(完整版)实验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定

实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。

一、过氧化氢含量的测定

【原理】

H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

【仪器和用具】

研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】

100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。

【方法】

1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min 下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算：

植物组织中H 2O 2含量(μmol/g Fw)=C Vt

FW V ??1

式中 C —标准曲线上查得样品中H 2O 2浓度（μmol ）； V t —样品提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用样品提取液体积（ml ）； FW —植物组织鲜重（g ）。

二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

【原理】

过氧化氢酶（CA T ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

22==R(Fe +3+OH －

)

22O 2==R(Fe +2)2+2H 2O+O 2

据此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H 2O 2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H 2O 2

5H 2O 2+2KMnO 4+4H 2SO 4 5O 2+2KHSO 4+8H 2O+2MnSO 4

即可求出消耗的H 2O 2的量。 【仪器和用具】

研钵；三角瓶50ml ×4；酸式滴定管（10ml ）；恒温水浴；容量瓶25ml ×1。 【试剂】

10% H 2SO 4；0.2mol/L 磷酸缓冲液pH7.8；

0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，用0.1mol/L 草酸溶液标定；

0.1mol/L H 2O 2：市售30% H 2O 2大约等于17.6mol/L ，取30% H 2O 2溶液5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准0.1mol/ KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定；

0.1mol/L 草酸：称取优级纯H 2C 2O 4 ·2H 2O 12.607g ，用蒸馏水溶解后，定容至1L 。 【方法】

1.酶液提取 取小麦叶片

2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml 三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml ，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml ，再加入2.5ml 0.1mol/L H 2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10% H 2SO 4 2.5ml 。

3.用0.1mol/L KMn Ｏ4标准溶液滴定H 2O 2，至出现粉红色（在30min 内不消失）为终点。

4.结果计算：

－

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

酶活(mgH2O2/gFW·min)=().

A B V

FW V t

T

-??

??

17

1

式中A—对照KMnO4滴定毫升数；

B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；

V T—酶液总量（ml）；

V1—反应所用酶液量（ml）;

W—样品鲜重（g）；

1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

【注意】

所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T

????124010?

式中 ?A 240 = A S0－()

A A S S 122+

A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；

0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。 【注意事项】

凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

过氧化氢酶活力的测定实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除过氧化氢酶活力的测定实验报告 篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。 一、过氧化氢含量的测定 【原理】 h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。 【仪器和用具】 研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×

7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。 【试剂】 100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】 1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm波长下比色。 2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管 3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：植物组织中h2o2含量(μmol/gFw)= 式中c—标准曲线上查得样品中h2o2浓度（μmol）；Vt —样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积

过氧化氢酶

过氧化氢酶 过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。 触酶 过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。 来源 几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。 过氧化氢酶历史 作为一种物质，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢（H2O2）的发现者泰纳尔（Louis Jacques Thénard）首次发现。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的分子量。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。而后，1981年，其三维结构得以解析。 功能 过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。 但过氧化氢酶真正的生物学重要性并不是如此简单：研究者发现基因工程改造后的过氧化氢酶缺失的小鼠依然为正常表现型，这就表明过氧化氢酶只是在一些特定条件下才对动物是必不可少的。 一些人群体内的过氧化氢酶水平非常低，但也不显示出明显的病理反应。这很有可能是因为正常哺乳动物细胞内主要的过氧化氢清除剂是过氧化物还原酶（peroxiredoxin），而不是过氧化氢酶。

高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定

高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。 仪器药品 氧电极仪记录仪 电磁搅拌器超级恒温水浴 注射器、微量注射器容量瓶 反应杯亚硫酸钠 过氧化氢酶 50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。 50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。 标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶 (Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液 (pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。 操作步骤 1.仪器的标定 按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。

2.绘制酶活性标准曲线 (1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。 (2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。 (3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。 (5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。 3.样品测定 (1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。 (3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。

