蔗糖合成

植物蔗糖合成的分子机制

司丽珍 储成才

*

(中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101)

摘要 高等植物中,光合同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库运输的。近十几年来,随着生物技术的发展,许多与碳水同化产物代谢有关的基因已经被分离,同时多种植物遗传转化体系的建立使在植物中改变基因活性成为现实,对转基因植株的生理生化分析进一步增加了植物中对碳水同化产物合成、分配、运输以及利用等方面的认识。本文就CO 2固定,同化产物分配,蔗糖合成三个方面介绍近年来利用基因工程对植物源活性调控及改善的研究进展。

关键词 植物 碳水同化产物 蔗糖 源活性修回日期:2002 07 16

*通讯作者,电子信箱:ccc hu@https://www.wendangku.net/doc/079823615.html,

在高等植物中,原初同化产物一部分在叶绿体中转化为淀粉,另一部分则以三碳糖的形式输送到细胞质用于蔗糖的合成及其它代谢。植物中同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库输送的,因此在分子水平上研究植物碳水同化产物在源器官的分配以及蔗糖的合成对于改善源的供给能力,进一步阐明源 库关系的机理起着举足轻重的作用。

近十年来,在鉴定影响光合作用两大同化产物蔗糖和淀粉分配的关键步骤上人们已做了很多工作,蔗糖在细胞质中的合成途径已经研究清楚(图1)。利用转基因技术,对于调控碳水化合物代谢的关键步骤进行操作,既可以反义抑制内源基因的表达,又可以过量表达一个内源基因或者外源基因,都能对碳水化合物的分配进行人为的改变。本文重点放在对植物源活性的调控上,包括三个方面:(1)C O 2在叶绿体中的固定;(2)同化产物从叶绿体输向细胞质;(3)蔗糖在细胞质中的合成。

植物在进行光合作用时,在叶绿体内形成磷酸丙糖,磷酸丙糖一部分从叶绿体通过专一载体 磷酸丙糖 Pi 转运器与Pi 对等交换而转移到细胞质,在细胞质中经过一系列的酶促反应合成蔗

糖,另一部分磷酸丙糖则在叶绿体内参与淀粉的合成。

1 同化产物在叶绿体中的合成

植物的光合速率一方面取决于光强,二氧化

碳浓度等因素,另一方面也受参与卡尔文循环(Calvin circle)的各种酶的活性、原初同化产物的分配、碳水同化产物的运输及在库器官的利用等自身代谢的影响。

C O 2的固定是通过卡尔文循环实现的。它可以分为三个部分,(1)、由1,5二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶(ribulose 1,5 bisphosphosphate carboxylase oxygenase,简称RubisCO)催化产生3 磷酸甘油酸的羧化反应;(2)、3 磷酸甘油酸的还原反应;(3)、产生二氧化碳接受体的反应。RubisCO 是在CO 2固定过程中,进行光合碳同化的关键性酶和限速酶,参与了光合作用和光呼吸两个过程,调节两者之间的关系,对净光合速率起着决定性的作用。此酶的重要性又体现在它在植物可溶性蛋白中含量最高,占50%左右。利用反义技术,在烟草中降低RubisC O 小亚基的表达,当RubisC O 含量降到野生型的60%时,光合效率仅仅下降了6%,尽管RubisCO 含量降低了40%,但处于活化态的比例升高了,所以光合效率变化并不明显;然而当下降到50~20%时,光合效率显著下降。RubisC O 活性的降低导致卡尔

第23卷第1期

中 国 生 物 工 程 杂 志

J OURNAL OF C HINESE BIOTEC HNOLOGY

2003年1月

图1 蔗糖在细胞质中的合成

文循环中其它的酶活性也有所下降[1]。虽然在光强较弱时,RubisC O的调节功能并没有表现出来,但在高光强下,RubisC O的活性是光合速率的限制因素之一,RubisCO蛋白含量的降低导致氮 碳比的升高,在叶片中大量积累氮[2]。在转基因植株中,随着RubisCO蛋白含量的降低,类胡萝卜素、叶绿素含量也随之降低;Chl a/Chl b的比例以及质体的超微结构都没有改变,这说明RubisCO蛋白含量的降低没有影响类囊体膜的结构。在RubisCO蛋白含量显著降低的植物中,光合效率显著降低,但光敏感性有所增加[3]。以上结果说明此酶与光合速率很有关系,但为了更好地了解卡尔文循环对植物生长的影响,降低此循环中其它酶的活性也会很有意义。

叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶是卡尔文循环的关键酶之一,它参与产生二氧化碳接受体的反应。此酶在叶绿体中催化1,6 二磷酸果糖生成6 磷酸果糖,6 磷酸果糖不仅参与卡尔文循环,也参与在叶绿体中淀粉的合成。在35S启动子的控制下,把此基因的反义序列转入烟草中。当转基因植物中的酶活性降到野生型的10%时,植株的生长严重受阻,在高光强和二氧化碳饱和的情况下,光合速率下降了90~95%,叶绿体含量降了58%,叶片发黄。随着转基因植物中酶含量的增加其光合速率也随之提高,当转基因植株中的酶活性增加到野生型的40%时,光合速率与对照相比仅仅下降20%,植株性状的变化就不再明显。但在低光强的情况下,转基因植株光合速率与野生型相比,没有明显的变化。对转基因植物中碳水化合物含量的分析表明,当酶活性降到10%时,叶片中碳水化合物的总量仅仅为对照的25%,且碳水化合物的分配也显著改变,可溶性碳水化合物与非溶性碳水化合物的比值在转基因植株中提高了2 8倍[4]。

在表达反义细胞质型醛缩酶的转基因马铃薯中,醛缩酶的mRNA和蛋白含量均有降低, Rubisco的活性有所增加,磷酸核酮糖激酶的活性略有降低,但景天庚酮糖 1,7 二磷酸酶与叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶的活性显著下降。随着转基因植株中酶活性的下降,光合速率也随之降低,当酶活性下降10%时,光合速率下降15%,植株性状变化不大,当酶活性降到低于野生型的60%,生长开始表现出异常,然而当酶活性下降85~90%时,生长严重受阻,根系形成缓慢,叶绿素和可溶性蛋白的含量均降低;酶活性继续降低,植株不能在温室生长,但可以长在培养基中,

12中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷

这可能是因为培养基可以提供生长所需的糖分。在转基因植物中,淀粉含量下降很多,但蔗糖含量没有明显变化[5]。

2 同化产物输出叶绿体

在光合反应中,磷酸丙糖代表卡尔文循环的净光合产物,仅仅六分之一的磷酸丙糖可以从循环中出来或者参与叶绿体其它的反应,例如淀粉形成,脂肪合成等,或者被输送到细胞质中用于蔗糖、氨基酸等的合成。叶绿体与细胞质的物质交流对于调节光合速率以满足植物组织对光合产物的需求起重要作用,这一过程是通过叶绿体的质膜系统来完成的。在叶绿体的内膜上,有一特异的磷酸丙糖转运载体(triose phosphate translocator,TPT)来负责磷酸丙糖的运输。菠菜中,这一29kDa的TPT占整个叶绿体内膜蛋白的15%。磷酸丙糖从叶绿体的输出同时伴随无机磷酸(Pi)的交换,即无机磷酸从细胞质进入叶绿体。当无机磷缺乏时,就会抑制磷酸丙糖的输出,从而使磷酸丙糖转化为淀粉贮存在叶绿体中。磷酸丙糖转运载体蛋白是由核基因编码的,其c DNA序列已从几种植物中分离出来,序列比较证明在马铃薯、花生和菠菜中具有很高的同源性[6~8]。TPT主要在绿色组织中表达并且其表达受光影响。

