Notch信号通路研究进展
224 中国医药生物技术 2009年6月第4卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2009, V ol. 4, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.03.012 ·
综述·Notch信号通路研究进展
王利祥，华子春
1917 年，Morgan 及其同事在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，故命名该基因为 Notch。随后的研究发现，Notch 从无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中表达，其家族成员的结构具有高度保守性，在细胞分化、发育中起着关键作用。迄今研究已阐明 Notch 信号通路的主要成员及核心转导过程，然而随着研究的深入，人们逐渐认识到该通路实际上处于十分复杂的调控网络之中，而这与其在发育过程中功能的多样性相符合。本文结合最新进展，系统阐述 Notch 信号通路的组成，功能，作用机制及调控，并揭示该通路异常与疾病的联系。
1 Notch 受体
Notch 受体是一个相对分子量约为 30 000 的 I 型膜蛋白，由胞外亚基和跨膜亚基组成，2 亚基之间通过 Ca2+ 依赖的非共价键结合形成异源二聚体。胞外亚基包含一组串联排列的 EGFR 和 3 个家族特异性的 LNR 重复序列。EGFR 在 Notch 受体与配体的结合中起关键作用，在果蝇中，Notch 受体的第 11 位和 12 位 EGFR 介导了其与配体的结合。LNR 位于 EGFR 的下游，富含半胱氨酸，介导了 2 亚基之间 Ca2+ 依赖的相互作用。跨膜亚基包括跨膜区、RAM 序列、锚蛋白重复序列、核定位序列、多聚谷氨酰胺序列以及 PEST 序列。RAM 结构域是 Notch 信号效应分子 CBF1/RBPJk 主要的结合部位。ANK 重复序列结构域是 Deltex、Mastermind 等的结合部位，这些蛋白对Notch 信号通路有修饰作用。PEST 结构域与泛素介导的Notch 胞内段降解有关[1]。
2 Notch 配体
Notch 配体与受体一样为 I 型跨膜蛋白。果蝇 Notch 配体有 2 个同源物 Delta 和 Serrate，线虫的 Notch 配体为 Lag 2，故又称 Notch 配体为 DSL 蛋白。脊椎动物体内也发现了多个 Notch 配体，与 Delta 同源性高的称为Delta 样分子，与 Serate 同源性高的被称作 Jagged。目前，发现人的 Notch 配体有 D ll l、3、4和 Jagged l、2。配体胞外 DSL 结构域在进化中高度保守，是配体与受体结合、激活 Notch 信号所必需的。Notch 配体的胞内域较短，仅70 个左右氨基酸残基，功能尚未阐明。近来研究发现，Delta 1 的胞内域能够诱导细胞的生长抑制[2]。有人推测，配体胞内段可能类似与受体胞内段，具有信号转导功能，但具体机制有待进一步研究。3 Notch 信号传递与效应因子
迄今研究发现主要有 6 种信号通路在多细胞生物的生长中发挥关键作用，分别是刺猬、骨形态发生蛋白、无翅、类固醇激素受体、Notch 和受体酪氨酸激酶。Notch 相对于其他信号通路结构较简单，没有第二信使的参与。现有研究提出了 Notch 信号活化的“三步蛋白水解模型”[3]。首先，Notch 以单链前体模式在内质网合成，经分泌运输途径，在高尔基体内被 Furin 样转化酶切割成相对分子质量为180 000 含胞外区的大片段和 120 000 含跨膜区和胞内区的小片段。两者通过 Ca2+依赖性的非共价键结合为异源二聚体，然后被转运到细胞膜。当 Notch 配体与受体结合，Notch 受体相继发生 2 次蛋白水解。第一次由 ADAM 金属蛋白酶家族的 ADAM 10/Kuz 或 ADAM 17/TACE 切割为 2 个片段。N 端裂解产物（胞外区）被配体表达细胞内吞，而 C 端裂解产物随后由早老素 1/2，Pen-2，Aph1 和Nicastrin 组成的γ-促分泌酶复合体酶切释放 Notch 受体的活化形式 NICD。
经典的 Notch 信号通路又称为 CBF-1/RBP-Jκ依赖途径。CBF-1/RBP-Jκ本身是 1 个转录抑制因子，能够特异性地与 DNA 序列“CGTGGGAA”相结合，并招募 SMRT，SKIP，I/II 型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因的转录。当 Notch 信号激活后，NICD 通过上述酶切反应被释放进入胞核，通过 RAM 结构域及 ANK 重复序列与 CBF-1/RBP-Jκ结合使共抑制复合物解离，并募集 SKIP，MAML 1 组成共激活复合体，激活下游基因的转录。Notch 信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族成员，如哺乳动物中的 HES、非洲爪蟾中的XHey-1，以及近来发现的 BLBP [3]。此外，存在非CBF-1/RBP-Jκ依赖的 Notch 信号转导途径。最近有研究报道，果蝇 Notch 结合蛋白 Deltex 是某些组织特异性非 Su （H）依赖性信号所必需的，同时发现 Deltex 也具有拮抗Notch 的功能 [4]。
4 Notch 信号途径功能
Notch 信号途径的功能最初是在果蝇神经系统发育的
基金项目：国家自然科学基金（30425009，30730030）；江苏省自然科学基金（BK2007715）
作者单位：210093 南京大学医药生物技术国家重点实验室