试验七过氧化氢酶活力的测定

实验七过氧化氢酶活力的测定 一、实验目的 掌握过氧化氢酶活力测定的原理和方法 二、实验原理 过氧化氢酶（catalase,CAT,EC1.11.1.6）普遍存在于植物的各种组织中，其活力大小与植物的代谢强度和抗寒、抗病能力有一定的联系，故常需进行测定。 过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为： 过氧化氢酶 2H2O2-------------------------2H2O+O2 钼酸铵 H2O2+2KI+H2SO4------------------------I2+K2SO4+2H2O I2+2Na2S2O3-------------2NaI+Na2S4O6 反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。 三、仪器、试剂和材料 1、仪器：天平，研钵，容量瓶，恒温水浴，移液管，三角瓶，滴定管。 2、试剂： （1）0.01mol|L的过氧化氢溶液； （2）1.8mol|L的硫酸溶液； （3）10%钼酸铵溶液； （4）0.02mol|L硫代硫酸钠溶液； （5）1%的淀粉溶液； （6）20%的碘化钾溶液； （7）碳酸钙粉末。 四、操作步骤 1、酶液提取：称取新鲜油麦菜0.25g，剪碎置研钵中，加入0.1g碳酸钙和2mL水研磨成匀浆，用漏斗移入50mL的容量瓶，研钵用少量的水冲洗，冲洗液也一并移入容量瓶中， 然后用水定容。摇荡片刻，静置澄清后吸取20.0mL上清液至100ml容量瓶中，加水定容，摇匀后备用。 2、取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0ml，随即在3号瓶中加入1.8mol|L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol|L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min（必须准确）后立即向1、2号瓶各加5.0mL1.8mol|L硫酸溶液。 3、各瓶分别加入1.0mL20%的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol|L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1%的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。

过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶（POD ）活性测定 【实验原理】 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。 【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中] 【方法步骤】 （1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。 （2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。 表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表 4.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 POD 总活性[u/g(FW)]= 式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 △470=ACK-AE 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 Vt ——样品液总体积，mL 。 FW t V . V A T ? ? ? ? 1 470 01 0 ?

过氧化氢酶

过氧化氢酶在不同条件下的分解 1、摘要 通过本次实验来探究在各类植物中所含的过氧化氢酶。在试验中通过过氧化氢与四种不同的蔬菜然后用排水集氧气法观察实验现象。实验结果发现马铃薯的效果最好，每一种蔬菜都有不同含量的过氧化氢酶，而这些蔬菜取材都非常的方便，这也就为以后做实验的效率变得更加高。 关键词：过氧化氢酶蔬菜氧气 Summary: Through this experiment to explore the various types of plants containing catalase. In the experiment, four kinds of vegetables were treated by hydrogen peroxide, and then the experimental phenomena were observed by the method of draining oxygen. The experimental results showed that the best effect of potato, each kind of vegetables have different content of catalase, and these vegetables are very convenient, which will be more efficient in the future to do the experiment. Key world: CAT Vegetable Oxygen 1.2 实验背景 1.2.1 什么是过氧化氢酶？ 过氧化氢酶（CAT），是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。① 1.2.2测定植物过氧化氢酶的生物学意义是? 过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内,属于活性氧清除剂,可分解机体代谢过程中产生的活性氧如过氧化氢,超氧阴离子等,这些物质可对机体尤其是质膜产生毒害作用,测定这种酶的活力可以评价机体受活性氧毒害程度.过氧化氢酶的活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系,可以根据这种酶的活性水平判断植物是否受到氧化损伤（比较某种因素或者复合因素作用下与正常状态下的酶活水平）。② 2、材料与方法 2.1实验对象 马铃薯、菠菜、苹果、青菜 2.2实验器材 锥形瓶、试管、塑料水槽、电子天平、称量纸、导管、量筒、剪刀、研钵、

