 和G umG 在甘露糖部分掺入乙酰基,

G um L 在外部甘露糖掺入丙酮基生成重复单元,重复单元在

还原端输出和聚合,形成xanthan ,G um B ,G umC 和G umE 参与了这些过程。

3　微生物EPSs 基因簇的研究

胞外多糖的生命合成由一大族基因编码,基因族通常是单向排列,转录成单个多顺反子mRNA ,并协调表达[17～19]。近年来,越来越多的细菌中的参与EPSs 生物合成的基因族被克隆和鉴定,其中包括参与G -菌的EPSs (诸如xanthan ,acetan ,sphingan S 288等)合成的基因族,以及参与

G +菌诸如LAB 的EPSs 合成的基因族。有些基因族具涉及

特殊核苷酸糖合成的基因,所有基因族具编码特异糖基转移酶的基因,参与聚合和输出过程的基因(图2)

参与xanthan 生物合成的G um 蛋白由Xanthomonas

campestris pv 1Cam pestris 染色体上16kb gum BC DEFG HI J K LM 基

因簇编码[3]。Sphingomonas strain S88中指导sphingan S 288合成的基因族为29ku ,包含sphingan S 288生物合成,装配以及分泌所必需的所有基因[20]。由于LAB 产生的EPSs 在食品工业的广泛应用,及其在其它领域潜在的应用前景,因而有关LAB 的EPSs 遗传学研究发展极为迅速。常温LAB (如

L 1lactis subsp 1cremoris 和Lactococcus lactis subsp 1lactis ),EPS

的产生通常与一质粒相关,而嗜热LAB (如S 1thermophilus )产生EPS 与质粒的存在无关,所以,合成EPS 所需的基因位于染色体上。Lactococcus lactis strain NIZ OB40的EPS 产生与一个大小为40ku 质粒直接相关,基因簇含14个基因

epsABC DEFG HI J K,位于一大小为12ku 的区域。利用eps 基

因簇的糖基转移酶基因的同源和异源表达确定了EPS 重复单元三糖链的装配顺序,E psD 是引发糖基转移酶,所谓引发糖基转移酶是连接重复单元中的第一个糖基到脂载体的

G TF 。通常,引发G TF 在G +菌中是高度同源的,而其它的G TFs 通常具特异性或具很小的同源性。E psD 将葡萄糖212

磷酸从UDP 2葡萄糖连到脂载体上,E psE 和E psF 将葡萄糖从UDP 2葡萄糖连到连接在脂载体上的葡萄糖上,E psG 将半

乳糖从UDP 2半乳糖连接到与脂载体连接的纤维二糖,而且

E ps J 可能是作为半乳糖磷酸转移酶参与EPS 的生物合成或

73药物生物技术第9卷第6期

作为另一种酶将主链多糖从脂载体上释放出来[21～23]。进一步对eps 基因产物进行同源性分析推测它们的功能分别

为:调节(E psR ),聚合和输出(E psA ,E ps B ,E psI ,E psK ),寡糖重复单元的生物合成(E psD ,E psE ,E psF ,E psG,E psF )

。

Fig 2　G ene clusters inv olved in EPS biosynthesis

通过T 916致突变作用结合鉴定EPS 突变株的平板分析实验,从Streptococcus thermophilus S fi6基因组文库分离到一段15125ku 的DNA 片段,包括15个阅读框。其中一大小为14152区段编码epsA 2epsM13个基因,直接负责EPS 的合成和分泌[24]。根据同源性分析和基因中断实验的结果,这

13个基因可分为4个功能区(图2):一个含4个基因的中心

区(epsE ,epsF ,epsG,and epsI ),其基因产物与糖基转移酶具同源性。酶的底物特异性研究结果表明,E psE 催化EPS 重复单元生物合成的第一步反应,即具磷酸半乳糖基转移酶活性并将半乳糖转移到脂载体上。E psG 催化第二步反应,将α2N 2乙酰半乳糖胺转移到β2半乳糖苷,该EPS 由等摩尔的半乳糖(G alactose ,G al ),葡萄糖(G lucose ,G lc ),和N 2乙酰半乳糖胺(N 2acetylgalactosamine ,G alNAc )组成,这表明epsF 编码分歧半乳糖基转移酶。epsI 可能编码β21,32葡萄糖基转移酶,E psE 与磷酸糖基转移酶具同源性。E psF 和E psG 显示出α2糖基转移酶的主要结构特征,α2糖基转移酶属于糖基转移酶的第四家族,它们在系统进化中保守。位于中心区两侧与负责聚合和输出的酶具同源性的两个区(epsCH 和epsD 负责控制链长,epsK 和epsM 负责输出,eps J 负责