通讯作者：华子春，Email：zchua@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,
收稿日期：2009-02-01
中国医药生物技术 2009年6月第4卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2009, V ol. 4, No. 3 225
研究中发现的。正常发育的神经系统中有一种旁侧抑制机制，使正在分化的神经元周围的神经前体细胞不再分化为神经元，而发育成上皮细胞。研究发现，Notch 信号会上调细胞膜表面的 Notch 分子，同时下调其配体 Delta 的表达；反之，Delta 的表达对细胞自身 Notch 分子的表达则有下调作用。这种正反馈机制使发育早期细胞 Notch 及其配体表达的细微差别在发育过程中被逐渐放大，从而决定了细胞的不同分化方向[5]。不仅是神经系统，果蝇中胚层、生殖细胞、感觉器官等的正常发育与形成都有赖于 Notch 介导的分化抑制。而哺乳类动物中多种不同的 Notch 分子功能不完全一致，其作用方式远较果蝇中复杂。研究发现，Notch 信号在淋巴细胞发育过程中具有关键作用，它可以促进Tαβ细胞的形成[6]，与 Gata 3 基因协同调控 CD4+ 细胞向Th 1/Th 2 类型的分化[7]，并且可增加外周免疫器官边缘区B 细胞的数量[8]。此外，Notch 信号是造血干细胞/祖细胞自我更新所必需的[9]，同时对血管的发生发展有重要调控作用[10]。
5 Notch 信号途径的调节与相互作用
Notch 信号通路本身的简单性与其功能的复杂性不相匹配，这一简单的信号通路何以产生足够的多样性来精确响应众多不同的生理信号呢？近几年的研究发现，原来相对于简单的核心信号通路，细胞中存在复杂的修饰调节机制。当Notch 受体最初在内质网合成时，一种糖基转移酶 OFUT 1 将岩藻糖加到其胞外区 EGFR 的丝氨酸或苏氨酸残基上，这是配体结合受体从而激活 Notch 信号所必需的[11]。在随后的分泌运输中，高尔基体中的 N-乙酰葡糖基转移酶Fringe 进一步对 EGFR 进行糖基化修饰，赋予 Notch 受体对不同配体特异的敏感性[12]。近来研究发现，内吞作用在 Notch 信号调节中扮演重要角色。在果蝇和斑马鱼中Notch 胞外域与 Delta 结合后被内吞入配体表达细胞，并促进受体的激活。此外，在哺乳动物中 Numb 通过 PTB 结构域与 Notch 结合并招募含有 HECT 结构域的 E 3 连接酶，同时与内吞蛋白 Eps 15 和α-衔接蛋白互作，介导受体胞内段内吞至溶酶体降解，从而下调 Notch 信号[13]。当信号激活而释放 NICD 后，细胞将无法通过改变配体或受体的浓度来控制信号的强弱，因此除与膜连接的受体和配体受到调控外，进入胞核的 NICD 也应受到严格的调控。与此相应的是，人们在胞核内很难检测到从完整受体切割产生的 NICD。目前发现泛素介导的蛋白降解机制在其中发挥重要作用，并发现了很多泛素化相关分子，如 Su/Itch[14]、Neuralized [15]等。
科学家同时发现 Notch 信号通路与其他信号通路在不同层次上存在串话，相互协调以使特定的应答与细胞整体状态相适应。近来发现 Notch 信号通路与 Ras/MAPK 信号通路相互作用，然而这种互作的结果则因细胞背景的不同而不同。例如，在线虫生殖孔分化过程中，Ras 的激活可能通过内吞介导的机制下调 Notch 活性。相反，体外培养的经Ras 转化的人源细胞中，Notch 被 Ras 激活并是维持 Ras 激活转化表型所必需的[16]。此外，Notch 通路与 Wingless/ Wnt，TGFβ/BMP 信号通路也存在相互作用。在果蝇小眼发育中，Wingless 受体卷曲蛋白拮抗 Notch 受体[17]；在人乳腺上皮细胞中，Notch 可以增强 Wnt 信号的致癌转化作用[18]；在成纤维细胞中，TGF β通过下调 Notch 3 信号以促进平滑肌基因的表达[19]。
6 Notch 信号途径与疾病关系
Notch 信号通路是进化上十分保守的信号传递机制，这一调控机制出现异常往往会导致先天性遗传疾病。目前已经证实，N o t c h信号通路中相关分子的基因突变与CADASIL、Aligile 综合症和脊椎肋骨发育不全等遗传性疾病有关。CADASIL 是伴有皮质下硬死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病，研究发现主要是由于血管平滑肌细胞上表达的 Notch 3 基因胞外域 EGFR 中半胱氨酸残基的缺失或插入突变所致[20]。Aligile 综合症是可导致多种器官如心、肝、肾等发育缺陷的常染色体显性遗传病，Jagged 1 基因突变导致不能产生正常的翻译产物是其主要病因[21]。Delta 3 基因突变能导致常染色体隐性遗传病 SD[22]。此外，研究发现 Notch 信号紊乱与某些心血管系统疾病有关。动物模型实验表明它可能从 4 个方面影响心血管系统，这4 个方面包括血管重构、血管稳定性、动静脉发生选择以及心脏发育[23]。近来研究发现淀粉样前体蛋白及 Notch 受体的剪切均依赖于γ-促分泌酶/早老蛋白，因此人们推测Notch 信号通路可能与阿尔茨海默病的发生发展有一定联系，在与 AD 相关的研究中证实了 Notch 信号的改变[24]。
7 Notch 信号途径与肿瘤关系