过氧化氢酶活力的测定

实验三过氧化氢酶活性得测定 一、实验目得: 了解过氧化氢酶得作用,掌握碘量法测定过氧化氢酶活性得原理与方法; 二、实验原理: 过氧化氢酶就是一类色素蛋白,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水与分子氧,在此过程中起传递电子得作用,过氧化氢既就是氧化剂又就是还原剂。 R(Fe＋2)2＋H2O2---R(Fe+3OH)2 R(Fe+3OH)2+ H2O2 ----R(Fe＋2)2+2H2O+O2 并合上式:H2O2 ----2H2O+O2 据此,可根据消耗H2O2得消耗量或O2得生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量得过氧化氢溶液,经酶促反应后,加入过量得KI溶液生成得I2用标准得Na2S2O3滴定,根据N a2SO3消耗得体积计算H2O2得消耗量。 三、实验材料、仪器与试剂: 1、实验材料:小白菜 2、仪器:恒温水浴锅、研钵、容量瓶、刻度吸管、100mL三角瓶 3、试剂: (1)0、05mol/L H2O2 (2)2mol/LH2SO4 (3)0、1mol/L Na2S2O3 (4)1%淀粉溶液(5)10%(NH4)6Mo7O24 (6)pH7、8得磷酸缓冲液(7)20% KI (8)CaCO3 四、实验步骤: (1)酶液提取: 称取2.5g白菜叶,加少量CaCO3,2mLpH7、8得缓冲液少量,研成匀浆,移入100ml 容量瓶,用上述缓冲液冲洗研钵数次转入容量瓶中定容,静置10分钟,过滤。取滤液10mL于另一100mL得容量瓶中稀释定容待测(根据酶活高低而定)。 (2)酶促反应: 取锥形瓶4个,编好号各加入10ml酶液之后,立即向两个瓶中加入2mol/L H2SO45mL,终止酶活性,作空白对照。向另外两瓶各加H2O25mL,摇匀,在加入H2O2得那一刻起,记录时间,5分钟后迅速向实验瓶中加入2mol/LH2SO45mL,终止酶活性。向三角瓶中加1mL 20% KI与3滴(NH4)6Mo7O24,摇匀后迅速用标准Na2S2O3溶液进行滴定至淡黄色,加入1mL1%淀粉指试剂,蓝色恰好消失,记录消耗得Na2S2O3得体积V0,V;

碱性磷酸酶米氏常数的测定

碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：

试验八过氧化氢酶活力的测定

实验八过氧化氢酶活力的测定 一、实验目的 掌握过氧化氢酶活力测定的原理和方法。 二、实验原理 过氧化氢酶（catalase,CAT,EC1.11.1.6）普遍存在于植物的各种组织中，其活力大小与植物的代谢强度和抗寒、抗病能力有一定的联系，故常需进行测定。 过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为： 过氧化氢酶 2H2O22H2O+O2 钼酸铵 H2O2+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2O I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6 反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器：天平，研钵，容量瓶，恒温水浴，移液管，三角瓶，滴定管。 2．试剂： （1）0.01mol/L的过氧化氢溶液； （2）1.8mol/L的硫酸溶液； （3）10%钼酸铵溶液； （4）0.02mol/L硫代硫酸钠溶液； （5）1%的淀粉溶液； （6）20%的碘化钾溶液； （7）碳酸钙粉末。 3、材料 油麦菜 四、操作步骤 1．酶液提取 称取新鲜油麦菜0.25g，剪碎置研钵中，加入0.1g碳酸钙和2mL水研磨成匀浆，用漏斗移入50mL的容量瓶，研钵用少量的水冲洗，冲洗液也一并移入容量瓶中，然后用水定容。摇荡片刻，静置澄清后吸取20.0mL上清液至100ml容

