蛋白质酪氨酸硝基化与糖尿病关系的研究进展
蛋白质酪氨酸硝基化与糖尿病关系的
研究进展
马邵。叶青
（山东大学医学院，山东济南２５００１２）
［关键词］糖尿病；过氧化亚硝酸阴离子；蛋白质硝基化
［中图分类号］Ｒ５８７．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２－２６６Ｘ（２００９）０７－０１１５－０３
目前，糖尿病发病机制仍未完全阐明。近年来大量研究认为氧化应激或硝化应激时产生的蛋白质酪氨酸硝基化损伤与胰岛Ｂ细胞功能损伤、胰岛素结构的改变和功能障碍之间存在密切关系。近年来，关于蛋白质酪氨酸硝基化与糖尿病发病关系的研究进展迅速，现综述如下。
１蛋白质酪氨酸硝基化的产生和影响
机体在遭受有害刺激时，体内自由基包括过氧化亚硝酸阴离子（ＯＮＯＯ一）、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮等大量增加，使体内氧化能力超过抗氧化能力，引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白质硝基化及酶变性、ＤＮＡ损害，最后导致细胞死亡、凋亡和疾病的发生…。活性氧簇（ＲＯＳ）和活性氮簇（ＲＮＳ）是引起氧化应激和硝化应激的主要原因。ＲＮＳ的形成离不开ＲＯＳ，氧化应激伴随着硝化应激，ＲＮＳ／ＲＯＳ水平的升高将导致蛋白质酪氨酸的硝基化，生成３－硝基酪氨酸。在这些活性分子中。ＯＮＯＯ一既是一种强氧化剂又是一种强硝化剂，性质很活泼，能够迅速与周周物质发生反应，是引起蛋白质酪氨酸硝基化损伤的主要因素。体内ＯＮＯＯ一半衰期很短，而硝基酪氨酸则可作为蛋白质被ＯＮＯＯ一等攻击后留下“分子指纹（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）”。蛋白质中的酪氨酸硝基化与酪氨酸磷酸化有所不同，磷酸化发生在羟基上的４位，而硝化发生在３位。酪氨酸硝基化时，羟基的ｐＫａ值降低２—３个单位。在生理ｐＨ条件下，负电荷会在含硝基酪氨酸的蛋白质上聚积，空间位阻增加，从而改变周围的化学环境，使蛋白质结构发生变化，如新的抗原表位生成、酶催化活性改变，代谢方式调整及影响酪氨酸磷酸化等¨】。游离的硝基酪氨酸通过诱导Ｈ：Ｏ：的产生介导ＤＮＡ损伤，影响蛋白质的转录合成，损害细胞功能。在细胞信号转导中酪氨酸磷酸化具有蘑要的细胞信号转导作用，而酪氨酸硝基化后抑制了其磷酸化，导致信号转导过程的失控。动物模型研究显示，在氧化或硝化应激过程中，线粒体内有些重要的蛋白质酶类，如Ｍｎ－ＳＯＤ、细胞色素ｃ、电压依赖的阴离子通道、ＡＴＰ酶和琥Ｉｆｊ酰ＣｏＡ等发生酪氨酸硝基化，结果导致呼吸链传递障碍，使线粒体的ＡＴＰ合成减少，导致细胞内能量耗竭，出现细胞凋ｒ＝和坏死’３１。有学者发现，糖尿病动物模型线粒体蛋白质中的硝基酪氨酸水平明显增高，且与电镜观察的线粒体超微结构病理变化相吻合，即线粒体蛋白质硝基化导致了线粒体的病理损伤卜Ｊ。
２蛋白质酪氨酸硝基化与糖尿病的关系
２．１蛋白质酪氨酸硝基化与胰岛Ｂ细胞功能障碍有学者在糖尿病动物模型试验中采用单克隆抗体免疫酶标染色发现胰岛中硝基酪氨酸细胞。阳性率为糖尿病ＮＯＤ小鼠２２％，正常血糖ＮＯＤ小鼠７％，对照ＢＡＬＢ／ｃ小鼠２％。经进一步鉴别，发现这些胰岛硝基酪氨酸阳性细胞是Ｂ细胞或巨噬细胞。从糖尿病ＮＯＤ．小鼠胰岛分离的绝大部分Ｂ细胞硝基酪氨酸检测阳性，对照的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠胰岛内几乎没有硝基酪氨酸阳性Ｂ细胞。通过加入自由基清除剂或ＯＮＯＯ一抑制剂，减少胰岛中硝基酪氨酸阳性细胞，可以阻滞糖尿病的发生发展【ｌＪ。