实验三 酵母RNA的提取及含量测定
华南师范大学实验报告
学生姓名吴志军学号20082502046
专业生物工程年级、班级08工程1班
课程名称下游技术实验项目酵母RNA提取
实验类型验证设计综合实验时间2011年10月17 日实验指导老师江学文实验评分
实验三酵母RNA的提取及含量测定
一、实验目的与要求
1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，
3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波
长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
三、主要仪器和试剂
啤酒酵母粉
0.04M NaOH 溶液
95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL 乙醇加0.3mL HCl 。
紫外分光光度计
离心机
真空干燥箱
三角瓶、烧杯
水浴锅
四、实验步骤
1、称5g 干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH 溶液中，并在研钵中研磨均匀。
2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min ，冷却，转入离心管，3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL 酸性乙醇，边加边搅动。
3、加毕，静置，待RNA 沉淀完全后，3000r/min 离心3min 。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。
4、再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA 粗品的重量，
5、纯度测定：将样品配制成含5～50μg 核酸/mL 的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm 和280nm 吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。
五、计算：
260./0.024O D R N A L ??=浓度（微克克）稀释倍数
O.D260为260nm 波长处的光密度读数；L 为比色杯的厚度，一般为1或0.5；0.024为1μgRNA/mL 的光密度；0.020为1μgDNA/mL 的光密度。
六、实验结果与分析
其中本小组为第5小组，稀释倍数为12500倍，测得的吸光值（OD260）为0.605。
纯度测定结果为：
RNA 浓度（ug/g ）=
稀释倍数??L OD 024.0260=g ug /315104125001024.0605.0=?? RNA 纯品的质量（ug ）=RNA
浓度×RNA 粗品的重量=0.101g =g 101463.49u =0.322g ×315104ug/g
故甘酵母粉中RNA 含量（%）=%100?）干酵母粉重（）
重（g g RNA =%1005101.0?g
=2.02% 分析：实验的结果测出RNA 的含量为2.02%，其RNA 的含量偏低。造成这种结果的原因主要是由于对物料进行转移的时候损失的，同时测量光度值的时候造成的误差也是造成RNA 含量少的原因。
七、思考题
1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
答：由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA 存在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA 。加入NaOH 之后水浴煮沸30min 的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA 则从细胞中分离出来。
另外细胞中含有多种分解RNA 的酶类（如RNase 等），为了避免RNA 在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA 分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA 的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA 分子的作用。
2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA 从酵母中释放出来？RNA 的等电点是多少？ 答：酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA ，而DNA 很少；RNA 提取液与菌体分离比较容易，因此酵母是提取RNA 的好材料。
工业上将RNA 从细胞中释放出来主要有三种方法，包括稀碱法、浓盐法和自溶法。（1）稀碱法是在一定的碱浓度下，使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而破坏细胞壁，使RNA 从细胞中释放出来，该方法属于化学破壁法。（2）浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压，是细胞自身破裂而释放出RNA ，即利用高浓度的盐（10% NaCl ）在90～100°C 条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA 和蛋白质而使 RNA 释放到盐溶液中。同时，90～100°C 的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA 的降解。该方法属于物理化学破壁法。（3）自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后，细胞中的溶酶体膜破裂，使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中，利用菌体自身的酶系将细胞溶解，从而释放出RNA 。通常自溶法的菌浓度为2%，PH 值9.5～10，自溶温度以60～65°C 为宜。 RNA 的等电点为PH2.5。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH 至2.0～2.5，RNA 则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA 粗产品。
3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？
答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间层为一层蛋白质分子（包括多种酶类），此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用，脂类发生皂化反应从而被分解，使细胞穿孔。同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解，蛋白质（包括多种酶类）也会发生变性，从而增加酵母细胞的通透性，酵母细胞原生质膜失去选择透过性，细胞就破裂使RNA流出。
4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?
答：核酸是具有极性的高分子物质，根据相似相溶原理，DNA和RNA都是微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇，也可溶于10%左右的氯化钠溶液，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，尤其是在50%左右的乙醇溶液中溶解度很小。因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。