EPS 重复单元的聚合)。由该基因簇开始端厮因(epsA )推测

出的蛋白与一调节蛋白具有同源性[25]

。有意思的是,整个

遗传结构与N 1meningitidis 中负责CPS 合成的基因簇的结

构非常相似[26]。

4　展望

微生物EPSs 的应用潜能主要由其物理学和流变学特性决定,影响这些特性的因素很多,诸如分子量的大小,聚合物的硬度,侧链以及非糖组分的存在,包括有机(例如,

acetyl ,pyruvyl ,或succinyl 基)和无机(例如,sulphate 或phoshate 基)取代。遗传工程可以用来指导EPSs 合成并通

过改变组成和链长来获得或提高符合人们需要的特性。

最近,Ram os 等[27]研究了乳酸乳球菌(Lactococcus alctis )的EPS 产生菌(EPS (+))和非产生菌(EPS (-))的EPS 产生与葡萄糖代谢的相互关系,发现62磷酸葡萄糖是糖酵解和

EPS 生物合成分歧点的关键代谢物,该研究为寻找通过遗

传操作提高EPS 产量的方法提供了线索。然而,有关EPSs 生物合成,分子组成,发酵条件,以及EPSs 形成的动力学研究还相当少,而且,EPSs 产量低而不稳定,它们的下游处理困难。所以,进一步了解微生物EPSs 的化学组成,结构,处理工艺,生物合成,以及产生菌的微生物学,生物化学和遗传学等方面的特征,将有助于改良菌种,提高EPSs 产量。

通过基因工程手段可改造EPSs 重复单元结构或大小,从而改变EPSs 的物理特性,例如,针对那些参与黄原胶侧链合成的特异基因,已经获得多种黄原胶衍生物,这些衍生物的不同在于侧链的乙酰化、丙酮酸化、或截短,它们的粘性相对野生型黄原胶有所提高或降低[28]。又如,通过化学突变的方法产生的Acetobacter xylimum 突变株,其产生的由

1

73王玲燕等:微生物胞外多糖生物合成研究进展

四糖重复单元组成的acetan粘度有所提高[29]。在EPSs产生菌中引入新的或改变原有的糖基转移酶基因,可生成糖基组成不同的聚合物。基因缺失结合糖基转移酶基因的控制表达,可使L1lactis的糖基转移酶基因在其它菌中表达。对Lactobacillus sakeo21随机突变,所得突变株产生糖基组成不同的EPS,其产EPS能力表现出温度依赖性。将S1thermophilus S fi6的eps基因簇克隆到载体上并转入L1lactis MG1363。该菌产生的EPS,其重复单元的N2乙酰半乳糖胺变成了半乳糖,而且糖基侧链缺失。这可能是由于L1lactis产UDP2N2乙酰半乳糖胺能力的丢失,导致骨架上半乳糖而不是N2乙酰半乳糖胺的掺入[25]。这个例子说明聚合和输出机制对新的重复单元仍起作用,其分泌也不受排斥。将黄原胶生物合成基因簇转入Sphingomonas菌,已成功表达出黄原胶。一般来说,应用异源表达主要是因为EPS产量相对提高。改用不同的宿主菌以生产EPSs,可通过替换更为廉价的底物或经济的发酵装置,克服EPSs产生菌诸如专性嗜氧菌X1campestris的通风问题,或使EPSs由食品级宿主诸如LAB原位产生。