有学者从脏器捐助者（８例非糖尿病患者和５例２型糖尿病患者）的胰腺中分离出胰岛，经纯化和活性鉴定后进行培养，结果２型糖尿病胰岛比非糖尿病胰岛培养基中分泌的胰岛素水平明显减低，而硝基酪氨酸水平显著增高。在２型糖尿病胰岛培养基中加入自由基清除剂（ＩＡＣ）后，硝基酪氨酸水平显著下降，糖诱导胰岛素分泌情况明显改善；非糖尿病胰岛培养基中加入ＩＡＣ后胰岛素分泌情况没有变化瞪】。证实２型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素功能与硝基酪氨酸水平关系密切。另外有人对１３例非糖尿病患者和１３例２型糖尿病患者尸体的胰岛进行培养和功能研究，发现２型糖尿病胰岛的胰岛素分泌水平明显下降，硝基酪氨酸水平明显增高；然而当２型糖尿病胰岛暴露于谷胱甘肽（还原作用）２４ｈ后，糖诱导胰岛素释放水平显著改善，且硝基酪氨酸水平明显下降，胰岛素ｍＲＮＡ表达亦有恢复。证实胰岛中蛋白质酪氨酸硝基化与胰岛素水平下降有关；这种胰岛功能性缺陷是可逆的，通过减少胰岛中硝基酪氨酸水平可得到部分恢复怕Ｊ。
２．２蛋白质酪氨酸硝基化与胰岛结构和功能障碍蛋白质酪氨酸硝基化不仪能引起胰岛Ｂ细胞损伤，还可引起胰岛素空问结构变化而影响其功能。胰岛素有４个酪氨酸残基，其位置处于胰岛素受体结合部位。在氧化或硝化应激状态下，这４个酪氨酸残基可能成为ＯＮＯＯ一作用的靶点。有人研究了ＯＮ００一对猪胰岛素的作用，发现ＯＮＯＯ一可使胰岛素硝基化而牛成单硝化和多硝化产物，并且反应具有选择性。分离出的单硝化胰岛素其受体结合能力为正常胰岛素的６９％，
１１５
万方数据
且活性有一定程度的降低。硝基化胰岛素的二级结构也发生了变化，位螺旋的含量明显降低¨】。另一项研究通过体外合成的ＯＮＯＯ”使猪胰岛素硝摹化，硝基化后的胰岛素与受体的结合能力下降¨Ｊ。汪铁林等体外证明ＯＮＯＯ一可以使胰岛索的酪氨酸硝基化而引起结构的变化，某些抗氧化剂可以抑制该硝基化作用归Ｊ。
２．３蛋白质酪氨酸硝基化与糖尿病及其并发症糖尿病患者体内硝基酪氨酸水平与血压升高或糖化血红蛋白水平有一定关系。有研究表明ｌ型糖尿病患者硝基酪氨酸水平明显高于正常对照组，硝基酪氨酸增高的糖尿病患者血压增高，硝基酪氨酸水平与血压呈正相关¨…。有人对４０例无高血压及蛋白尿的２型糖尿病患者观察６０ｄ，定期检测糖化血红蛋白和硝基酪氨酸。结果发现，糖化血红蛋白和血浆硝基酩氨酸在任何时段均呈正相关性…Ｊ。有人检测了５５例２型糖尿病患者硝基酪氨酸水平，发现其血清硝基酪氨酸含量均显著高于对照组，且与空腹血糖值呈正相关，表明高血糖可诱导体内硝基酪氨酸水平增高。为消除年龄、性别、体质量指数、腰臀比、血压、空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油对硝基酪氨酸的影响，有人以年龄、性别、体质量指数、收缩压等因素为协变量进行统计学分析，结果显示２型糖尿病组硝基酪氨酸水平显著高于正常对照组，进一步证实硝基酪氨酸在２型糖尿病的发病过程中具有重要作用¨“。
心血管病变、视网膜病变和肾脏病变是糖尿病的常见并发症，血管病变是其重要原因。血管内皮功能失调是导致糖尿病动脉粥样硬化的关键因素。为证明高胰岛素水平和糖尿病状态的同时存在是否会引起血管内皮细胞功能障碍，有人用含胰岛素的培养基对糖尿病大鼠的主动脉环进行体外培养，结果发现，主动脉环对乙酰胆碱的反应能力明显减弱，培养基内的过氧化和硝基化产物大大增加，硝基酪氨酸和硝基化的肌浆网钙泵（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＣａ２＋－ＡＴＰａｓｅ，ＳＥＲＣＡ２ａ）明显增加。ＳＥＲＣＡ２ａ的硝基化后功能失活，引起血管内皮细胞松弛障碍¨３。。