鉴于 Notch 信号通路在细胞分化、增殖以及机体发育过程中发挥极其重要的作用，其信号传递异常会导致肿瘤的发生也在意料之中。这一关系首先在人类急性 T 淋巴细胞白血病中得以证实，其病因是染色体易位使 hNotch 1 基因与 T 细胞受体β基因融合，产生组成型活化的 hNotch 1 突变体导致 Notch 信号的过度活化[25]。随后的研究发现在前列腺癌[26]、乳腺癌[27]、子宫颈癌[28]等多种肿瘤细胞及其衍生的细胞系中，均存在 Notch 受体及配体的异常表达。除 Notch 受体及配体变异可引发肿瘤外，该信号通路中介导 NICD 与 CSL 结合的辅助因子 MAML 突变也可导致肿瘤发生[29]。另外，Notch 信号也可与其他信号通路互作共同诱发肿瘤。例如，Notch 1 突变体通过与 Myc 协同作用加速淋巴瘤的生成和恶化[30]。然而，有人发现 Notch 也可扮演抑癌基因的角色[31]，这也反映了细胞所处微环境与Notch 信号发挥的具体功能密切相关。
8 展望
随着研究的深入，人们逐渐发现相对于简单的信号转导途径，Notch 信号处于复杂的多维调控网络之中，这为其在
226 中国医药生物技术 2009年6月第4卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2009, V ol. 4, No. 3
发育过程中发挥多种功能提供了基础。例如，Notch 受体及配体的内吞运输在 Notch 信号激活中发挥重要作用，泛素介导的蛋白降解对防止 Notch 信号持续激活非常关键，然而其调控机制仍有待研究。此外发现存在不依赖于 CSL 的Notch 信号通路，其转导过程和具体功能也都尚未阐明。未来研究的主要任务就是揭开 Notch 信号复杂调控网络的机制，由此认清 Notch 信号功能多样性的基础，这将使我们能够对不同 Notch 信号异常所导致的特定病理情况设计出更有针对性的治疗方案。
参考文献
[1]Fiúza UM, Arias AM. Cell and molecular biology of Notch.
J Endocrinol, 2007, 194(3):459-474.
[2]Kolev V, Kacer D, Trifonova R, et al. The intracellular domain of
Notch ligand Delta1 inbduces cell growth arrest. FEBS Lett, 2005, 579(25):5798-5802.
[3]Weinmaster G. Notch signal transduction: a real rip and more. Curr
Opin Genet Dev, 2000, 10(4):363-369.
[4]Anthony TE, Mason HA, Gridley T, et al. Brain lipid-binding protein
is a direct target of Notch signaling in radial glial cells. Genes Dev, 2005, 19(9):1028-1033.
[5]Fuwa TJ, Hori K, Sasamura T, et al. The first deltex null mutant
indicates tissue-specific deltex-dependent Notch signaling in Drosophila. Mol Genet Genomics, 2006, 275(3):251-263.
[6]Kageyama R, Ohtsuka T, Shimojo H, et al. Dynamic Notch signaling
in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nat Neurosci, 2008, 11(11):1247-1251.
[7]Van de Walle I, De Smet G, De Smedt M, et al. An early decrease in
Notch activation is required for human TCR-alphabeta lineage differentiation at the expense of TCR-gammadelta T cells. Blood, 2009, 113(13):2988-2998.
[8]Amsen D, Antov A, Jankovic D, et al. Direct regulation of Gata3
expression determines the T helper differentiation potential of Notch.
Immunity, 2007, 27(1):89-99.
[9]Thomas MD, Srivastava B, Allman D. Regulation of peripheral B cell
maturation. Cell Immunol, 2006, 239(2):92-102.
[10]Mancini SJ, Mantei N, Dumortier A, et al. Jagged1-dependent Notch
signaling is dispensable for hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Blood, 2005, 105(6):2340-2342.
[11]Sainson RC, Harris AL. Regulation of angiogenesis by homotypic and
heterotypic notch signalling in endothelial cells and pericytes: from basic research to potential therapies. Angiogenesis, 2008, 11(1):41-51.