参考文献

[1]　Leigh JA,C oplin D L1Ex opolysaccharides in phant2bacterial interac2

tions[J]1Annu Rev Microbiol,1992,46:3071

[2]　Whitfield C,Valvano M A1Biosynthesis and expression of cell2surface

polysaccharides in G ram2negative bacterial[J]1Adv Microbial Physi2

ol,1993,35:1361

[3]　Becker A,K atzen F,Puhler A,et al1X anthan gum biosynthesis and

application:a biochem ical/genetic perspective[J]1Appl Microbiol

Biotechnol,1998,50:1451

[4]　Sutherland IW1N ovel and established applications of m icrobial

polysaccharides[J]1Trends Biotechnol,1998,16:411

[5]　G riffin AM,M orris V J,G ass on M J1The cpsABCDE genes inv olved

in polysaccharide producduction in Streptomyces salivarius ssp1ther2

mophilus strain NCB F2393[J]1G ene,1996,183:231

[6]　G oven JRW,Deretic V1M icrobial Pathogenesis in cysic fibrosis:mu2

cold pseudomonas aeruginosa and Burkhoderia cepacia[J]1Microbiol

Rev,1996,60:5391

[7]　K ulicke W M,Lettau AI,Thielking H1C orrelation between immuno2

logical activity,m olar mass,and m olecular structure of different

(1—>3)2beta2D2glucans[J]1Carbohydr Res,1997,297:1351 [8]　K itazawa H,T oba T,Itoh T,et al1Antitum oral activity of slime

form ing,encapsulated Lactococcus lactis subsp1cremoris is olated

from Scandinavian ropy s our m ick,′viili′[J]1Anim Sci Technol,

1991,62:2771

[9]　K itazawa H,T oba T,T om ioka Y,et al1IFN2and LI21αproduction in

macrophages stium lated with phosphopolisaccharide phoduced by Lac2

tococcus lactis ssp1cremoris[J]1Int J food,Microbiol,1996,31:

991

[10]K itazawa H,Harata T,Uemura J,et al1Phosphate group require2

ment for m itogenic activation of lym phocytes by an extracellular phos2 phopolisaccharide from Lactobacillus delbrüeckil ssp1bulgaricus[J]1 Int J Food Microbiol,1998,40:1691

[11]Nakajima H,Suzuki Y,K aizu H,et al1Cholesteroi2lowing activity

of ropy fermented m ilk[J]1J Food Sci,1992,57:13271

[12]Van K ranenburg R,Boels IC,K leerebezem M,et al1G enetics and

engineering of m icrobial ex opolysaccharides for food:approach for the production of existing and polysaccharides[J]1Current Opinion in Biotechnology,1999,10:4981

[13]Sutherland IW1Biosynthesis and com position of G ram2negative bacte2

rial extracellular and wall polysaccharide[J]1Annu Rev Microbiol, 1985,39:2431

[14]Whiftield C,Valvano M A1Biosynthesis and expression of cellsurface

polysaccharid in G ram2negative bacterial[J]1Adv Microbial Physi2 ol,1993,35:1361

[15]Van K ranenburg R,M arugg JD,Van S wamⅡ,et al1M olecular

characterization of the plasm id2encoded eps gene cluster essential for ex opolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis[J]1Mol Micro2 biol,1997,24:3871

[16]Cerning M J1Ex ocellular polysaccharide produced by lactis acid bacte2

ria[J]1FEMS Microbiol Rev,1990,87:1131

[17]M orona J K,M orona R,Paton JC1Characterization of the locus en2

coding the S treptomyces pneum oniae type19F capsular polysaccharide biosynthetic pathway[J]1Mol Microbiol,1997,23:7511

[18]Mu oz R,M ollerach M,López R,et al1M olecular organization of

the genes required for the synthesis of type1capsular polysaccharide of S treptomyces pneum oniat:formation of the binary encapsulated pneum ococci and identification of crytic DT DP2rhamnose biosynthesis genes[J]1Mol Microbiol,1997,25:791

[19]Sau S,Sun J,Lee CY1M olecular characterization and transcriptional

analysis of type1capsule genes in S taphylococcus aureus[J]1J Bacteriol,1997,179:16141

[20]Y amazaki M,Thorne L,M ikolajczak M,et al1Linkage of genes es2

sential for synthesis of a polysaacharide capsule in Sphingomonas strain S88[J]1J Bacteriol,1996,178:26761

[21]Van K ranenburg R,Van S wamⅡ,M arugg JD,et al1Ex opolysac2

charide biosynthesis in Lactococcus lactis NIZ O B40:function analy2 sis o the glycosyltrans ferase genes inv olved in synthesis of the polysac2 charide backbone[J]1J Bacteriol,1999,181:3381