为了研究TPT的功能,其cDNA序列被反向克隆到35S启动子下,转入马铃薯中,转基因植物中TPT的mRNA与蛋白质含量均降低,当TP T 的活性降低20~30%时,植株出现矮化现象,光合作用下降。这些数据说明TPT的活性是光合速率大小的一个限制因素。在二氧比碳充足的情况下,虽然TP T活性的降低没有抑制光合效率,但显著地影响碳水化合物在叶绿体和细胞质的分配,磷酸丙糖由叶绿体的输出受阻,造成淀粉积累[9]。

Heineke等(1994)在转TP T反义序列的马铃薯叶绿体基质中发现磷酸丙糖含量增加,无机磷含量下降,同时伴随着细胞质中磷酸丙糖和6 磷酸葡萄糖含量的降低,因而造成蔗糖和氨基酸在细胞质中的合成受阻。在野生型中,大约43%的同化产物被用于合成淀粉;然而在转基因植株中,61~89%的同化产物转化为淀粉。在夜间,野生型75%的淀粉又被转化为磷酸丙糖输出叶绿体,而转基因植株把淀粉输出的比例与白天相比要高一些,这可能是为了弥补细胞质中磷酸丙糖的不足。尽管蔗糖和氨基酸的含量没有大的变化,但蔗糖和氨基酸的合成速率均下降:这必然导致同化产物从源向库的供应降低。同时离体实验也证明,TPT的活性降低20~30%就会改变碳水同化产物的分配,造成淀粉在叶绿体中积累,磷酸化中间产物含量下降,同时也会抑制光合速率,这表明增加TPT的活性是改变碳水同化产物分配的一条途径。因此,增加TPT的活性,就有可能增加蔗糖的合成,从而增加源的活性[10]。

3 蔗糖在细胞质中的合成

磷酸丙糖从叶绿体中运出之后,在细胞质中参与氨基酸、脂肪酸和蔗糖的合成反应。在多数植物中蔗糖是碳水同化产物运输的主要形式。蔗糖在细胞质中合成的主要限速酶是细胞质中1,6 二磷酸果糖酶和磷酸蔗糖合成酶,前者与6 磷酸果糖激酶和焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶共同调控1,6 二磷酸果糖向6 酸酸果糖的转化;后者催化蔗糖合成的最后一步。因此在细胞质中增加蔗糖合成的途径之一就是通过打破这些反应的平衡,使反应向增加蔗糖合成的方向移动来实现。

3 1 焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶

(pyrophosphate:fructose 6 phosphate

phosphotransferase,PFP)

细胞质中蔗糖合成的主要限速步骤之一是果糖1,6二磷酸(FBP)向果糖6 磷酸(F6P)之间的转化反应。这个反应可被三个酶调控,分别是:控制顺向反应的果糖1,6 二磷酸酶(FBPase),控制逆向反应的6 磷酸果糖激酶(PFK),以及既可催化顺向反应也可催化逆向反应的焦磷酸:果糖 1,6 二磷酸磷酸转移酶(PFP)。

早在1990年,Carlisle等就已从马铃薯中克隆出编码焦磷酸:1,6 二磷酸果糖转移酶 , 亚基的cDNA序列。通过在马铃薯中表达 , 亚基的反义序列,可使PFP的活性在块茎中降低70~ 90%;尽管转基因植物的表现型、生长速率和块茎产量都没有改变,但是在块茎中淀粉的含量比

13

第1期司丽珍等:植物蔗糖合成的分子机制

野生型降低20~40%。由于PFP蛋白含量的降低,导致PFP的激活剂2,6 二磷酸果糖的含量提高了2~5倍;焦磷酸的含量没有显著变化,表明PFP在调节细胞质中焦磷酸库(pyrophosphate pool)的代谢中不起关键作用。同位素标记实验表明PFP主要推动糖酵解的反应,但没有证据证明它控制糖酵解的速度[11]。

在转PFP反义序列的烟草中,叶片基部PFP 的酶活性降低56~95%,叶片顶部则降低87~ 97%,在野生型中叶片基部是顶部的2 5倍。其它酶的活性从叶片某部到顶部也呈现出一定的变化趋势,PFK成降低趋势,2,6 二磷酸果糖含量和叶绿体型1,6 二磷酸果糖酶活性成增加趋势,细胞质型1,6 二磷酸果糖酶的活性基本是一致的。在无光条件下,野生型中2,6 二磷酸果糖的含量在叶片基部与顶部基本一致,光照可以使此糖在叶片顶部含量下降,在叶片基部增加;在PFP活性降低的转基因植物中,无光条件下2,6 二磷酸果糖含量在叶片顶部是野生型的两倍,在叶片基部是野生型的15倍;在光照情况下,叶片顶部2,6 二磷酸果糖的含量与野生型基本一致,但在基部比野生型提高了4倍。同位素标记实验证明,在野生型与转基因植物中,碳的流向与流速都没有改变。这些结果表明,PFP在叶片基部生长细胞中的功能与在顶部成熟细胞中的功能是不同的,在光照下2,6 二磷酸果糖含量的增加、及高的PFP与细胞质型1,6 二磷酸果糖酶活性暗示PFP与蔗糖合成及糖酵解有关。当PFP 的活性降低90%时,植物中碳的流向、叶片和植株生长状况都没有改变,说明PFP表达量的改变对代谢造成的影响可以通过调节2,6 二磷酸果糖的含量来补偿。以上结果也证明PFP酶在控制蔗糖合成的反应中可能不起关键作用[12]。

3 2 细胞质型1,6 二磷酸果糖酶(cytosolic

fructose 1,b bisphosphatase,cyFBPase)

细胞质型1,6 二磷酸果糖酶催化1,6 二磷酸果糖分解为6 磷酸葡萄糖和无机磷酸,与磷酸果糖激酶及焦磷酸:1,6 二磷酸转移酶共同作用,调控蔗糖合成途径中的一个必需单糖的生成[13]。在甜菜叶片中,1,6 二磷酸果糖酶在昼夜循环过程中蛋白质含量变化不大,但酶活性和转录速率在日照即将结束时最高,黎明前夕最低。在发黄的叶片中酶活性,蛋白质及转录产物都没有检测到。另外,此酶在转录水平和翻译水平上都受光的调控[14]。1,6 二磷酸果糖酶在菠菜中的表达和酶活性对光的反应不敏感,无论在光下,还是在暗中,其转录和酶活性都很稳定,且不受光诱导。在菠菜中,此基因既有转录水平的调控,又有翻译水平的调控。另外,其mRNA在发黄的叶片中也被检测到。在幼根中的酶活性很低,但是在老的纤维根中酶活性非常高[15]。

对于水稻中细胞质型1,6 二磷酸果糖酶的表达模式也进行了研究。在叶片和叶鞘中均有1,6 二磷酸果糖酶的转录产物mRNA,在叶鞘中其转录产物在抽穗后增加,在抽穗之前的花序和根中都没检测到转录产物[16]。从以上的研究中可以看出,细胞质型1,6 二磷酸果糖酶基因的表达模式在不同的植物中不尽相同。本实验室分离了水稻细胞质型1,6 二磷酸果糖酶基因上游调控序列,与报告基因构建成植物表达载体,然后转入水稻,证明此基因只在源叶片的叶肉细胞中表达,而在茎、根、库叶片中没有表达,这暗示着1,6 二磷酸果糖酶在植物中与光合作用及蔗糖的代谢有关。