[12]Okajima T, Matsuda T. Roles of O-fucosyltransferase 1 and O-linked
fucose in notch receptor function. Methods Enzymol, 2006, 417:111-126.
[13]Xu A, Haines N, Dlugosz M, et al. In vitro reconstitution of the
modulation of Drosophila Notch-ligand binding by Fringe. J Biol
Chem, 2007, 282(48):35153-35162.
[14]Le Borgne R. Regulation of Notch signalling by endocytosis and
endosomal sorting. Curr Opin Cell Biol, 2006, 18(2):213-222.
[15]Skwarek LC, Garroni MK, Commisso C, et al. Neuralized contains a
phosphoinositide-binding motif required downstream of ubiquitination for delta endocytosis and notch signaling. Dev Cell, 2007, 13(6):783- 795.
[16]Zhao Y, Katzman RB, Delmolino LM, et al. The notch regulator
MAML1 interacts with p53 and functions as a coactivator. J Biol Chem, 2007, 282(16):11969-11981.
[17]Sundaram MV. The love-hate relationship between Ras and Notch.
Genes Dev, 2005, 19(16):1825-1839.
[18]Ayyanan A, Civenni G, Ciarloni L, et al. Increased Wnt signaling
triggers oncogenic conversion of human breast epithelial cells by a Notch-dependent mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(10):3799-3804.
[19]Kennard S, Liu H, Lilly B. Transforming growth factor-beta (TGF- 1)
down-regulates Notch3 in fibroblasts to promote smooth muscle gene expression. J Biol Chem, 2008, 283(3):1324-1333.
[20]Dziewulska D, Kwieciński H. CADASIL syndrome - cerebral
autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy. Neurol Neurochir Pol, 2008, 42(2):123-130. [21]Tumialán LM, Dhall SS, Tomak PR, et al. Alagille syndrome and
aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Case report and review of the literature. Pediatr Neurosurg, 2006, 42(1):57-61.
[22]Turnpenny PD, Alman B, Cornier AS, et al. Abnormal vertebral
segmentation and the notch signaling pathway in man. Dev Dyn, 2007, 236(6):1456-1474.
[23]Gridley T. Notch signaling in vascular development and physiology.
Development, 2007, 134(15):2709-2718.
[24]Negarsheth MH, Viehman A, Lippa SM, et al. Notch-1
immunoexpression is increased in Alzheimer’s and Pick’s disease.
J Neurol Sci, 2006, 244(1/2):111-116.
[25]Demarest RM, Ratti F, Capobianco AJ. It’s T-ALL about Notch.
Oncogene, 2008, 27:5082-5091.
[26]Leong KG, Gao WQ. The Notch pathway in prostate development and
cancer. Differentiation, 2008, 76(6):699-716.
[27]Wu F, Stutzman A, Mo YY. Notch signaling and its role in breast
cancer. Front Biosci, 2007, 12:4370-4383.
[28]Maliekal TT, Bajaj J, Giri V, et al. The role of Notch signaling in
human cervical cancer: implications for solid tumors. Oncogene, 2008, 27(38):5110-5114.
[29]Wu L, Griffin JD. Modulation of Notch signaling by mastermind-like
(MAML) transcriptional co-activators and their involvement in tumorigenesis. Semin Cancer Biol, 2004, 14(5):348-356.
[30]Sharma VM, Draheim KM, Kelliher MA. The Notch1/c-Myc pathway
in T cell leukemia. Cell Cycle, 2007, 6(8):927-930.
[31]Dotto GP. Notch tumor suppressor function. Oncogene, 2008,
27(38):5115-5123.