有人对糖尿病患者心脏活检发现硝基化酪氨酸阳性的内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞均有明显的细胞凋亡¨“。在链脲酶素诱导的糖尿病大鼠模型中发现主动脉平滑肌硝基酪氨酸显著增加。研究表明糖尿病模型中ＯＮＯＯ．的升高导致主动脉平滑肌酪氨酸硝基化，使血管平滑肌ＳＥＲＣＡ２ａ功能紊乱¨“。另一项研究表明，链脲酶素诱导的糖尿病大鼠模型与对照组相比较硝基酪氨酸显著增加。前列环素合成酶的酪氨酸硝基化影响了前列环素水平，从而影响了血管的收缩活性¨“。在糖尿病神经病变研究方面的动物实验显示，高血糖可刺激超氧阴离子生成ＯＮＯＯ．，导致内皮和神经髓鞘的损伤。坐骨神经和本体感觉神经的传导减慢【１“。另一个糖尿病实验动物模型的研究发现，视网膜内皮细胞中酪氨酸硝基化是导致血液．视网膜屏障被破坏的重要原因之一【１７’；糖球病患者视网膜病变发生率随着糖化血红蛋白升高而升高¨“。
综上所述，蛋白质酪氨酸硝基化在糖尿病及其并发症的发生、发展过程中起重要作用；减少蛋白质酪氨酸硝基化可阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生发展。深入研究蛋白１１６质酪氨酸硝基化与糖尿病之间的相互关系，不仅有助于了解糖尿病及其并发症的发病机制，且可为糖尿病及其并发症的治疗提供重要依据。
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（收稿日期：２００８—１２－２８）
６４排ＳＣＴ胆囊动脉血管成像结果分析
杨春波．周茂义，刘静，李丽新，岳奎涛。张东雯
（潍坊医学院附属医院，山东潍坊２６１０３１）
腹腔镜月避囊切除术相关并发症发生率相对高于传统开
腹手术，其主要原因在于胆囊三角内胆囊动脉变异较多见。
据文献报道，典型的单支走行于Ｃａｈｔ三角内的胆囊动脉仅
占７０％左右。因胆囊动脉起源和走行变异是造成手术困难
和术中大出血而被追开腹的重要原因，故术前行胆囊动脉血
管成像检查非常必要。２００６～２００８年，我们对１２０例患者行
胆囊动脉血管成像检查，并采用ＭＰＲ、ＭＩＰ、ＶＩＰ、ＶＲ技术重
建胆囊动脉，比较各种血管后处理技术对胆囊动脉解剖变异
的显示．现分析结果。
资料与方法：行胆囊动脉血管成像检查的患者１２０例，
男５２例，女６８例；年龄２６—８２岁，平均“岁。采用ＰＨＩＬ－
ＩＰＳ６４排ＳＣＴ扫描机和德国Ｕｒｉｃｈ双筒高压注射器行血管
成像检查：仰卧位，扫描范围自膈顶至胰腺钩突下缘，层厚０．６２５ｃｍ，层距０．３３ｃｍ，使用高压注射器经肘前静脉以５
ｍｌ／ｓ速度注入优维显（３００ｍｇ／ｍ１）６０—８０ｍｌ。采用造影剂
自动跟踪技术，选取降主动脉为监测层面，当ＣＴ值达到１５０
Ｈｕ时启动扫描。采集的原始数据传至ＥＢＷ工作站进行后
处理，主要对原始图像进行连续观察并采用Ｍ口、ＶＩＰ、ＶＲ、
ＭＰＲ等重建技术对胆囊动脉行图像重建。由两位有多年工
作经验的ｃＴ医师在工作站对胆囊动脉解剖及变异图像进
行评价。
结果：①胆囊动脉起源和变异：１２０例中有９２例胆囊动
脉起源于肝右动脉，１５例起源自肝固有动脉，４例起源于胃
十二指肠动脉，６例起源于肝总动脉，３例起源于腹腔动脉。
ＭＩＰ、ｒＩＰ、ＶＲ、及ＭＰＲ图像上均显示胆囊动脉起源位置，但
以ＭＩＰ和ＶＲ图像更直观，尤其在出现胆囊动脉变异时，可
通过旋转ＶＲ三维图像避开重叠的血管，显示效果好。②胆
囊动脉支数：１２０例中，主干型９８例，双支型２２例。ＭＩＰ显
示胆囊动脉的分支最好，ＶＲ图像受阈值的限制胆囊动脉远
端显示差。ＭＰＲ对胆囊动脉的分支显示差。③胆囊动脉走
行：９８例主干型胆囊动脉在胆囊三角内走行者８２例；２２例
分支型中在胆囊三角内走行者１８例。ＶＩＰ图像显示胆囊三
角和胆囊动脉位置关系好，定位较ＭＰＲ图像准确，ＭＩＰ和?经验交流?