目前已经知道几种植物(例如菠菜,甘蔗,水稻)的1,6 二磷酸果糖酶的cDNA序列[15~17]。马铃薯cyFB Pase的反向cDNA在35S启动子的调控下转入马铃薯,当酶活性降低45%时,代谢产物的浓度、植株的生长情况以及光合速率等都没有显著的变化。但当酶活性低于野生型的20%时,在源叶片中积累3 磷酸甘油酸、磷酸丙糖和1,6 二磷酸果糖;在光源和C O2充足的情况下,光合速率显著下降。用同位素标记法对光合产物流向和流速的分析表明,蔗糖的合成速率降低53~ 65%,淀粉合成仅仅降低18~24%,但源叶片中蔗糖的浓度并没有变化,产量也没有降低[18]。在拟南芥中降低。cyFBPase的表达可导致蔗糖的合成降低,磷酸化中间产物的积累,淀粉合成增加[13]。以上结果表明细胞质型1,6 二磷酸果糖酶在调控蔗糖合成中起重要作用。

3 3 磷酸蔗糖合成酶(sucrose phosphate

synthase,SPS)

磷酸蔗糖合成酶(SPS)是植物中调控蔗糖合成的关键酶之一,SPS催化尿苷二磷酸葡萄糖和

14中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷

6 磷酸果糖生成磷酸蔗糖,这步反应是不可逆的。为了研究SPS过量表达和反义表达对植物的影响,把来自菠菜的两个cDNA序列分别反向克隆到35S启动子下,转入马铃薯。在转基因植物中,SPS的mRNA、蛋白量、酶活性都有下降。在源叶片中,SPS的活性降低了60~70%,导致蔗糖合成降低40~50%,淀粉合成提高34~ 43%,氨基酸的合成也有增加。在转基因植物的所有叶片中,SPS含量的降低导致可溶性糖含量的降低[19]。在拟南芥中降低SPS的表达导致蔗糖合成受抑制,磷酸化中间产物没有积累,碳水同化产物也没有向淀粉合成的方向转移,但可溶性糖含量和蔗糖的运出速度降低[13]。

从以上实验中,可以推测增加源叶片中蔗糖合成的方法之一就是增加SPS蛋白的含量。由于SPS已被从玉米[20],菠菜[21]等,在番茄中过量表达玉米的SPS,转基因株中SPS蛋白比野生型提高3~7倍[22],马铃薯和烟草中过量表达菠菜的SPS,SPS蛋白提高2~3倍[19]。蔗糖合成在转基因番茄中略有增加,但在转基因烟草中没有变化。对SPS蛋白的分析表明,在转基因植物中过量表达的SPS蛋白处于非活化状态,这可能与翻译后对蛋白的修饰有关。处于活化态的SPS与蛋白总量成负相关。Laporte等的研究表明,当由rbcs启动子控制SPS基因在番茄中表达,造成产量下降,但把启动子换成35S时,转基因植株的产量明显增加。进一步的研究证明产量的增加并不是因为SPS的组成性表达造成的,而是由于35S启动子的活性比rbcS的低造成的,SPS最适的活性为非转基因植株的两倍。较低量的表达SPS虽然没有增加净光合速率,但可以改变碳水化合物在蔗糖、淀粉以及氨基酸的分配比例;过量表达SPS造成植物氨基酸合成的降低,这也可能是导致产量降低的原因[23]。

3 4 在植物中表达细菌的无机焦磷酸化酶

(inorganic pyrophosphatase,PPa)

细胞质中蔗糖合成的主要限速步骤之一是果糖1,6二磷酸(FB P)向果糖6 磷酸(F6P)之间的转化反应。在无机磷酸存在时PFP催化FBP 的脱磷反应而形成F6P和无机焦磷酸(PPi)。在蔗糖合成反应中由葡萄糖1磷酸(GlP)到UDP 葡萄糖转化反应也释放出PPi。因此根据化学平衡原理,通过表达外源焦磷酸水解酶不断去除细胞质中的焦磷酸(PPi)将会刺激细胞质中反应向蔗糖合成的方向进行,同时也为磷酸丙糖向细胞质转移提供了充足的交换体 无机磷酸。这一理论在转基因烟草和转基因马铃薯植物实验中得到了证实。

为了提高碳水同化产物向蔗糖的分配率,大肠杆茵(E.coli)的PPa基因被克隆到35S启动子下转入马铃薯和烟草,Northern杂交证明在转基因植物中存在此PPa的转录产物。与野生型相比,转基因植株源叶片中可溶性糖与淀粉的比例增加了3~3倍。在转基因烟草的源叶片中,葡萄糖含量提高68倍,果糖提高24倍,蔗糖提高12倍,淀粉提高8倍;这一结果没有在马铃薯中出现,在马铃薯中碳水同化产物分配的改变是因为蔗糖提高了2倍,淀粉含量降低造成的。转基因的植株矮化,节间变短,无机焦磷酸(PPi)的含量下降,老叶片中可溶性糖的含量是野生型的100倍。造成转基因植株矮化的原因推测可能是由于35S启动子是组成性表达的,在转基因植物的维管束中表达PPa造成焦磷酸含量的下降,而焦磷酸又是蔗糖长距离运输所必需的,焦磷酸的降低造成蔗糖在韧皮部的装载受阻,所以在叶片中大量积累[24]。为了研究这一现象,Lerchl等(1995)用韧皮部特异性启动子rol C调控PPa基因的表达,光合产物在源叶片积累,叶绿素含量下降,植物生长受阻。同时,他们又把来自酵母的蔗糖酶基因在植物中表达,然后把表达蔗糖酶基因的植株与PPa基因植株杂交,得到同时表达蔗糖酶基因与PPa基因的植株,并且发现此类植株的生长恢复正常;对它们后代的分析表明,韧皮部特异性表达蔗糖酶基因能够补偿由PPa基因表达引起的蔗糖运输受阻的问题[25]。

尽管组成性表达PPa基因导致蔗糖运输受阻,植物矮化,但这种方法可以改变光合产物在蔗糖与淀粉的分配,因此如果用叶肉细胞特异性表达的启动子就会避免这一问题,同时又能增加碳水同化产物向蔗糖的转化。本实验室在近三年来,从水稻中克隆出叶肉细胞特异性表达的启动子,并用其来控制焦磷酸化酶在水稻中的表达。对转基因植株的初步分析表明,蔗糖,葡萄糖的含量与对照相比没有变化,但淀粉含量却显

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第1期司丽珍等:植物蔗糖合成的分子机制

著降低,因而蔗糖/淀粉的比例在转基因植物中比对照高3~4倍;焦磷酸化酶的活性比野生型高2~3倍,细胞质1,6 二磷酸果糖酶的活性略微有点升高,磷酸果糖激酶,腺苷二磷酸葡萄糖酶的活性与对照相比没有变化。转基因植株与野生型在形态上没有显著差异,转基因植株的产量实验正在进行中。这说明光合同化产物向蔗糖的分配比是可以通过在叶肉细胞特异性表达焦磷酸化酶来改变的。