量瓶中，加水定容，摇匀后备用。 2．酶促反应 取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0ml，随即在3号瓶中加入1.8mol/L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol/L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min（必须准确）后立即向1、2号瓶各加5.0mL1.8mol/L硫酸溶液。 3．滴定 各瓶分别加入1.0mL20%的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol/L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1%的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。 五、结果处理与分析 1．按国际酶活力单位计算 被分解的过氧化氢量（μmol)=1/2×V Na2S2O3(空白滴定值-样品测定值）（mL)×10-3×0.02×106 被分解的过氧化氢量（μmol)×酶液稀释倍数过氧化氢酶活力（U)=--------------------------------------------------------------- 时间（min）×样品重量（g）2．酶活力的习惯计算法 被分解的过氧化氢量（mg)=V Na2S2O3（空白滴定值-样品滴定值）（mL)×0.02×1／2×34.02 被分解的过氧化氢量（mg)x酶液稀释倍数过氧化氢酶活力=--------------------------------------------------------------- 样品重量（g)x时间（min） 其中0.02为硫代硫酸钠的物质的量浓度，34.02是过氧化氢的摩尔质量。 【注意事项】 酶促反应时间必须严格控制。 【思考题】 查阅文献，说明测定过氧化氢酶活力的方法有哪些，原理各是什么？ 【参考资料】 郭蔼光，郭泽坤.生物化学实验技术.北京：高等教育出版社，2007:77-79.

过氧化氢酶CAT试剂盒说明书

过氧化氢酶C A T试剂 盒说明书 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书 一、测定原理： 过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。试剂一(ml) 二、试剂组成与配制： 试剂一：液体100 ml×1瓶，4℃保存6个月。 试剂二：底物液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。 试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。加双蒸水至100 ml溶解，4℃保存1个月。（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果） 试剂四：液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。 三、组织样本的检测 1、组织匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测(最佳取样浓度摸索减附录)。 2、操作表：

混匀，波长405nm ，光径0.5cm ，双蒸水调零，测定各管吸光度值。 注：一般样本没有高脂等导致显着差异情况，对照管的样本更换成双蒸 水，做1-2管对照即可。如需做样本自身对照，则试剂盒所测定样本数 量减至48样。 3.组织中CAT 活力的计算： （1）定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1umol 的H2O2的量为一个活力单 位。 （2）计算公式： )ml /mgprot (601271)OD -OD ()mgprot /U (CAT *待测样本蛋白浓度取样量 值测定值对照活力组织匀浆中 ÷???=注：*271为斜率的倒数 （3）计算举例： 取10%水稻叶片匀浆0.05ml 做CAT 检测，测得对照管吸光度为0.605， 测定管吸光度为0.332，同时测得10%水稻叶片匀浆蛋白浓度为3.1303 mgprot/ml 。则计算结果为： ()/mgprot U 7351.101303.305 .0601271332.0704.0)mgprot /U (CAT =÷???-=活力组织匀浆中注：1.测定血清和血浆时，如果样本不溶血，每批样本只需要随机挑2

过氧化氢酶米氏常数的测定

过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐121140012 一、实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、实验原理 1.米氏反应动力学 (Michaelis-Menten Equation): 米氏方程 2.米氏常数的意义： ①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、 底物浓度无关。 ②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大 小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。 ③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物 就是该酶的最适底物。 3.米氏常数的求法： 该方法的缺点是难以确定最大 反应速度Vmax。

该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。 此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<>Km时直线将在原点附近与轴相交。 4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基： ①POD：过氧化物酶 ②SOD:超氧化物歧化酶 ③CAT：；过氧化氢酶 5.过氧化氢酶的作用： 植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。 6.过氧化氢酶活力的测定方法：

过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

生物化学实验指导 一、内容简介 生物化学是一门课堂理论与实验技术相结合的专业基础课。实验主要以生物大分子制备的一般过程以及电泳和层析等生物化学技术为主，采用经典和现代分析技术相结合的实验方法和手段进行设计，实验内容既包含生物化学研究技术的基本方法，又反映生物化学研究技术的发展水平。 开设实验为30学时，共有13 个实验可供选择，其中验证性实验4个，综合设计实验9个。由三部分所组成： 1．酶的性质及活力测定等； 2．蛋白质的分离、纯化、鉴定及含量测定； 3．DNA的提取、分离及含量测定 二、实验教学目标与基本要求 通过本课程学习，使学生掌握常用的生物化学分析与制备技术，理解其基础理论，从而使学生增强对生物化学理论的感性认识，掌握有关生物科学研究的基本技术，并提高学生的动手能力。 四、实验内容 实验1 脂肪含量及其碘值的测定 (一)、脂肪的定量测定 原理

脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂（如乙醚、石油醚）而不溶于水或微溶于水，利用此特性，可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。索氏脂肪提取器索氏（Ｓｏｘｈｌｅｔ）脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管，小烧瓶及冷凝管三者联接而成，浸提管两侧分别有虹吸管及通气管。盛有样品的滤纸包放在浸提管内，溶剂乙醚（或石油醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝的溶剂滴入浸提管，浸提样品。浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。 小烧瓶的溶剂由于受热而汽化，气体至冷凝管而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，将样品中脂肪类物质提尽并带到小烧瓶中。最后将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶的增重，就是样品中所含脂肪的量。 因本法提取的物质，除中性脂肪外，还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质，固提出的物质只能称粗脂肪。 器材与试剂 器材：天平，索氏脂肪提取管，恒温水浴锅，滤纸。试剂：乙醚（不含有过氧化物，乙醇及水分）沸点36℃。 去过氧化物的处理：将乙醚装入分液漏斗，加入乙醚量1/5的10％硫酸亚铁（100克硫酸亚铁溶于600ml 水中，再加30ml浓硫酸酸化，并稀释至1000ml），充分混合后，澄清分层，放出水液。 过氧化物鉴定法：6ml乙醚于试管中，加 2ml10％碘化钾溶液，猛烈混合，放置1分钟，下层碘化钾呈黄色，即表示有过氧化物存在。 去乙醇的处理：加乙醚量1/5的10％氢氧化钾溶液洗涤，洗后放出水溶液，重复2-3次。去水分的处理：在乙醚瓶中加入适量细粒无水氯化钙，放置一昼夜，时加摇荡，将上层清液移入蒸馏瓶蒸馏。 方法与步骤 1.将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘2小时至恒重，冷却后准确称重，并记录瓶重。 2.用分析天平称取干样（需研碎过40目筛孔）约2克，用滤纸包好，放入浸提管内，纸包长度不能超过虹吸管高度。 3.于已称重的小烧瓶内倒入1/2-1/3体积的无水乙醚（其量应略大于浸提管内体积），联接索氏提取器各部分（不能涂凡士林）。置约70℃恒温水浴锅内（水必须是蒸馏水或置于电热板上）控制加热温度，使每小时回馏3－5次较宜，一般提取10小时左右。 4.提取完毕，待乙醚完全流入小烧瓶时取滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。继续加热，待浸提管内乙醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前，倒出浸提管中的乙醚，如果小烧瓶中尚留乙醚，则继续加热蒸发，直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。停止加热，取下小烧瓶，用吹风机在通风橱中将瓶中残留乙醚吹尽。再置103－105℃烘箱中烘半小时，取出冷却后立即称重。 5.计算：粗脂肪含量(%)=提取瓶的增重(g)/样品重量(g)×100 注意事项乙醚为易燃品，切忌明火加热，同时要注意提取器各联接处有否漏气以及冷凝管效果是否良好，以免大量乙醚气外逸，使人麻醉。 (二)、碘值的测定 [原理] 脂肪中的不饱和脂肪酸碳链上有不饱和键，可以吸收卤素（Cl2、Ｂr2或Ｉ2）。不饱和键数目越多，吸收的卤素量也越多。每１００克脂肪，在一定条件下，所吸收的碘的克数，设为该脂肪的碘值，即碘值愈高，不饱和脂肪酸的含量愈高。 碘值是检定和鉴别油脂的一个重要常数，可以用来推算油、脂的定量组成。由于碘和脂肪的加成作用很慢，本实验采用汉诺斯（Ｈａｎｕｓ）溶液，它由碘与溴相混合产生ＩＢｒ，溴化碘更易与脂肪起加成作用，该溶液中加入冰醋酸，可使溶液更加稳定，反应过程如下：