白介素IL信转导及其通路研究概述
白介素IL-6信号转导及其通路研究概述 细胞因子是一类参与免疫系统的细胞之间通信的蛋白质，除此之外，许多细胞因子在免疫系统之外也具有调节功能。1986年白介素IL-6作为B细胞刺激因子被Kishimoto组分子克隆。IL-6在免疫系统外的活性还有肝细胞刺激因子和骨髓细胞分化诱导蛋白。 白介素IL-6含有184个氨基酸，属于糖基化蛋白质。IL-6可以由多种类型细胞合成和分泌，包括单核细胞、T细胞、成纤维细胞和内皮细胞。IL-6结合受体有两种，一种是特异性受体IL-6R（80kDa I型跨膜蛋白），另一种是gp130，是IL-6家族细胞因子的所有成员的常见受体亚单位。gp130可以在所有细胞表达，但IL-6R的表达受到更多的限制，主要发现于肝细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和CD4+ T细胞。 白介素IL-6受体gp130的二聚化会导致两种细胞内信号通路的启动：经典信号通路和反式信号通路（见下文）。白介素IL-6的受体IL-6R可以在细胞膜经过蛋白质水解，形成可溶性的IL-6R（sIL-6R），在人类中，也可以在翻译阶段进行剪接mRNA，进而产生sIL-6R。在经典信号通路中，IL-6与膜上的IL-6R结合，随后与结合在细胞膜上的gp130结合，启动细胞内信号传导。在IL-6反式信号通路中，IL-6与sIL-6R结合，IL-6和sIL-6R的复合物与细胞膜结合的gp130结合，从而引发细胞内信号。 白介素IL-6是最重要的炎症细胞因子之一。IL-6在通过膜结合和可溶性受体的信号传导中是独特的。有趣的是，这两种途径的生物学后果有很大差异，通过膜结合受体的经典IL-6信号通路主要是再生和保护性的，可溶性IL-6R的IL-6反式信号通路是促炎症的。响应于受体激活的IL-6的细胞内信号传导是通过STA T依赖和STAT独立的信号模块，其由复杂的调节网络调节。IL-6的复杂生物学对该细胞因子的治疗靶向具有影响。 白介素IL-6胞内信号通路可以简单的概述为：IL-6与受体复合物结合后，激活JAK1。JAK1磷酸化gp130细胞质部分内的酪氨酸残基，这些磷酸酪氨酸基序是STAT转录因子，SOCS3反馈抑制剂和衔接蛋白和磷酸酶SHP2的募集位点。SHP2连接到MAPK级联，使Gab1磷酸化，磷酸化的Gab1转移到质膜上，协调正在进行的MAPK和PI3K活化。Src家族激酶独立于受体磷酸化并激活Y AP。 白介素IL-6信号转导第一步：激活JAK。 大多数细胞因子受体缺乏胞内激酶活性，生长因子的受体例外。白介素IL-6胞内信号转导首先激活Janus激酶（JAK），开启酶促反应。通过JAK N末端的同源结构域内（JH）
Notch信号通路研究进展
224 中国医药生物技术 2009年6月第4卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2009, V ol. 4, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.03.012 · 综述·Notch信号通路研究进展 王利祥，华子春 1917 年，Morgan 及其同事在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，故命名该基因为 Notch。随后的研究发现，Notch 从无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中表达，其家族成员的结构具有高度保守性，在细胞分化、发育中起着关键作用。迄今研究已阐明 Notch 信号通路的主要成员及核心转导过程，然而随着研究的深入，人们逐渐认识到该通路实际上处于十分复杂的调控网络之中，而这与其在发育过程中功能的多样性相符合。本文结合最新进展，系统阐述 Notch 信号通路的组成，功能，作用机制及调控，并揭示该通路异常与疾病的联系。 1 Notch 受体 Notch 受体是一个相对分子量约为 30 000 的 I 型膜蛋白，由胞外亚基和跨膜亚基组成，2 亚基之间通过 Ca2+ 依赖的非共价键结合形成异源二聚体。胞外亚基包含一组串联排列的 EGFR 和 3 个家族特异性的 LNR 重复序列。EGFR 在 Notch 受体与配体的结合中起关键作用，在果蝇中，Notch 受体的第 11 位和 12 位 EGFR 介导了其与配体的结合。LNR 位于 EGFR 的下游，富含半胱氨酸，介导了 2 亚基之间 Ca2+ 依赖的相互作用。跨膜亚基包括跨膜区、RAM 序列、锚蛋白重复序列、核定位序列、多聚谷氨酰胺序列以及 PEST 序列。RAM 结构域是 Notch 信号效应分子 CBF1/RBPJk 主要的结合部位。ANK 重复序列结构域是 Deltex、Mastermind 等的结合部位，这些蛋白对Notch 信号通路有修饰作用。PEST 结构域与泛素介导的Notch 胞内段降解有关[1]。 2 Notch 配体 Notch 配体与受体一样为 I 型跨膜蛋白。果蝇 Notch 配体有 2 个同源物 Delta 和 Serrate，线虫的 Notch 配体为 Lag 2，故又称 Notch 配体为 DSL 蛋白。脊椎动物体内也发现了多个 Notch 配体，与 Delta 同源性高的称为Delta 样分子，与 Serate 同源性高的被称作 Jagged。目前，发现人的 Notch 配体有 D ll l、3、4和 Jagged l、2。配体胞外 DSL 结构域在进化中高度保守，是配体与受体结合、激活 Notch 信号所必需的。Notch 配体的胞内域较短，仅70 个左右氨基酸残基，功能尚未阐明。近来研究发现，Delta 1 的胞内域能够诱导细胞的生长抑制[2]。有人推测，配体胞内段可能类似与受体胞内段，具有信号转导功能，但具体机制有待进一步研究。3 Notch 信号传递与效应因子 迄今研究发现主要有 6 种信号通路在多细胞生物的生长中发挥关键作用，分别是刺猬、骨形态发生蛋白、无翅、类固醇激素受体、Notch 和受体酪氨酸激酶。Notch 相对于其他信号通路结构较简单，没有第二信使的参与。现有研究提出了 Notch 信号活化的“三步蛋白水解模型”[3]。首先，Notch 以单链前体模式在内质网合成，经分泌运输途径，在高尔基体内被 Furin 样转化酶切割成相对分子质量为180 000 含胞外区的大片段和 120 000 含跨膜区和胞内区的小片段。两者通过 Ca2+依赖性的非共价键结合为异源二聚体，然后被转运到细胞膜。当 Notch 配体与受体结合，Notch 受体相继发生 2 次蛋白水解。第一次由 ADAM 金属蛋白酶家族的 ADAM 10/Kuz 或 ADAM 17/TACE 切割为 2 个片段。N 端裂解产物（胞外区）被配体表达细胞内吞，而 C 端裂解产物随后由早老素 1/2，Pen-2，Aph1 和Nicastrin 组成的γ-促分泌酶复合体酶切释放 Notch 受体的活化形式 NICD。 经典的 Notch 信号通路又称为 CBF-1/RBP-Jκ依赖途径。CBF-1/RBP-Jκ本身是 1 个转录抑制因子，能够特异性地与 DNA 序列“CGTGGGAA”相结合，并招募 SMRT，SKIP，I/II 型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因的转录。当 Notch 信号激活后，NICD 通过上述酶切反应被释放进入胞核，通过 RAM 结构域及 ANK 重复序列与 CBF-1/RBP-Jκ结合使共抑制复合物解离，并募集 SKIP，MAML 1 组成共激活复合体，激活下游基因的转录。Notch 信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族成员，如哺乳动物中的 HES、非洲爪蟾中的XHey-1，以及近来发现的 BLBP [3]。此外，存在非CBF-1/RBP-Jκ依赖的 Notch 信号转导途径。最近有研究报道，果蝇 Notch 结合蛋白 Deltex 是某些组织特异性非 Su （H）依赖性信号所必需的，同时发现 Deltex 也具有拮抗Notch 的功能 [4]。 4 Notch 信号途径功能 Notch 信号途径的功能最初是在果蝇神经系统发育的 基金项目：国家自然科学基金（30425009，30730030）；江苏省自然科学基金（BK2007715） 作者单位：210093 南京大学医药生物技术国家重点实验室 通讯作者：华子春，Email：zchua@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html, 收稿日期：2009-02-01