ＶＲ不能显示二者的解剖关系。④胆囊动脉主干管径：１２０
例患者管径为０．９—０．２６ｃｍ，平均０．１８ｃｍ，明显小于肝右
动脉，Ｍ１Ｐ、ＶＩＰ、ＭＰＲ、ＶＲ图像均能较准确测量胆囊动脉主
干管径。
讨论：６４排ＳＣＴ主要用于人体各部位血管成像，其重建
技术主要有ＶＲ、ＭＩＰ、ＭＰＲ、ｒＩＰ、ＣＰＲ等，其中以ＶＲ和ＭＩＰ
最常用。ＭＩＰ图像的获取简单快捷，其灰阶值能反映组织的
实际ＣＴ值，图像外观上最接近ＤＳＡ，能观察胆囊动脉的管
径、支数、走行，其中对胆囊动脉的起源显示较好，但因缺乏
立体感，对胆囊动脉起源有变异或血管重叠的情况不如ＶＲ
图像直观。ＶＲ利用１００％各向同性的容积数据，空问分辨
力高，适用于显示重叠的血管与邻近解剖结构的空间关系，
是目前最接近常规血管造影的最高级别的三维显示方法。
对胆囊动脉起源有变异者通过旋转图像可避开重叠血管，清
晰显示起源部位，但易受扫描条件、密度阈值、人为因素的影
响。ＭＰＲ重建技术是一种非常简便的二维成像方法，可以
在任意平面上重建图像，更好的显示胆囊三角与胆囊动脉的
关系，其简单、快捷，对病变的定位较ＭＩＰ准确，对胆囊动脉
进入胆囊壁位置显示有一定价值，但是显示胆囊动脉欠连
续，图像不直观。ＶＩＰ图像是显示胆囊动脉最佳的血管成像
方法，其将ＭＩＰ和ＭＰＲ成像技术的优点相结合，即可以象
ＭＩＰ一样完整的显示胆囊动脉，又可以显示胆囊三角和胆囊
动脉的解剖关系。ＣＰＲ是在ＭＰＲ基础上发展起来的新技
术，可将走行迂衄、不同平面的血管结构显示在同一层面上，
但仅能显示所处理的目标血管，不能正确反应血管的迂曲
和成角，对胆囊动脉观察价值不大。
胆囊动脉细小，图像后处理受人为因素影响较大，一般
层厚以５ｍｍ为最佳。后处理胆囊动脉血管我们的经验是先
用ＭＩＰ找到胆囊动脉’，再依次用ＶＩＰ、ＶＲ、ＭＰＲ成像，ＭＰＲ成
像时可以胆囊动脉起始部为中心轴旋转找到其进入胆囊壁
的人点，这样省时、省力且准确。
（收稿日期：２００８．１２－０２）
１１７万方数据
磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...
摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost
蛋白质修饰位点预测详解
蛋白质修饰位点预测详 解 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
蛋白质修饰位点分析目录
（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标 可以返回目录） 实验目的 找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说明为什么（注释） 找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) 预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus:
预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列： 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果
DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为：
蛋白质磷酸化概述
蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在
酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情
CBIM10024人3-硝基酪氨酸(3-NT)
人3-硝基酪氨酸（3-NT）试剂盒（ELISA） 使用说明书 ●本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样 本中人3-硝基酪氨酸（3-NT）的含量。 ●有效期：6个月 ●保存条件：2-8℃ ●本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断 实验原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人3-硝基酪氨酸（3-NT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人3-硝基酪氨酸（3-NT）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 样本处理及要求 1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。 4. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
蛋白酪氨酸激酶综述
蛋白酪氨酸激酶综述 目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被子识别。所有受体酷氨酸激酶都属于I型膜蛋白，其分子具有相似的拓朴结构：糖基化的胞外配体结合区，疏水的单次跨膜区，以及胞内的酪氨酸激酶催化结构域及调控序列。不同受体酪氨酸激酶结合，将导致受体发生三聚化，并进一步使受体胞内区特异的受体酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路。许多肿瘤的发生、发展都与酪氨酸激酶的异常表达有着极其密切的联系，下面将对几类与肿瘤的发生发展最为密切的受体酪氨酸激酶的研究迸展做一简介。 一、表皮生长因子受体（Epidermal grovth factor receptor, EGFR）家族 EGFRPE包括EGFR、ErbB2、ErbB4等4个成员，其家族受体酪氨酸激酶（RTK）以 单体形式存在，在结构上由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分组成，胞外区具有2个半氨酸丰富区，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。 人的egfr基因定位于第7号染色体的短臂（7p12.3-p12.1），它编码的产物EGFR由1210个氨基酸组成，蛋白分子量约为170kDa，其中，712-979位属于酪氨酸激酶区。EGFR的专一配体有EGF、TGF、amphiregulin,与其他EGFR家庭成员共有的配体有（cellulin(BTC)、heparin-binding EGF(HB-EGF)、Epiregulin(EPR) ）等。 EGFR在许多上皮业源的肿瘤细胞中表达，如非小细胞性肺癌，乳腺癌、头颈癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌、胶质细胞瘤等。另外，在一些肿瘤如恶性胶质瘤、非小细胞性肺癌、乳腺癌、儿童胶质瘤、成神经管细胞瘤及卵巢癌等中还可检测到EGFR缺失。最为常见的EGFR缺失突变型是EGFRⅧ，EGFR Ⅷ失去了配体结合区，但是可自身活化酪氨酸激酶，刺激下游信号通路的激活，而不依赖于与其配全结合。EGFR在许多肿瘤中的过表达和/或突变，借助信号转导至细胞生长失控和恶性化。另外，EGFR的异常表达还与新生血管生成，肿瘤的侵袭和转移，肿瘤的化疗抗性及预后密切相关。EGFR高表达的肿瘤患者，肿瘤恶性程度高，易发生转移，复发间期短，复发率高，患者的存活期短。 ErbB2，又名HER-2/neu，是EGFR家族的第二号成员，ErbB2通过与EGFR家族中其它三位成员构成异源二聚体，而发挥生物学作用，尚未发现能与其直接结合的配体。编码ErbB2的基因neu最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到，人类体细胞内neu基因的同源基因，又称为HER-2或erbB2，位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），它编码的产物ErbB2由1255个氨基酸组成，蛋白分子量约为185Kda，其中，720-987位属于酪氨酸激酶区。 ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌（25-30%）、卵巢癌（25-32%、肺静癌（30-35%）、原发性肾细胞癌（30-40%）等。过度表达的原因主要是ErbB2基因扩增（95%）或转录增多（5%）。 1987年，Slamon等人首行先报道了ErbB2扩增和乳腺癌临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素、孕激素等指标，并在以后的研究中得到大量证实。随后，ErbB2表达水平和乳腺癌治疗效果间的关系得到广泛研究，人们发现ErbB2高表达乳腺癌患者对他莫昔芬（tamoxifen）治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受。研究还表明，ErbB2在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移。ErbB2受体过度表达往往提示乳腺癌恶性程度高，转移潜力强，进展迅速，化疗缓解期短，易产生化疗和激素治疗抗性，生存率和生存期短，复发率高。 和ErbB4对肿瘤的作用目前尚不清楚，但在肿瘤形成模型的临床前研究发现，ErbB3、Erb3与EGFR、ErbB2共表达后会使肿瘤恶性程度明显增加。 二、血管内皮细胞生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）家族VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）,这一家族的受体在细胞外存在着7个免疫球蛋白样的结构域，在胞内酪氨酸激酶区则含有一段亲水手插入序列。