实验二 过氧化氢酶高效性实验

实验二过氧化氢酶高效性实验 一、实验目的： 比较过氧化氢在不同催化剂下的分解速度。 二、实验原理： 酶是生物体产生的具有催化作用的物质，大多为蛋白质，少量为RNA。酶是生物体内生化反应不可缺少的物质。 酶催化作用具有高效性。如生物体内的过氧化氢酶能够高效的分解对生物体有害的物质——H2O2，方程式为2 H2 H2O→催化剂→2 H2O+ O2↑。在密闭容器内，根据氧气浓度的变化，可判断氧气产生的多少，从而推断出催化剂的催化效率。 三、实验器材及试剂： 数据采集器、氧气传感器、自制实验瓶、水槽、热水、3%过氧化氢溶液、3.5% FeCl3溶液、20%新鲜肝脏研磨液。 四、实验过程： 1.实验瓶的制作：选用内径与氧气传感器探头外径紧密插拔的饮料瓶2个（约300ml左右），1ml注射器2支，微量移液吸嘴4支，笔芯堵头2个，502速干胶制作实验瓶。将吸嘴倒沾到瓶盖上，头部插上笔芯堵头，制成实验瓶。 2.连接计算机、数据采集器及氧气传感器，打开计算机，进入V6.5实验软件系统。点击“通用软件”，系统自动识别所接入的传感器，并显示当前环境的氧气浓度值。 3.将氧气传感器分别置于两瓶内，待示数稳定后测得瓶中氧气浓度的初始数据。

4.将2个实验瓶编号、贴上标签：1号瓶注射器吸入1ml 3.5% FeCl3溶液，接插在微量移液吸嘴上；2号瓶注射器吸入1ml 20%新鲜肝脏研磨液，接插在微量移液吸嘴上。 5.分别向1、2号瓶加入50ml新配制的体积分数为3%的过氧化氢溶液，将2个实验瓶置于37℃的温水中，推动注射器活塞将注射器内试剂注入实验瓶内。 6.10min后将氧气传感器分别置于两瓶内，待示数稳定后测得氧气浓度终结数据，进行数据分析。 五、实验数据分析： 1号实验瓶氧气终结数据为21.9%，差值3.0%；2号实验瓶氧气终结数据为44.2%，差值25.3%.说明过氧化氢酶催化过氧化氢的效率远远大于FeCl3。（经计算，质量分数为3.5% FeCl3溶液和质量分数为20%的肝脏研磨液相比每滴FeCl3溶液中的Fe+是每滴肝脏研磨液中过氧化氢酶分子数的25万倍。） 六、实验结论： 酶催化作用具有高效性的特点。