4 问题及展望

进入90年代以来,对于蔗糖的合成过程的认识有了很大突破,同时随着各种植物遗传转化系统的相继建立,使通过基因工程改变源组织中碳水同化产物的分配成为可能。利用基因工程对植物中蔗糖合成关键酶的研究以及调控都取得了可喜的进展。但植物源组织中蔗糖合成的速率只是决定源活性的一方面,另外其它因素,例如光合速率,蔗糖在茎中的转运速率等都影响植物的源活性。因此,对这些因素的协调以及对源 库关系的调控方面还需要进一步的研究,以便能够更好地在植物中操纵碳水化合物的代谢与分配。

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(下转第29页)

16中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷

The Methods of Oriented Immobilized Enzymes and the Activities

of Enzymes Affected by Oriented Immob ilizatiom

Cao Liming Chen Huanlin

(College of Materials and Chemical Engineeri ng ZheJiang Universi ty Hangzhou 310027)

Abstract To increase stabilities of enzymes,they are immobilized to carrier through the numerous lysine residues,but the activities of immobilized enzymes are significantly decreased largely due to different orientations of the enzyme with respec t to the carrier or to multiple point attachment.To circumvent this difficulty,site specific immobilization of the enzymes with the ac tive site directed away from the membrane is essential.Our paper re vie ws several methods of oriented immobilization of enzymes and compared with the ac tivities of oriented and random immobilized enzymes.We also narrate the analysis of active site of enzymes through electron paramagnetic resonance(EPR).

Key w ords Immobilization enzymes Oriented immobilization Site specific immobilization Electron paramagnetic resonance(EPR)

(上接第16页)

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2001,212:817~822

[24]Sonnewald U.Expressi on of E .coli inorganic pyrophosphatas e in

transgenic plants al ters photoas similate partitioning.Plant J,1992,2:571~581

[25]Kei th B,Chua N H.Monoc ot and dicot pre mRNAs are

proces sed wi th different efficiencies in transgenic tobacco.EMBO J,1986,5:2419~2425

Manipulation of Sucrose Synthesis in Transgenic Plants

Si Lizhen Chu Chengcai

(Ins ti tute of Genetics and Devel opmental Biology CAS Beijing 100101)

Abstract Sucrose is the main form of assimilated carbon to be transported from source !to sink !tissues in higher plants.During last decade,many genes involved in carbonhydrate metabolism have been isolated,and the development of efficient transfor mation system for most crop plants has allowed the c reation of transgenic plants that are altered by the activity of individual genes.The physiological analysis of these transgenic plants greatly increases our understanding of the processes of photoassimilates biosynthesis,partitioning,translocation,and allocation in higher plants.This review aims to focus on the current knowledge in the area of the CO 2fixation,partitioning,and sucrose biosynthesis,and the improvement of source strength by molecular technology.

Key words Plant Carbonhydrate Sucrose Source strength

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第1期

曹黎明等:酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响

蔗糖合成

植物蔗糖合成的分子机制 司丽珍 储成才 * (中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101) 摘要 高等植物中,光合同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库运输的。近十几年来,随着生物技术的发展,许多与碳水同化产物代谢有关的基因已经被分离,同时多种植物遗传转化体系的建立使在植物中改变基因活性成为现实,对转基因植株的生理生化分析进一步增加了植物中对碳水同化产物合成、分配、运输以及利用等方面的认识。本文就CO 2固定,同化产物分配,蔗糖合成三个方面介绍近年来利用基因工程对植物源活性调控及改善的研究进展。 关键词 植物 碳水同化产物 蔗糖 源活性修回日期:2002 07 16 *通讯作者,电子信箱:ccc hu@https://www.wendangku.net/doc/079823615.html, 在高等植物中,原初同化产物一部分在叶绿体中转化为淀粉,另一部分则以三碳糖的形式输送到细胞质用于蔗糖的合成及其它代谢。植物中同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库输送的,因此在分子水平上研究植物碳水同化产物在源器官的分配以及蔗糖的合成对于改善源的供给能力,进一步阐明源 库关系的机理起着举足轻重的作用。 近十年来,在鉴定影响光合作用两大同化产物蔗糖和淀粉分配的关键步骤上人们已做了很多工作,蔗糖在细胞质中的合成途径已经研究清楚(图1)。利用转基因技术,对于调控碳水化合物代谢的关键步骤进行操作,既可以反义抑制内源基因的表达,又可以过量表达一个内源基因或者外源基因,都能对碳水化合物的分配进行人为的改变。本文重点放在对植物源活性的调控上,包括三个方面:(1)C O 2在叶绿体中的固定;(2)同化产物从叶绿体输向细胞质;(3)蔗糖在细胞质中的合成。 植物在进行光合作用时,在叶绿体内形成磷酸丙糖,磷酸丙糖一部分从叶绿体通过专一载体 磷酸丙糖 Pi 转运器与Pi 对等交换而转移到细胞质,在细胞质中经过一系列的酶促反应合成蔗 糖,另一部分磷酸丙糖则在叶绿体内参与淀粉的合成。 1 同化产物在叶绿体中的合成 植物的光合速率一方面取决于光强,二氧化 碳浓度等因素,另一方面也受参与卡尔文循环(Calvin circle)的各种酶的活性、原初同化产物的分配、碳水同化产物的运输及在库器官的利用等自身代谢的影响。 C O 2的固定是通过卡尔文循环实现的。它可以分为三个部分,(1)、由1,5二磷酸核酮糖羧化酶 加氧酶(ribulose 1,5 bisphosphosphate carboxylase oxygenase,简称RubisCO)催化产生3 磷酸甘油酸的羧化反应;(2)、3 磷酸甘油酸的还原反应;(3)、产生二氧化碳接受体的反应。RubisCO 是在CO 2固定过程中,进行光合碳同化的关键性酶和限速酶,参与了光合作用和光呼吸两个过程,调节两者之间的关系,对净光合速率起着决定性的作用。此酶的重要性又体现在它在植物可溶性蛋白中含量最高,占50%左右。利用反义技术,在烟草中降低RubisC O 小亚基的表达,当RubisC O 含量降到野生型的60%时,光合效率仅仅下降了6%,尽管RubisCO 含量降低了40%,但处于活化态的比例升高了,所以光合效率变化并不明显;然而当下降到50~20%时,光合效率显著下降。RubisC O 活性的降低导致卡尔 第23卷第1期 中 国 生 物 工 程 杂 志 J OURNAL OF C HINESE BIOTEC HNOLOGY 2003年1月