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B，PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。 PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，
PTP-1B的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： (1)与胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。 (2)在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3(STAT-3)和Janus激酶-2(JAK-2)的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 (3)PTP-1B通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B在催乳素信号传
酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病中的作用(1)(精)
酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病 中的作用(1) 】蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）在调节细胞生长、活化和分化的信号转导中起着重的作用。基因突变（多半由染色体移位）或者激酶的过度表达可使PTK活力异常增高，并介导异常的信号转导途径，在多种恶性血液病的发生发展中起着主的作用。在慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）、急性髓性白血病（AML）和间变性大细胞淋巴瘤的发病中，均存在着PTK的异常活化。进一步研究PTK相关的恶性血液病的发病机理，可以加快特异性的分子靶向治疗的研究进展。 【关键词】酪氨酸激酶恶性血液病；基因突变 Abnormal Activation of Tyrosine Kinases and Its Role in the Pathogenesis of Hematological Malignancies ——Review Abstract Protein tyrosine kinases are key participants in signal transduction pathways that regulate cellular growth, activation and differentiation. Aberrant PTK activity resulting from gene mutation (often accompanying chromosome translocation) or overexpression of these enzymes plays an etiologic role in several clonal hematopoietic malignancies. Other than the causative effect of PTK product of the bcr/abl fusion gene on chronic myelogenous leukemia (CML), more evidence suggests that mutated tyrosine kinases are pivotal in the pathogenesis of most of other chronic myeloproliferative disorders, such as chronic myelomonocytic leukemia (CMML) and hypereosinophilic syndrome (HES). And the exciting results in several dependent groups in 2005 showed that a single nucleotide JAK2 somatic mutation (JAK2V617F mutation) was found to be involved in the pathogenesis of polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF). In the leukogenesis of acute myeloid leukemias (AML), the losing of the control of the proliferation of hematopoietic progenitor cells was principally the results of the aberrant PTK activity, such as FLT3 and C kit overexpression. It works together with the loss of function mutation genes in promoting progenitor cell differentiation to confer AML's phenotypes. These upregulated PTK molecules represent attractive disease specific
酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的病理生理机制及防治措施
酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的病理生理机制及防治措施东南大学附属中大医院麻醉科吴琼景亮南京 210009 在全身炎症反应和感染性休克等病理条件下，炎性介质在激活NOS产生过量NO的同时还通过其他细胞途径增加O2-的产生。由于NO 与O2-反应的速度是正常状态下超氧化物歧化酶与O2-反应速度的3倍，使得NO首先捕捉O2-以极快的反应速度生成多种活性氧(O2-、HO-、H2O2、 ONOO-等)和活性氮（NO-、NO2-、N2O3等），这些产物除了造成氧化损伤外，还可与蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝化反应，生成稳定的代谢产物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）。由于正常人体血浆酪氨酸浓度大约为100 mol/L，这就为体内酪氨酸的硝基化提供了可能性。酪氨酸硝基化后使体内多种有重要功能的酶/蛋白功能受损或活性下降，损伤线粒体、DNA，抑制酪氨酸磷酸化，诱导细胞的凋亡和死亡。本文就酪氨酸硝基化的产生原因、对组织细胞功能的损伤及防治措施作一简略介绍。 一、酪氨酸硝基化的产生来源 正常生理条件下，组织细胞中活性氧（ROS）/活性氮（RNS）的生成与清除的平衡取决各种抗氧化物质和酶的浓度。但多种病理状态下这种生物平衡被打破，体内RNS/ROS生成增加,抗氧化物质活性下降。RNS/ROS的大量产生可以直接损伤蛋白质、核酸和脂质等生物大分子，而ROS与RNS相互反应可以产生更强的毒性效应，即酪氨酸的硝基化。