p38MAPK信号转导通路与细胞凋亡研究进展.
综述与进展 p38M APK信号转导通路与细胞凋亡研究进展 王誉霖1,张励才2 作者单位：1.安徽省宣城市人民医院麻醉科242000;2江苏徐州医学院作者简介： 王誉霖（1978，女,吉林市人，住院医师，硕士。研究方向：疼痛信号转导及调控。 主题词p38丝裂原活化蛋白激酶类；细胞凋亡;综述 中图分类号R345文献标识码A文章编号1674 8166（201012 1665 03 丝裂原活化蛋白激酶（mitog en2activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质。目前在人类已鉴定了4条MAPK途径:细胞外信号调节蛋白 激酶（ex tra cellular sig nal regulated protein kinase,ERK途径,C Jun 基末端激酶（c Jun N term inal kinase,JN K/应激活化蛋白（stress activated protein kinase,SAPK途 径,ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP MAP kinase,BM K1途径和p38M APK（p38mitogen activated protein kinases,p38MA PK 传导途径［1］。p38 信号途径是 MAPK家族中的重要组成部分，多种炎症因子和生长因子及应激反应可使p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而激活p38M APK,使它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。因此,p38MAPK 通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且,p38在细胞凋亡中也有着重要的调节效应。1 p38M APK信号转导通路 丝裂原活化蛋白激酶（m ito gen activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内重 要的信号转导系统之一。在哺乳动物细胞M APK通路主要有:细胞外信号调节激酶（extracellular signal r eg ulated kinase,ERK ffi路、p38MA PK 通路、c jun 氨基末端激酶（c jun N term inal kinase,JNK通路和ERK5 通路［1］。其中,p38MAPK 是M APK 家族中的重要成员。
ERK5信号通路研究现状
World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2014, 4, 41-46 Published Online October 2014 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,/10.12677/wjcr.2014.44008 Review of the ERK5 Signaling Pathway Research Song Luo*, Shengfa Su, Weiwei Ouyang#, Bing Lu# Teaching and Research Section of Oncology, Guiyang Medical University, Guiyang Email: 4567436@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,, #ouyangww103173@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,, #lbgymaaaa@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html, Received: Sep. 25th, 2014; revised: Oct. 16th, 2014; accepted: Oct. 20th, 2014 Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Extracellular signal regulated kinase 5 (ERK5) is an important part of mitogen activated protein kinase (MAPK) system, and also is a new signal transduction pathway of MAPK signaling system, which has attracted much attention in recent years. ERK5 can be activated by many stimulating factors and plays an important role in cell survival, proliferation and differentiation. Furthermore, ERK5 is closely related to vascular development and proliferation, and other critical functions. This paper focuses on the origin, structure, property, physiological features of ERK5, and the relation-ship between ERK5 and tumor and non-oncologic diseases, and reviews the research direction in the future. Keywords ERK5, Signaling Pathways, MAPK ERK5信号通路研究现状 罗松*，苏胜发，欧阳伟炜#，卢冰# 贵阳医学院肿瘤学教研室，贵阳 Email: 4567436@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,, #ouyangww103173@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html,, #lbgymaaaa@https://www.wendangku.net/doc/0917504048.html, 收稿日期：2014年9月25日；修回日期：2014年10月16日；录用日期：2014年10月20日 *第一作者。 #通讯作者。
常见的信号通路
1JAK-STAT信号通路 1)JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。(1)酪氨酸激酶相关受体（tyrosinekinaseassociatedreceptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生 长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2)酪氨酸激酶JAK（Januskinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosinekinase,RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Januskinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸、JAK1个成员：4蛋白家族共包括JAK结构域的信号分子。SH2化多个含特定
JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAKhomologydomain,JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3)转录因子STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2)JAK-STAT信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传 递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（dockingsite），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK 催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二 聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。值得一提的是，一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶，但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6，而IL-12 。STAT4却特异性激活
(完整版)细胞信号转导研究方法
细胞信号转导途径研究方法 一、蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图：
2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）
Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、GST pull-down assay GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７ 综述 文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３ 蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用 李敏，周慧，崔银秋 吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１ ［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限 性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修 饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。 ［关键词］蛋白质组学；信号转导 ［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。 １信号蛋白的寻找和确定 细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。 ２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶 ［收稿日期］２００６－０８－３０ ［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３） ［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生 ［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ３３６
信号通路研究思路
信号通路研究思路
证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是： 要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。 其次，要证明你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 首先证明P38表达增加会导致损伤。 这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。 这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。 如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。） 其次，要证明你的药物存在保护作用。
当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。 这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。 PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因
常见的信号通路
1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3
Notch信通路
Notch信号通路简介 命名由来：功能下调会导致果蝇翅膀缺刻。 【1】主要功能 参与发育过程中的细胞分化。参与决定细胞命运。 1.影响果蝇与脊椎动物的神经分化。 在果蝇Notum中，Notch首先确定有分化成神经潜能的细胞的数量（lateral inhibition），再决定这些细胞的后代中哪些分化成神经，哪些分化成神经胶质（lineage decisions）。 2.果蝇翅膀中Notch信号通路决定D-V界限，它的缺失可能引起翅的缺刻。 2龄幼虫开始形成背腹间隔，选择基因Ap(apterous)在翅膀的背区表达，诱导Fringe 和Serrate 在背隔间区表达，而Delta则在背腹区均有表达。在背间隔区，Fringe抑制serrate的功能，而促进Dl的功能。所以，serrate在靠近DV界限的腹间隔区激活Notch(没有fringe),而Dl在靠近DV界限的背间隔区激活Notch(fringe激活其活性)。 Notch信号可能与癌症相关。 50% 的 T-cell acute lymphoblastic leukaemias中都可以检测到Notch 1的突变。Notch还参与调控血管的生成。
Notch信号可能与免疫相关。 它可以促进Tαβ细胞的形成，与Gata 3基因协同调控 CD4+细胞向Th 1/Th 2 类型的分化[7]，并且可增加外周免疫器官边缘区B 细胞的数量。 ¤- Notch信号通路只能影响相邻的细胞。没有二级信使，信号传递速度快。 ¤-相邻细胞可以通过Notch受体与配体的结合传递Notch信号，从而扩大并固化细胞间的分子差异，最终决定细胞命运，影响器官形成和形态发生。 ¤-Notch信号在细胞中常被反复激活，决定不同的细胞命运。（比如神经细胞的分化、比如翅形态建成） 【2】信号通路的成员 Serrate (Jagged1、Jagged2 in mammals) ★ 功能：Notch配体，激活受体细胞Notch信号通路。 类别：膜蛋白，with epidermal growth factor (EGF)-like repeats Delta ★ 功能：Notch配体，激活受体细胞Notch信号通路。 类别：膜蛋白，with epidermal growth factor (EGF)-like repeats Lag-2 功能：线虫中的Notch配体
信号通路研究思路
证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是： 要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。 其次，要证明你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 首先证明P38表达增加会导致损伤。 这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。 这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。 如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。） 其次，要证明你的药物存在保护作用。 当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。 这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。 PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及DNA-PK。相对而言，MEK1/2
Notch信号通路在血管生成中的作用研究进展