三氯蔗糖基本介绍及合成方法简介

三氯蔗糖 氯蔗糖是以蔗糖为原料经氯代而制得的一种非营养型强力甜味剂，其化学名4，1’，6’—三氯—4，1’，6’—三脱氧半乳型蔗糖，是一种白色粉末状产品，极易溶于水（溶解度28.2克，20oC），水溶液澄清透明，其甜度是蔗糖的400～ 800倍。 1.三氯蔗糖的合成方法 三氯蔗糖是将蔗糖分子中位于4、1’和6’三个位置上的羟基用氯原子取代而得。蔗糖分子中一共有8个羟基，要将其中特定位置上的3个羟基通过选择性氯化而取代，而其它位置上的羟基不发生变化，当然是很困难的，又因为各个位置上的羟基的反应活性大小不一，使得三氯蔗糖的合成更为困难。目前三氯蔗糖的合成工艺主要有三种。 1.1化学合成法 这是Tate & Tyle公司于1976年研究成功的方法，它以蔗糖为原料，首先在蔗糖的6，1’和6’三个伯碳位上的羟基三苯甲基化后乙酰化，使蔗糖分子的8个羟基全部反应，然后脱去三苯甲基基团形成五乙酰基蔗糖，接着将4位上的乙酰基迁移到6位上，再进行氯化，最后脱乙酰基而得到三氯蔗糖。 1.2化学－酶合成法 化学－酶法合成三氯蔗糖，是采用了6位上的基团保护法，它以葡萄糖和蔗糖为原料，首先葡萄糖发酵生成葡萄糖—6—乙酸，然后经层析分离提纯后与蔗糖一起在酶的作用下生成蔗糖—6—乙酸，再经氯化得到三氯蔗糖—6—乙酸，最后脱去乙酰基即得到三氯蔗糖。 1.3单酯法 这是近几年备受重视的方法。它是以蔗糖为原料，用化学方法，使蔗糖6位上的羟基生成单酯，即蔗糖—6—酯，再用适当的氯化剂进行选择性氯化而生成三氯蔗糖—6—酯，最后脱去酯基，经结晶提纯即得到三氯蔗糖。 1.4三种方法的比较 上述合成三氯蔗糖的工艺，化学合成法步骤较多，工艺流程复杂。化学－酶法步骤也较多，其中发酵这一步代价较高，且提纯中间产物较为困难，不能采用结晶分离方法，而只能采用层析方法，显然工业生产时成本太高。单酯法只需要三步反应，投资小，收率高，成本低，中间产物易于分离提纯，可采取萃取和结晶的方法，最适宜于工业生产，这是目前合成三氯蔗糖的最理想的工艺。 2.单酯法的合成工艺进展 九十年代开始，单酯法的合成工艺研究活跃，采用不同的反应物和不同的分离方法，产物收率大

材料化学李昆昂蔗糖酯的合成与进展222011316210066

蔗糖酯的合成与研究进展 李昆昂1 （西南大学化学化工学院，重庆市北碚区，400715） 摘要：综述了蔗糖酯的合成方法及工艺的研究进展．并对其应用进行了阐述。 关键词：蔗糖酯；合成；应用 中图分类号: O624.31 文献标志码：A 1引言 蔗糖脂肪酸酯简称蔗糖酯(Sucrose Esters，简称SE)，是一种新型的多元醇型非离子型表面活性剂。其外观为白色至黄褐色的粉末状、块状或无色至微黄色的粘稠树脂状。蔗糖酯的蔗糖部分为亲水基，长链脂肪酸部分为亲油基。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、润滑、渗透、起泡、粘度调节、防老化、抗菌等性能。同时，它还具有无毒、易生物降解等特性。现已被批准作为食品添加剂。蔗糖酯还广泛应用于医药、化工、石油开采、化肥、化妆品、制糖和果蔬保鲜等工业中。我们通常所说的蔗糖酯是单、二、三酯组成的混合物。蔗糖多酯(Sucrose Polyester，SPE)通常指的是三酯以上的蔗糖酯。确切地讲，蔗糖多酯是蔗糖分子中8个羟 1李昆昂(1992-)，男，重庆江津人，材料化学专业2011级本科生。E-mail：2607548771@https://www.wendangku.net/doc/079823615.html,

基有6个以上的羟基发生酯化反应时(即酯化度n=6—8)生成的一类蔗糖酯。多酯具有许多特殊的性质，饱和度和脂肪酸链长都会对其有影响。一般地，多酯在室温下是金黄色透明的油状液体，物理性质类似于食用油酯，其色、香、味均与植物油脂一样，但不被人体内的脂肪酶水解，不产生热量，不会被消化系统吸收，无毒、副作用，是一种理想的脂肪替代品和减肥剂。，还可降低血清中的胆固醇，治疗冠心病[1]。蔗糖多酯化学结构如图 蔗糖酯的熔点范围为50~100℃，温度过高会使蔗糖残基焦糖化而发黑。蔗糖酯在20℃以下水解作用较小，在120℃以下稳定，加热到145℃以上时则容易发生分解。 2蔗糖酯的合成方法 2.1酰氯酯化法 酰氯酯化法是指在催化剂存在下蔗糖和脂肪酸酰氯发生反应生成蔗糖酯。目前，酰氯酯化法有两种：（1)在含氮有机化合物如二甲基甲酰胺(DMF)、氮杂苯、哇琳或吡啶中，使蔗糖和脂肪酸酰氯发生酯化反应生成蔗糖酯。这种方法产率较高，但因需毒性较大的含氮有机化合物作溶剂及吡啶，使该法生产的产品很难达

蔗糖合成酶(SS)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

蔗糖合成酶（SS）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC0580 规格:50T/24S 产品内容： 提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体4mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：粉剂10mg×1支，4℃保存，临用前加1mL水，配制成10mg/mL蔗糖溶液，再将其用蒸馏水稀释为500μg/mL备用； 试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。SS（EC 2.4.1.13）催化植物体内游离果糖和葡萄糖合成蔗糖。 SS催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水 操作步骤： 一、测定样品提取： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定操作表： 1、可见分光光度计预热30min以上，波长调至480nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本3030 蒸馏水150150180 试剂一150 试剂二30 混匀，25℃准确水浴10min 试剂三50505050 沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却 试剂四700700700700 试剂五200200200200 混匀，80℃水浴保温20min，冷却后，吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中，在480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管各只要做一管。每个测定管需要设定一个对照管。 计算△A测=A测定管-A对照管，△A标=A标准管-A空白管。 三、SS活力单位的计算： 1、按照蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS活性(U/mg prot)=（C标准管×V1×△A测÷△A标）÷(V1×Cpr)÷T=50×△A测÷△A标÷Cpr 2、按照样本鲜重计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS活性(U/g鲜重)=｛C标准管×V1×△A测÷△A标｝÷(W×V1÷V2)÷T=50×△A测÷△A标÷W C标准管：标准管浓度，500μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.03mL； V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本鲜重，g；T：反应时间，10min。 3、尽量在30min内完成测定。

旋光度法测定蔗糖酶促蔗糖转化反应的米氏常数实验数据处理

蔗糖α0标准浓度曲线 c α0 矫正 0.5013 22.95 22.89 0.2506 11.45 11.39 0.2005 9.50 9.44 0.1253 5.80 5.74 0.1002 4.95 4.89 0.0000 0.05 -0.01 α∞标准浓度曲线 c α∞矫正 0.5 -5.46 -5.4 0.25 -2.46 -2.4 0.2 -1.81 -1.75 0.125 -1.36 -1.3 0.1 -0.96 -0.9 0 -0.01 0.05

Θ~T 图 0.40.60.8 100 200 300 B A B NewFunction1 (User) Fit of Sheet1 B A A B B Statistics Statistics Value Standard Error Value Standard Error Reduced Chi-Sqr Adj. R-Square 578.35485 424.1007 9 24.81417 308.50034 1287.37815 0.80259 浓度 0.05 时间 旋光度 分钟(min) 秒(s) T(s) α 矫正α θ 2 19 139 2.15 2.10 0.8916 3 5 185 1.60 1.55 0.6971 3 34 214 1.40 1.35 0.6264 3 56 236 1.25 1.20 0.5733 4 36 276 1.15 1.10 0.5379 5 21 321 1.00 0.95 0.4849 6 14 374 0.80 0.75 0.4142