[22]Van K ranenburg R,V os HR,Van S wamⅡ,et al1Function analy2

sis of the glycosyltrans ferase genes from Lactococcus lactis and other

G ram positive cocci:com plementation,expression,and diversity[J]1

J Bacteriol,1999,181:63471

[23]van K ranenburg R,K leerebezem M,de V os W M1Nucleotide se2

quence analysis of the lactococcal EPS plasm id pNZ4000[J]1Plas2 mid,2000,43(2):1301

[24]S tingele F,Neeser JR,M ollet B1Identification and characterization

of the eps(ex opolysaccharide)gene cluster from Streptococcus ther2 mophilus S fi6[J]1J Bacteriol,1996,178:16801

[25]S tingele F,Vincent S JF,Faber E J,et al1Introduction of the ex2

273药物生物技术第9卷第6期

opolysaccharide gene cluster from S treptococcus therm ophilus S fi6into

Lactococcus lactis MG 1363:production and characterization of an al 2

tered polysaccharide [J]1J Bacteriol ,1999,32:12871

[26]S tingele F ,Newell JW ,Neeser JR 1Unraveling the function of glyco 2

syltrans ferases in Streptococcus thermophilus S fi6[J]1J Bacteriol ,1999,181(20):93541

[27]Ram os A ,Boels IC ,de V os W M ,Santos H 1Relationship between

glycolysis and ex opolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis

[J].Appl Environ Microbiol ,2001,67(1):331

[28]Hassler RA ,D oherty DH 1G enetic engineering of polysaccharide

structure :production of xanthan gum in xanthomonas campestris [J]1

Biotechnol Prog ,1998,6:1821

[29]Ridout M J ,Brownsey G J ,M orris V J ,Cairns P 1Physicochem ical

characterization of anacetan variant secreted by Acetobacter xylinum strain CR1/4[J]1Int J Biol Macromol ,1994,16:3241

R esearch Progress in Microbial Exopolysaccharides Biosynthesis

WANGLing 2yan ,Li Y uan

(Institute o f Medicinal Biotechnology ,Chinese Academy o f Medical ,Beijing 10050)

Abstract ex opolysaccharides (EPSs )are used in many aspects ,such as the food industry and medicine ,etc 1In recent years ,significant progress has been made in the genetic engineering of EPSs biosynthesis and s ome gene clusters inv olved in the biosynthesis pathways have been characterized 1The EPSs will have m ore prosperous aplication 1K ey w ords Microbial ex opolysaccharides ,Biosynthesis ,G ene cluster

中美科学家联合发现少数人不得艾滋病的秘密

来自美国和中国的科研人员近日在《科学》杂志上共同撰文宣布,部份人体内存在一种能阻止艾滋病

发作的特殊蛋白质。这个新发现有可能帮助人类找到有效治疗艾滋病的方法。目前全世界有大约5000万人感染了艾滋病毒,但从80年代中期以来,科学家发现,约有2%的病毒携带者竟然终身没有发展成艾滋病,成为“长期存活的病毒携带者”。这一现象表明,部分人对艾滋病毒具有先天的免疫力。

最近,研究人员将“未发病者”和“发病者”的免疫细胞进行对比研究后发现,凡是那些能“免遭艾滋病侵犯的人”,其体内都有一组名叫做alpha -defensins 的蛋白质。正是这种物质对其血液中的所有种类的艾滋病病毒都产生了重要的抑制作用。当科研人员将这种蛋白从免疫细胞中分离后,艾滋病立刻就“焕发了青春”并开始大量复制。不过,研究同时发现,人工合成的同类蛋白对病毒的抵抗力只有人体自然生成物的10-20分之一。

主持本次研究的华人科学家张林其博士认为,这一成果意义重大,能帮助我们了解人体是如何同艾滋病战斗的。有关专家同时指出,如何提高人工合成物质的抗病毒效力将成为下一步研究的主攻方向。科学家指出,通过了解某些人的身体如何能抵御艾滋病病毒侵犯,完全可以找到治疗艾滋病的新方法。虽然艾滋病药物疗法目前尚无法替代,但最终通过激发人体自身的免疫力来对付艾滋病毒的方法将并非“天方夜谭”。

3

73王玲燕等:微生物胞外多糖生物合成研究进展