四综述四 D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2012.004.015基金项目:国家自然科学基金资助项目(81170036)作者单位:410011长沙, 中南大学湘雅二医院呼吸内科通信作者:陈平,E m a i l :p i n g c h e n 0731@s i n a .c o m N o t c h 信号通路在血管生成中的作用研究进展 纵单单 陈平 陈燕 ?摘要? 血管生成存在于机体生长发育的各个阶段三N o t c h 信号是细胞间相互作用的重要信使,大量的研究发现N o t c h 信号在细胞分化及血管生成方面发挥重要的调控作用三N o t c h 信号参与生理性血管生成可能与以下机制有关:调节尖细胞与茎细胞的分化,调节动静脉分化二内皮祖细胞二血管壁细胞二 血管内皮生长因子二一氧化氮以及与其他信号通路相互作用三此外,N o t c h 信号在肿瘤以及损伤后组织修复等病理性血管生成中亦发挥重要作用三明确N o t c h 信号的作用机制对疾病的治疗有重要意义三 ?关键词? N o t c h 信号通路; 血管生成;内皮祖细胞;血管内皮生长因子;肿瘤R e s e a r c ha d v a n c e o fN o t c h s i g n a l i n g i nm o d u l a t i o n o f a n g i o g e n e s i s Z O N GD a n -d a n ,C H E NP i n g ,C H E N Y a n .D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eS e c o n d X i a n g y a H o s p i t a l ,C e n t r a lS o u t h U n i v e r s i t y ,C h a n g s h a 410011,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :C H E NP i n g ,E m a i l :p i n g c h e n 0731@s i n a .c o m ?A b s t r a c t ? A n g i o g e n e s i s e x i s t s i n v a r i o u s s t a g e s o f t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f t h e b o d y .N o t c h s i g n a l i n g i s a c e l l -c e l l s i g n a l i n gp a t h w a y .R e c e n t s t u d i e sh a v e s h o w n t h a tN o t c hs i g n a l i n gp l a y s a r o l e i n s e v e r a lb i o l o g i c p r o c e s s e s ,s u c ha sc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n da n g i o g e n e s i s .N o t c hs i g n a l i n g i n v o l v e di n p h y s i o l o g i c a la n g i o g e n e s i s m a y b er e l a t e d t o t h ef o l l o w i n g m e c h a n i s m s :r e g u l a t e st h et i p /s t a l lc e l l d i f f e r e n t i a t i o n ,a r t e r i a l - v e n o u s d i f f e r e n t i a t i o n ,e n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s ,m u r a l c e l l s ,v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ,n i t r i c o x i d e a n d c o o p e r a t e sw i t ho t h e r s i g n a l i n gp a t h w a y s .I na d d i t i o n ,N o t c h s i g n a l i n gp l a y sa ni m p o r t a n t r o l e i n p a t h o l o g i c a l a n g i o g e n e s i s ,s u c ha st u m o ra n g i o g e n e s i sa n di m p a i r s r e p a r a t i v e a n g i o g e n e s i s a f t e r i s c h e m i a .T h e r e f o r e ,a c l e a rm e c h a n i s mo f t h eN o t c h s i g n a l i n gp a t h w a y c a n p r o v i d e a v a l u a b l e t h e r a p e u t i c s t r a t e g y f o r t h e d i s e a s e s .?K e y w o r d s ? N o t c h s i g n a l i n g p a t h w a y ;A n g i o g e n e s i s ;E n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s ;V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ;T u m o r N o t c h 信号通路最初发现于果蝇, 是一条高度保守的信号传导途径,广泛存在于各种生物体内,在机体生长发育过程中起到关键作用,从多方面调控细胞增殖二分化及凋亡三近年来大量研究表明 N o t c h /D l l 4信号通路在血管生成中起到重要作用三本文就N o t c h 通路在生理性及病理性血管生成中的作用及其调控机制作一综述三 1 N o t c h 信号通路组成 N o t c h 信号通路是一条高度保守的信号转导途径,由胞外配体二跨膜受体二D N A 结合蛋白及靶基因四部分组成三哺乳动物体内含4种同源N o t c h 受体(N o t c h 1~4)及5种同源配体(D l l 1二D l l 3二D l l 4二 J a g 1二J a g 2)[1 ]三N o t c h 受体是Ⅰ型单跨膜蛋白,包括胞外部分二跨膜部分及胞内部分三N o t c h 蛋白的 胞外部分均含有36个串联排列的表皮生长因子 (e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ,E G F )样重复系列以及3个富含半胱氨酸的L N R 样重复序列三部分E G F 样序列可与相邻细胞的配体结合,L N R 样重复序列 则调节受体胞内与胞外区域的相互作用[ 2-3] 三跨膜部分主要由C a 2+ 依赖的非共价键结合形成的异源二聚体构成三胞内部分由R AM 结构域(R B P 结合 区),核定位序列N L S ,7个锚蛋白重复序列A N K 结构域,富含脯氨酸二谷氨酸二丝氨酸及苏氨酸的P E S T 结构域,以及翻译启动区T A D 五部分组成三N o t c h 配体也是表达于细胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白,配体胞外D S L 区域负责与N o t c h 受体及部分E G F 样重复序列结合[1,3 ]三N o t c h 信号由相邻两个细胞 的N o t c h 受体和配体相互作用而激活, 受体与配体结合导致受体构象发生改变,跨膜部分被连续切割, 四 992四国际呼吸杂志2012年2月第32卷第4期 I n t JR e s p i r ,F e b r u a r y 2 012,V o l .32,N o .4