蔗糖酯合成研究进展 综述

蔗糖酯的合成研究进展及应用 李** 西南大学化学化工学院，重庆 400715 摘要：蔗糖酯是一种良好的表面活性剂，有着广泛的用途，它的应用领域还在不断开发；蔗糖聚酯是新型的低热量油脂，可作为脂肪代用品及高血脂、高胆固醇的治疗预防药物。本文介绍了蔗糖酯的性质、合成方法和应用。关键词：蔗糖酯；合成；应用 Progress in research of synthesis and application of sucrose ester LI *-* School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University Chongqing 400715, China Abstract:As a good kind of non-ionic surfactant,sucros esters are used extensively;sucrose polyester is a new kind of low-calorie lipin,which is regarded as fat substitute and medication of high cholesterol.This article introduces propertise,synthetic methods and application of sucrose esters. Key words:Sucrose esters;Synthesis;Application 蔗糖脂肪酸酯简称蔗糖酯( Sucrose Esters, 简称SE) , 是一种新型的多元醇型非离子型表面活性剂。其外观为白色至黄褐色的粉末状、块状或无色至微黄色的粘稠树脂状。蔗糖酯的蔗糖部分为亲水基, 长链脂肪酸部分为亲油基。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、润滑、渗透、起泡、粘度调节、防老化、抗菌等性能。同时, 它还具有无毒、易生物降解等特性。现已被批准作为食品添加剂。蔗糖酯还广泛应用于医药、化工、石油开采、化肥、化妆品、制糖和果蔬保鲜等工业中。 我们通常所说的蔗糖酯是单、二、三酯组成的混合物。蔗糖多酯( Sucrose Polyester, SPE) 通常指的是三酯以上的蔗糖酯。确切地讲, 蔗糖多酯是蔗糖分子中8 个羟基有6 个以上的羟基发生酯化反应时( 即酯化度n= 6~ 8) 生成的一类蔗糖酯。多酯具有许多特殊的性质, 饱和度和脂肪酸链长都会对其有影响。一般地, 多酯在室温下是金黄色透明的油状液体, 物理性质类似于食用油酯, 其色、香、味均与植物油脂一样, 但不被人体内的脂肪酶水解, 不产生热量, 不会被消化系统吸收, 无毒、副作用, 是一种理想的脂肪替代品和减肥剂 , 还可降低血清中的胆固醇, 治疗冠心病,是高附加值产品。 1 蔗糖酯的合成 世界各国科学家研究出了很多种合成方法：从反应方式分有酰氯法、直接脱水法、酯交换法和酶法，从反应状态分有均相法和非均相法，从工艺条件分有溶剂法、微乳化法和无溶剂法等。 1.1 酰氯酯化法

分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。 【实验原理】 蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。 UDPG+果糖---蔗糖+UDP 这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高 （30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。 蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖： UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+ 6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。 一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。 果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。 【实验材料】 植物茎 【仪器设备及设备】 冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），

0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱 【试剂药品】 1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。 2.透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含 2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。 3.酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果 糖,2mmol/LEDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。 4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。 5.2mol/LNaOH 6.30%HCl 7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。 8.1mg/ml蔗糖标准液 【方法步骤】 1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。 2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。 3.蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH 0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCl3.5ml,0.1%间苯二酚1ml，摇匀后于80度保温10min,冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。

三氯蔗糖

三氯蔗糖是以蔗糖为原料经氯代而制得的一种非营养型强力甜味剂，其化学名4，1’，6’—三氯—4，1’，6’—三脱氧半乳型蔗糖，是一种白色粉末状产品，极易溶于水（溶解度28.2克，20oC），水溶液澄清透明，其甜度是蔗糖的400～800倍，三氯蔗糖具有如下优点：（1）水溶液化学稳定性好，高温下甜味不变，而且与食物中的蛋白质果胶等主要成分不起化学反应，在焙烤工艺中甜度更稳定。（2）无毒副作用，在人体内几乎不被吸收，热量值为零，是糖尿病人的甜味代用品。（3）甜味纯正，与蔗糖一样没有不愉快的苦后味和其他怪味，它不被龋齿病菌利用,所以不会引起龋齿。正是基于这些优点，三氯蔗糖是目前食品和医药领域研究开发的热点。本文就笔者所了解的知识，对近年来国内外有关三氯蔗糖的合成工艺与应用研究进展作一介绍和述评，为我国今后在这一领域的研究提供一些参考。 1 三氯蔗糖的合成方法 三氯蔗糖是将蔗糖分子中位于4、1’和6’三个位置上的羟基用氯原子取代而得。蔗糖分子中一共有8个羟基，要将其中特定位置上的3个羟基通过选择性氯化而取代，而其它位置上的羟基不发生变化，当然是很困难的，又因为各个位置上的羟基的反应活性大小不一，使得三氯蔗糖的合成更为困难。目前三氯蔗糖的合成工艺主要有三种。 1.1 化学合成法 这是Tate & Tyle公司于1976年研究成功的方法，它以蔗糖为原料，首先在蔗糖的6，1’和6’三个伯碳位上的羟基三苯甲基化后乙酰

化，使蔗糖分子的8个羟基全部反应，然后脱去三苯甲基基团形成五乙酰基蔗糖，接着将4位上的乙酰基迁移到6位上，再进行氯化，最后脱乙酰基而得到三氯蔗糖。 1.2 化学－酶合成法 化学－酶法合成三氯蔗糖，是采用了6位上的基团保护法，它以葡萄糖和蔗糖为原料，首先葡萄糖发酵生成葡萄糖—6—乙酸，然后经层析分离提纯后与蔗糖一起在酶的作用下生成蔗糖—6—乙酸，再经氯化得到三氯蔗糖—6—乙酸，最后脱去乙酰基即得到三氯蔗糖。 1.3 单酯法 这是近几年备受重视的方法。它是以蔗糖为原料，用化学方法，使蔗糖6位上的羟基生成单酯，即蔗糖—6—酯，再用适当的氯化剂进行选择性氯化而生成三氯蔗糖—6—酯，最后脱去酯基，经结晶提纯即得到三氯蔗糖。 1.4 三种方法的比较 上述合成三氯蔗糖的工艺，化学合成法步骤较多，工艺流程复杂。化学－酶法步骤也较多，其中发酵这一步代价较高，且提纯中间产物较为困难，不能采用结晶分离方法，而只能采用层析方法，显然工业生产时成本太高。单酯法只需要三步反应，投资小，收率高，成本低，中间产物易于分离提纯，可采取萃取和结晶的方法，最适宜于工业生产，这是目前合成三氯蔗糖的最理想的工艺。 2 单酯法的合成工艺进展 九十年代开始，单酯法的合成工艺研究活跃，采用不同的反应物

植物研究进展植物中蔗糖酶的研究进展

植物研究进展植物中蔗糖酶的研究进展司丽珍等:植物中蔗糖酶的研究进展 植物中蔗糖酶的研究进展 司丽珍①储成才② (中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101) 摘要在大多数高等植物中, 蔗糖是碳水同化产物由源向库运输的主要形式。在库中, 蔗糖酶可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖, 以满足植物生长发育中对碳源和能源的需求。本文综述了近年来有关蔗糖酶的一些研究进展, 包括蔗糖酶的分类、基本性质、基因结构、 酶活性的调节以及功能等。 关键词植物, 蔗糖酶, 活性调节, 功能 称为胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶进行反应所需的最 0 引言