一般认为导致酪氨酸硝基化有如下几个来源： 1、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-) 依赖的途径：O2-与NO在体内迅速反应形成ONOO-，ONOO-及其质子化形成的共轭酸ONOOH具有很强的氧化和硝基化作用，可以通过金属离子或金属蛋白（如Cu/Zn-SOD）的催化作用下与Fe3+活性中心反应形成中间产物（oxo-Fe4+）和NO2，NO2与酪氨酸的芳香环结合生成3-NT或者与酪氨酸直接反应，第一步生成酪氨酰自由基（TYR.）和NO2，NO2与TYR.基团结合形成终产物——3-NT。体外实验也证实，ONOO-确实可以使组织蛋白质发生硝基化反应，经ONOO-处理的细胞中，硝基化蛋白质的含量明显增高。 2、非ONOO-依赖的途径，其中包括：①过氧化物酶（Heme Peroxidase）依赖途径：在体内，过氧化物酶(包括髓过氧化物酶，辣根过氧化物酶，嗜酸粒细胞过氧化物酶等)能催化H2O2 和Cl-反应生成HOCl, NO2-可被HOCl氧化生成NO2Cl和NO2使酪氨酸发生硝基化反应；还能使亚硝酸盐和酪氨酸同时被氧化，分别生成NO2-和酪氨酰自由基（Tyr。）,后两者继续反应生成3-NT[1]。②铜/锌-过氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）催化途径：尽管不同的SOD有明显
蛋白质糖基化修饰研究进展
期末考核 课程：Glycobiology 蛋白质糖基化研究进展 姓名：马春 学号：2013113022 班级：生命科学与技术基地班 时间：2016.1.1
蛋白质糖基化研究进展 马春 （西北大学生命科学学院，陕西西安，710069） 摘要：糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。本文综述了糖基化的分类、在生命体中的作用、糖基化位点分析及糖链分析方法等。 关键词：蛋白质糖基化;分析方法 生命体是一种极其复杂且动态变化的有机系统，不断发生着各种生物化学反应，进行新陈代谢，并协调、控制各部分生物功能的发挥。蛋白质是生命体内各种生化反应的载体和生物功能的执行者，如分子识别、信号转导、免疫应答等。蛋白质功能的正常发挥保证着生命有机系统正确、有序、高效地运转。基因在转录和翻译后产生具有特定序列的氨基酸长链，即蛋白质的前体，再经过共价修饰、折叠、卷曲并形成特定的空间构象后，成为具有正常功能的成熟蛋白质。而共价修饰在这个成熟过程中发挥着重要的调节作用。不仅如此，蛋白质成熟后的许多关键功能，特别是涉及控制、调节等方面的功能，都是通过共价修饰实现的。这些发挥重要功能的共价修饰，就是蛋白质翻译后修饰它们使蛋白质的结构更为合理、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一。翻译后修饰可以发生在蛋白质的任一位点上，并且种类繁多，目前有文献报道的翻译后修饰就多达数百种，常见的有碟酸 化修饰、糖基化修饰、乙醜化修饰等。 蛋白质糖基化修饰是最广泛、最复杂、最重要的翻译后修饰之一，据推断有超过的蛋白质都发生了糖基化修饰。这些糖蛋白广泛分布于生命体中，特别是在细胞膜上和体液中含量丰富，大部分膜蛋白和分泌蛋白都是糖蛋白。糖基化修饰不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。 1 糖基化类型 糖蛋白中的糖部分被称为聚糖。而己糖则是聚糖中最常见的组分。包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式，如葡萄糖的α-羟基被酰化氨基取代生成N-乙酰葡糖胺。根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类： 1.2 N位糖基化 聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺，而且连接方式总是β构型。N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。在N位糖基化中Asn-Xaa-Ser ／ Thr（Xaa 是除Pro外的任何氨基酸）被认为是N位糖基化的先决条件，不过少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也可以糖基化。 1.1 O位糖基化： 聚糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上,但并没有发现特异的序列作为糖基化位点.O位多聚糖以逐步加接
蛋白酪氨酸激酶简介
蛋白酪氨酸激酶简介 癌症极大威胁人类健康，抗肿瘤研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。近年来，随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，可分为受体型和非受体型两种，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程。 蛋白酪氨酸激酶功能的失调则会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸基酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。因此，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿瘤药物研究的热点，为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点所无法匹敌的。 目前为止，已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入I-Ⅱ期临床试验阶段，个别的已经上市，并取得了令人鼓舞的治疗结果。基中，Genentech公司和罗氏药厂联合研究和生产的HerceptinTM(Trastuzumab)是一种抗酪氨酸激酶受体HER2/neu的人源化的单克隆抗体。1998年，美国食品的药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）正式批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌。2001年5月，N ovartis公司研发的针对酪氨酸激酶Bcr-Abl的抑制剂GleevecTM (imatinib mesylate)由于对治疗慢性髓样白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）具有非常好的疗效，尚未完成Ⅲ期临床就被FDA批准提前上市，用于治疗费城染色体呈阳性（Philadelphia chromosome – positive, Ph+）的慢性髓样白血病患者，引起了巨大的轰动。GleevecTM是第一个在了解癌症的病因后鸽是设计开发，并取得了显著成效和的肿瘤治疗药物，它的研发成功可以说是癌症治疗的一个里程碑。这一重大成就被美国《科学》杂志列入2001年度十大科技新闻。纽约《时代》杂志将其作为杂志的封面，称GleevecTM 开创了药物研发的新时代。2002年2月，美国FDA又批准GleevecTM 用于胃肠基质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GLST）的治疗。2002年7月，AstraZeneca公司研发的IressaTM (ZD1839又被美国FDA批准用于治疗经过标准含铂类方案和紫杉萜化疗后仍然继续恶化的终未期非小细胞肺癌患者，这也是第一种用于实体瘤治疗的针对特定靶点挑战分子酪氨酸激酶抑制剂。Herceptin，Gleevec以及Iressa的上市进一步证明了以特定靶点尤其是以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研发是21世纪最有可能获得突破性进展的抗肿瘤药物领域，具有十分广阔的前景。