简要介绍过氧化氢酶

简要介绍过氧化氢酶（CAT）的基本性质，根据你对文献的查阅，CAT的活性变化可指示哪种污染物的存在？如何指示？ 过氧化氢酶简述 动植物和微生物细胞内的过氧化氢酶可催化过氧化氢分解为水和分子氧 重金属污染具有范围广, 持续时间长, 不易在生物物质循环和能量交换中分解, 而且能沿食物链转移等特点, 对水生生物和人体产生严重的危害作用。因此, 沿海底质中的重金属已经成为海洋环境监测中的重要污染物[1- 3]。生物体受到重金属污染物刺激后, 产生大量的活性氧(O2- ) 物质, 造成生物体的氧化损伤如酶蛋白失活、DNA 断裂等[4- 6]。过氧化氢酶(CAT) 是生物体主要抗氧化酶之一, 其主要功能是清除活性氧自由基[6, 7] 近年来,石油、重金属对海洋污染日趋严重[1 ,2 ] ,对近岸海域生物资源及水产养殖生态系统造成威胁. 国内外关于海洋污染对鱼类生理生化过程的影响已有文献报道[3 ,4 ] ,但石油、重金属对贝类抗氧化防御系统影响的研究尚未见报道. 研究表明,许多污染物具有氧化还原循环活性, 可参与生物体内的氧化还原循环, 产生大量的活性氧, 从而导致机体内DNA 断裂、脂质过氧化、酶失活等一系列氧化应激[5 ,6 ] .抗氧化防御系统的一个重要特征是其活性成分或含量可由于污染的胁迫而发生改变. 因而,可间接反映环境中氧化污染的存在,可作为环境污染胁迫的指标[5 ] . 本文以海洋贝类毛蚶为材料,采用体内、体外染毒实验,探讨以CAT活性变化作为氧化污染生化指标的可能性,并为抗氧化防御系统的毒理学研究提供基础资料. 生物体内许多酶促反应和非酶促反应都能产生H2O2 , 它是有毒害作用的活性氧的前体。过氧化氢酶(简称Cat) 可非常有效地催化H2O2 的分解,使其失去活性氧的作用,保护机体。因此在环境监测、生态毒理学等方面,Cat 作为一项重要指标得到广泛应用[1 ,2 ] 。Rainbow 1992 年研究指出, 海洋软体动物种类繁多, 它们对重金属的积累是非常普遍的, 但有关重金属对其Cat 活性的影响未见报道。本文以扁玉螺Nevertia diyma (Roding) 为试验材料,研究了铁、锌、铜等生物必需微量元素及非必需元素铅对Cat 的影响,旨在从生理角度探讨软体动物对重金属积累的意义。 过氧化氢酶( Hydrogen peroxidase ) 又称触酶(Catalase ,CA T) ,是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是以过氧化氢为底物,通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气。该酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一,并在食品、医药、纺织、造纸、环保等行业具有重要的应用[1 ,2 ] 。 过氧化氢酶(catalase，简称Cat)是一种广泛存在于动植物及好氧微生物中的氧化还原酶，它的主要作用是催化H2O2 分解为H2O 和O2-，使得H2O2 不至于与O2- 在铁螯合物作用下反应生成非常有害的·OH，即可减少自由基和过氧化脂质的形成，能对机体起重要的保护作用。已有从动物肝和血、细菌等提纯过氧化氢酶[1～5]，从海洋软体动物贻贝中提取过氧化氢酶也有报道[6]，这些不同来源的

(整理)过氧化氢酶与过氧化物酶

过氧化氢酶与过氧化物酶 朱忠勇(南京军区福州总医院, 福州350025) 过氧化氢酶和过氧化物酶, 是两种广泛存在于 动植物体内、含血红素(铁卟啉) 辅基的氧化还原酶。由于它们作用的底物都有过氧化氢, 所以在一些医 学检验杂志或教科书上, 往往将它们混淆, 甚至对其 作用机理作不恰当的解释。 1过氧化氢酶 过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase) 又称触酶(Catalase) , 其系统名称(Systemat ic name) 是: H2O 2: H2O 2氧化还原酶(H2O 2 ÷H2O 2 O xido redu2 catase) , 国际酶学委员会的编号为EC 11111116, 其 催化反应式如下: H2O 2+ H2O 2 触酶 2H2O + O 2 在这个反应中, 底物只有一种——过氧化氢。实 际上是一分子的H2O 2作为氢(电子) 的供体, 被氧 化成O 2; 而另一分子H2O 2被还原为H2O。 2过氧化物酶 过氧化物酶(Peroxidase) 也有人简称过氧化酶, 其系统名称是: 供体: 过氧化氢氧化还原酶(Dono r: H2 O 2O xido reductase) , 编号为EC 11111117。其催化反应式为: 供体+ H2O 2 过氧化物酶 氧化的供体+ H2O 或更简明地表达为 RH2+ H2O 2 过氧化物酶 R + 2H2O (供体) (氧化的供体) 在这个反应中, 底物有两个; 一个是H2O 2, 另一个 为一种氢(电子) 的供体(Dono r)。在医学检验中, 多 用胺类(如联苯胺, 二氨基联苯胺, 联邻甲苯胺等) 作为供体(也可以用酚) , 因为这些物质脱氢后往往 会呈现颜色。 由上述两种反应可以清楚地看出, 两种酶的区 别是十分明显的。触酶只有一种底物, 生成的是水和氧气。而过氧化物酶则要两种底物, 其反应的实质是: 酶催化供体脱氢(氧化) , 同时催化脱下的氢使 H2O 2还原为H2O。在这个反应中, 如果只有H2O 2, 没有供体, 反应不能进行。在整个反应过程中不产生氧