植物在叶片中(源组织) 通过光合作用将C O 2固 定成碳水化合物, 然后运向非光合组织(库组织) 。植物大多以非还原性二糖如蔗糖的形式完成碳水同化产物由源到库的运输。在库组织中, 蔗糖被分解为己糖, 为植物生长发育提供碳源和能源。蔗糖分解主要由蔗糖合成酶(EC2. 4. 1. 13) 或蔗糖酶(E C3. 2. 1. 26) 来完成。蔗糖合成酶是一糖基转移酶, 在尿苷二磷酸(UDP ) 存在下把 蔗糖转化为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖。蔗糖酶是一水解酶, 把蔗糖水解为葡萄糖和果糖。蔗糖酶有多种同工酶, 分别处于不同的亚细胞位置, 生化特性也不尽相同[1, 2]。虽然对它们的功能特异性还不太清楚, 但已确知蔗糖酶在植物中主要参与对蔗糖不同利用途径的调节。由于糖在植物中不仅是作为能源, 而且也是基因表达的重要调节物 质之一, 因此蔗糖酶也间接参与细胞分化和植物发育的调控。鉴于此, 蔗糖酶的研究无论在理论上还是在实际上都具有重要意义而备受重视。本文就近年来有关研究进展做一介绍。 适pH 值也有所不同, 由此蔗糖酶又可分为酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶在pH 4. 5至5. 0时催 化效率最高, 因此也称为酸性蔗糖酶。细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最适pH 值为中性或略微偏碱性, 因此称为中性/碱性蔗糖酶。而根据 其溶解性, 蔗糖酶又可分为可溶性蔗糖酶(包括液胞型蔗糖酶和细胞 质型蔗糖酶) 与非溶性蔗糖酶(细胞壁型蔗糖酶) 。

蔗糖酶的提取分离

蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液

蔗糖酯的性能与应用试验

蔗糖酯（SE）的性能及应用 一、SE的水溶性 1 原料：SE－11（生产批号04052143大拿公司），SE－15（生产批号04052003大拿公司），SE－1、SE－3由大拿公司工程部提供。 2 试验方法 取SE 1％，室温32℃，按下列方法溶解： a 加水搅拌溶解 b 加少量水调成糊状，再加水搅拌溶解 c 搅拌中慢慢撒入水中搅拌溶解 d 与等量白糖干混匀，搅拌中慢慢撒入水中搅拌溶解 e 与等量白糖干混匀，加少量水调成糊状，再加水搅拌溶解 f 与等量白糖干混匀，加水搅拌溶解 g 与5倍白糖干混匀，按d法溶解 h 与5倍白糖干混匀，按e法溶解 I 与5倍白糖干混匀，按f法溶解 2 试验结果 a SE-11、SE-15开始有少量不溶，10分钟后完全溶解，溶 液呈浅乳白色，浑浊，pH7.5,放置数小时后浑浊物呈均匀分散入烧杯下部。 b 结果同a c 结果同a d 开始有少量不溶，5分钟后完全溶解其余同a e 结果同a f 结果同d g 结果同a h 结果同a I 结果同a

SE-1、SE-3不溶入水。 不同水温溶解SE-11、SE-15所需的时间（分钟） 大拿公司生产的SE-11、SE-15在常温下水溶性良好，加温溶解速度更快。分散的浑浊物为蔗糖二酯和三酯等混合物。 二、三聚磷酸钠对SE的分散作用 1 试验方法 分别称取1g SE 溶入配好的0.01％、0.05％、0.10％、0.20％、0.30％、0.40％的100ml三聚磷酸钠溶液中，搅拌至完全溶解，同时做空白试验。 2 试验结果 搅拌数分钟后与空白样对比，SE在0.01％、0.05％、0.10％三聚磷酸钠溶液中均完全溶解，无显著区别，在0.2％、0.3％、0.4％三聚磷酸钠溶液中有乳白色沉淀物。 3 结果讨论 SE可以与低浓度的三聚磷酸钠配合使用。

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)试剂盒说明书

货号：MS2505 规格：100管/48样蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）试剂盒说明书 微量法 正式测定管前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的贮存形式之一。SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。 测定原理： 蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰 试剂的组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：液体2mL×1瓶，4℃保存 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：液体6mL×1瓶，4℃保存； 样品测定的准备： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零。 2 下测定各 第1页，共2页

管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。 SPS活力单位的计算： 1、按照蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SPS活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr 2、按照样本鲜重计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SPS活性(μg /min/g鲜重) = C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷W C标准管：标准管浓度，1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL； V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T ：反应时间：10min。 第2页，共2页

蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定

实验四蔗糖合成酶、酸性转化酶、碱性转化酶活力活力的测定 参考 一、实验意义和目的 (2) 二、实验原理 (2) 三、材料、设备与试剂 (3) 四、实验步骤 (3) 1.蔗糖合成酶活性测定实验 (3) 2.转化酶活性测定 (4) 五、实验结果与分析 (4) 1.蔗糖合成酶活性测定.................................................................... 错误!未定义书签。 2.转化酶活性测定............................................................................ 错误!未定义书签。 六、误差分析........................................................................................... 错误!未定义书签。

一、实验意义和目的 蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质，其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响。蔗糖合成酶(SuSy)是植物进行蔗糖代谢的关键酶之一,与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关，在植物的生长发育和代谢活动中具有重要作用。转化酶也是催化蔗糖降解的重要酶类，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，还是控制淀粉合成的关键酶，测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。 通过本实验要掌握三种酶的作用、酶活力测定的原理和方法、学习酶活力的计算方法，了解糖类水解。 二、实验原理 1.蔗糖合成酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖 +UDP 果糖+UDPG。 2.转化酶催化蔗糖的水解反应：蔗糖+H2O—?葡萄糖+果糖。根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶分为两种：一种称为酸性转化酶，主要分布在液泡和细胞壁中，另一类转化酶称为碱性或中性转化酶，主要分布在细胞质中。 黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身 蔗糖合成酶