碱性磷酸酶

骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。 研究应用 碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶（HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。 在研究中最常用的ALP如下： ◇细菌碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 来源：Escherichia coli C4 ； ◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 来源：一种北极虾 (Pandalus borealis) ; ◇ 小牛肠碱性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP); ◇ 胎盘碱性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比，SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域) ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中： ★分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团，用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接，从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态;同样，通过去磷酸化可用作放射标记示踪。通常用作这些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP)，因为在反应完成之后它是最容易灭活的。 ★酶免分析中应用最多的是ELISA，以竞争法测小分子抗原为例，抗体先与固相载体结合，然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合，洗去未反应的过量ALP-抗原，加入显色底物。则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而知道待测样品中抗原的浓度。ELISA中用的比较多的是辣根过氧化物酶(HRP)，底物为OPD，深桔黄色，检测波长492nm；TMB，蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯），黄色，检测波长405nm ★目前工业上一个普遍的应用是作为检验牛奶的巴斯的灭菌的标志：被巴斯德过高温灭菌的分子会被灭活，向其中和未巴斯灭菌的牛奶中加入ALP的底物，2分钟后未灭菌的样品应该显黄色，如果待测样品(指被巴斯灭菌过的牛奶)也能呈现相同颜色，则说明巴斯灭菌温度未过度。当然总有例外，因为有少数细菌会产生耐热的ALP。 测定方法 有很多种，我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法，但现在应用较多的是连续检测法。 原理为以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。 正常范围 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。

过氧化氢酶测定方法

过氧化氢酶测定(容量法) 过氧化氢酶也叫接触酶，能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。几乎在所有的生物体内部有过氧化氢酶，在某些细菌里，其数量约为细胞干重的1％。土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。 原理 过氧化氢酶的测定有测压法和滴定法。测压法是测定过氧化氢分解时析出的氧量(反应过氧化氢酶 式为：H2O2+H2O O2+H2O，方法简单，但准确性较差。后者则是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量，反应式为 2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法测定结果较好。试剂 (1) 0.3% H2O2：按1：100将30％的H2O2用水稀释。 (2) 3N H2SO4（也就是1.5mol/l H2SO4）：以配1000ml为例，需要的浓硫酸的体积为1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。 KMnO4的分子量=158.026,当量=31.605.高锰酸钾水溶液受到水中还原物和杂质以及受日光直射等影响能分解析出棕色的含水的二氧化锰沉淀，而有浓度的改变。因此在配制其标准溶液时必须使用棕色瓶盛装，以防日光直射作用.配制后并应放置一段时间，待与水中还原物完全作用后，滤去沉淀，然后进行标定，才能得到基本稳定不易变化的标准溶液。 (3) 0.1N KMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161克，溶于l升无CO2蒸馏水（沸水）中，溶解后,在暗处放置一周, 然后用虹吸管将上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉滤过)保存，以备标定. 注：C(1/5 KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1N KMnO4溶液。 0.1N KMnO4溶液标定（GB/T601-2002） 称取0.2g（准至0.0001g）于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[c（1/5 KMnO4）=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验（不加草酸钠，其他一样）。 高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算 c（1/5KMnO4）=m*1000/[（V1-V2）*M ] 式中c（1/5KMnO4）—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L； m——草酸钠之质量，g；