蔗糖酯

综述：蔗糖酯的合成研究进展 摘要：综述了蔗糖酯的合成方法及工艺的研究进展．并对其反应机理进行了阐述。蔗糖酯的合成方法主要有四种：溶剂法、微乳化法、无溶剂法以及酶催化法。溶剂法采用DMF或DMSO 为溶剂，但是这两种溶剂均有毒，限制了蔗糖酯在食品等行业的应用。徽乳化法采用丙二醇或水代替溶剂法所使用的有毒溶剂，并加人乳化剂，使反应体系近似为均相体系。无溶剂法则是通过在反应体系中加^乳化剂或表面活性剂等使熔融相成均一相，反应平稳。但是一般无溶剂法反应温度教高．反应不易进行，产率低+且产品质量得不到保证。酶催化合成法屉一种新的生物台成方法，采用生物酶代替传统的催化剂合成蔗稀酯．该法催化恬性高、反应条件温和、选择性强、产物易分离等优点。文中还对蔗糖酯粗品的纯化工艺进行了介绍。蔗糖酯是由亲水的蔗糖和亲油的脂肪酸组成的表面鎏然荆。其特有的性质使之能广泛应用于食品、医药、化妆品、洗涤荆等行业。 关键词：蔗糖酯；合成；反应机理；纯化；应用；研究进展 1 蔗糖酯的合成 为了适应工业化生产的低成本、无毒性产品的需要，蔗糖酯的合成方法和工艺路线在不断的改进和发展。蔗糖酯的合成主要经历了三个阶段：溶剂法、乳化法和无溶剂法，酶催化合成法也得到了广泛的应用。 1．1溶剂法 蔗糖酯的合成制备方法始于20世纪50年代，早期的台成方法大多采用二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)作溶剂，碳酸钾为催化剂。改进的溶剂法添加了助溶剂低碳烷基苯，使反应体系成均一相，反应速度加快。溶剂法的优点是产品纯度高，副产物少，缺点是溶剂有毒，易在成品中残留，精制成食品级设备投资大，生产成本高。 1．2微乳化法 微乳化法包括丙二醇酯法和水溶剂法，即用丙二醇和水代替DMF，以脂肪酸皂为乳化剂，碳酸钾为催化剂，将蔗糖和脂肪酸甲(乙)酯经乳化生成微乳进行酯交换反应。此反应的关键足不能破乳，否则会降低产率，而且采用水作溶剂，要防止脂肪酸酯的水解。另外．脂肪酸皂用量较大，一般为15％一30％，反应体系粘度很大，搅拌困难，不利于工业化生产。刘志伟?1在水溶剂的基础上对工艺进行了一定的改进，即在反应初期当蔗糖、皂、水和催化剂成微乳状态后，逐渐升温脱水，当水基本除尽后再向系统加人脂肪酸酯，继而迅速维持较高的真空度和1=|_j应的温度，使得酯化反应顺利进行，可以较好的避免脂肪酸酯的分解。这主要是根据在水溶体系中，当水含量变化时，酯不发生水解的温度和压力存在一个特定的区限，保持在这一区限内可避免酯的水解。 1．3无溶剂法 国外运用无溶剂法合成蔗糖酯，但是反应温度高，蔗糖易结块焦化，使反应不易进行，产率低，且产品质量得不到保证。有人在无溶剂法的基础上进行了改进，提出了两步反应法和一步反应法。两步反应法即将反应分两阶段进行，第一阶段将脂肪酸甲酯与蔗糖在一定条件下生成低酯产物，第二阶段加入过量的脂肪酸甲酯继续反应生成多糖酯，收率以蔗糖计为92％?1。一步法是用蔗糖、脂肪酸甲醋、脂肪酸盐一次完成反应，收率为85％?1。 李祖义等???。独创地加入某种生物表面活性剂，使脂肪酸乙酯、蔗糖与催化剂整个反应体系成为均相无溶剂法合成蔗糖酯。其中生物表面活性剂是鼠李糖或改性的鼠李糖脂、槐糖脂或改性的槐糖脂以及不同配比的鼠李糖或改性鼠李糖与槐糖脂或改性槐李糖脂的混合物。反应压力为10—30mmHg。反应温度为110～145℃，反应时问为I一4h，最终产物蔗糖酯的转化率为50％～55％，达到国际先进水平。这种方法具有反应均匀、温度低、无毒性、成本低、转化率高的特点，可应用于工业生产??。张卫等??在传统工艺的基础上引入反应促进剂sE，使反应在较低温度下由非均相反应变为均相反应，大大加快了反应速度、提高了产品转

转化酶的测定

转化酶的测定 转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。 试剂：1、10%蔗糖溶液 2、葡萄糖标准液（500μg/ml） 3、0.05mol/l的磷酸缓冲液 4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。 2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。 3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定 ①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液： 管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 葡萄糖浓度（μg/ml）0 100 200 300 400 500 在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。 4、结果计算： A=(N-N’)*V/(T*W*1000) A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积 T：反应时间W：材料鲜重

蔗糖酯的合成

蔗糖酯的合成工艺及其应用研究 摘要：蔗糖酯是一种高效乳化剂和表面活性剂，在工业上具有广泛的用途。蔗糖酯在食品工业中可用作乳化剂、发泡剂、黏度调节剂、润滑光泽剂、抗老化剂、润湿与分散剂、抗菌剂；在日化工业中作洗净剂和化妆品；在医药工业中作增溶剂、分散剂、渗透剂、乳化剂、包覆剂、崩解剂等。本文综述了蔗糖酯的典型合成方法及工业用途。 关键词：蔗糖酯表面活性剂溶剂法无溶剂法 蔗糖脂肪酸酯(sucroseester,SE)简称为蔗糖酯,是一种新型的多元醇型非离子表面活性剂, 由蔗糖和正羧酸反应生成的一大类有机化合物的总称,根据蔗糖羟基的酯化数,可以获得由亲油性到亲水性的蔗糖脂肪酸酯系列产品,其HLB(亲水、亲油平衡值)值在216之间。蔗糖酯具有良好的乳化[1]、分散、增溶、润滑、渗透、起泡、粘度调节、防止老化、抗菌等性能;同时,它还具有无毒、易生物降解等特性。联合国粮农组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)分别在1969年和1980年批准蔗糖酯为食品添加剂。目前蔗糖酯已在欧洲、美国及日本等国得到普遍使用。作为一种非离子型表面活性剂, 蔗糖酯的原料来源普遍,价格便宜,具有高HLB,而且其HLB的范围宽,可以广泛应用于食品、医药、化工、石油开采、化肥、化妆品、制糖和果蔬保鲜等工业中。 1.蔗糖酯合成方法 蔗糖酯的合成方法很多,主要方法可以概括为:溶剂法、无溶剂法和酶法三大类。 1.1溶剂法[2] 将蔗糖溶于DMF中,加脂肪酸(一般用硬脂酸)甲酯和催化K2CO3,在减压加热(约1.2*104 Pa和100℃)条件下进行酯交换反应3~5h,同时馏去甲醇,反应结束后除去溶剂和未参与反应的原料,并在乙醇中重结晶后干燥粉碎而成。本法工艺简单,反应条件温和,蔗糖不会焦化,脂肪酸甲酯的转化率高(>95%)。但溶剂DMF价格昂贵、易燃、有毒产品纯化较难,因此随后又出现了由二甲基亚砜(DMS)、苄胺、环己胺等取代DMF的方法。催化剂除K2CO3外,还有硬酯酸钾、KHCO3、NaOH、NaHCO3等。由于甲醇有毒,所以以脂肪酸乙酯、丙二醇酯等代替脂肪酸甲酯。此外,添加助剂如二甲苯的各种同分异构体、乙苯、丙苯、甲乙苯和二乙苯,可使反应时间缩短,催化剂用量减少,皂生成量减少,同时减少了溶剂损失和副反应。因为不能完全除去蔗糖酯中的有毒溶剂DMF,所以食品级蔗糖酯不能用此法合成。 1.2无溶剂法[3] 无溶剂法是通过高温使反应物成为熔融相，蔗糖和脂肪酸酯在熔融相中发生酯化反应。无溶剂法反应温度较高，蔗糖易焦化结块，反应常无法正常进行。硬脂酸乙酯和蔗糖的反应属于可逆反应，为了反应有利于向正方向进行，要不断蒸出反应生成的乙醇，破坏反应的平衡，使酯交换反应趋向完全。降低压力也可促进反应向产物方向进行，加快反应速率，同时有隔绝空气作用，可防止蔗糖氧化，保持反应体系良好的熔融状态。无溶剂法合成蔗糖酯的方法还包括相转移催化法[4]，即利用相转移催化剂在两相界面的特殊运输作用，将反应物从一相运输到另一相，从而使反应顺利进行。刘慧娟等采用相转移催化法以硬脂酸甲酯和蔗糖合成蔗糖酯，温度控制在95~100 ℃就可很好地进行反应。用相转移催化法合成蔗糖硬脂酸甲酯较与其它无溶剂法相比，设备简单，反应在常压和较低温度的温和条件下就可进行，且

蔗糖合成酶的测定方法

蔗糖合成酶的测定方法 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA； 0.2%(W/V)BSA；2%PVP； 0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH 缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入50μL粗酶液， 50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20μL 50 mmol/LMgCI2， 20μL 100mmol/L UDPG， 20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖）， 30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作： 取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）= 式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）； V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml） 淀粉酶活性的测定 1方法 1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。 1.2测定方法 1.2.1酶液的提取 将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL 预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再