磷酸化蛋白质组学
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 图片来源：https://www.wendangku.net/doc/0911259456.html,/wiki/Phosphoproteomics
蛋白质磷酸化1
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
蛋白质酪氨酸磷酸化_免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较_陈沙力
蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Wes tern 印迹两种方法的比较 * 预防医学院放射生物实验室 陈沙力 刘树铮 提 要 为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,采用免疫 沉淀法及Western 印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明,照射后17500、22000、28000、32000、40000、43000及53000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Western 印迹结果表明,照射后28000、32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western 印迹法。 关键词 蛋白质 磷酸化 免疫沉淀 免疫印迹中图号 R331 蛋白质酪氨酸磷酸化是多种刺激因素诱导激活基因表达的细胞信息传递通路中的基础步骤,也是电离辐射激活淋巴细胞PKC 信息传递 通路及转录因子N F -kB 最基本的步骤〔1〕。预先的研究表明,低剂量电离辐射可诱导小鼠胸腺细胞数种蛋白分子发生变化〔2〕,其中包括辐射刺激引起蛋白分子的甲基化、糖基化及磷酸化等化学修饰变化。研究蛋白质磷酸化在细胞信息传递中的作用具有重要的意义。本研究采用免疫沉淀及Western 印迹两种方法对辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白分子磷酸化进行了比较研究,现将结果报告如下。 1 材料和方法1.1 动物及照射条件 健康雄性昆明小鼠,体重18～22g 。采用Philips 深部X 射线机照射动物,电压200kV ,电流10m A,滤板0.5mm Cu,1.0mm Al,靶皮距离212cm 。单次全身照射,剂量率为12.5m Gy /min ,剂量为75m Gy 。 1.2 小鼠胸腺细胞分离及金黄色葡萄球菌Cow an I 株(SAC )的活化、纯化、鉴定、增殖、回收及处理 * 国家自然科学基金资助课题(39270207)参见文献〔3,4〕。 1.3 免疫沉淀 1.3.1 H 332PO 4代谢标记胸腺细胞及细胞裂解 用无磷酸盐RPM I 1640培养液(Sig-ma )调细胞浓度至107个/ml ,加入H 332 PO 4(中科院原子能研究院)4.625×109 Bq /ml,37℃平缓摇动培养3h ,冷生理盐水洗涤2次并溶解于细胞裂解液(50mmol /L Tris,p H 7.5,150 mm ol /L Na Cl ,1 %N P -40,0.1mol /L NaF ,10mm ol /L Na 3VO 4,5mm ol /L EDT A,1mmol /L PM SF ,2U Aprotinin )中,冰浴30min ,间或振荡,反复通过22号针头,15000r /min 离心20min ,上清移至另一离心管中。 1.3.2 细胞裂解物的预清除 将S AC 置离心管中,7000r /min 离心15min,将沉淀悬于含0.05%N P -40的细胞裂解液中至原体积,加等体积的无关杂交瘤细胞培养上清,冰浴30min ,用细胞裂解液洗涤3次,再以1/2原体积裂解液悬浮,终浓度为20%。将等体积S AC 加到裂解上清中,冰浴2h,4℃12000r /min 离心15min ,小心取出上清保存备用。 1.3.3 抗原抗体复合物的形成 将细胞裂解上清(抗原)分为两等份,置于微量离心管中(3×106 细胞),各加入N ET-明胶缓冲液(50 — 678—第23卷 第6期1997年 白 求 恩 医 科 大 学 学 报J .N.BET HU N E U N IV.M ED.SCI. V ol.23 N o.6 1997
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)
(完整word版)蛋白质糖基化类型与点
1.2蛋白质糖基化类型与特点 蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰,是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质,和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。研究表明,70%人类蛋白包含一个或多个糖链,1%的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种:N-糖基化、0-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。大多数糖蛋白质只含有一种糖基化类型,但是有些蛋白多肽同时连有N-糖链、O-糖链或糖氨聚糖。 (l) N-糖基化:糖链通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH 基共价连接,将这种 2 糖基化称为N-糖基化。N-连接的糖链合成起始于内质网(ER),完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的特征序列为Asn-X-Ser/Thr(X代表任何一种氨基酸)的天冬酰胺上,天冬酰胺作为糖链受体。核心寡聚糖是由两分子N-乙酰葡萄糖胺、九分子甘露糖和三分子葡萄糖依次组成,第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合,当ER膜上有新多肽合成时,整个糖链一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后,在ER 中进一步加工,依次切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。在ER形成的糖蛋白具有相似的糖链,由Cis面进入高尔基体后,在各膜囊之间的转运过程中,原来糖链上的大部分甘露糖被切除,但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子,形成了结构各异的寡糖链。血浆等体液中蛋白质多发生N-糖基化,因此N-糖蛋白又称为血浆型糖蛋白。 (2) O-糖基化:糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接。0-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此与糖基化相比,0-糖基化分析会更加复杂。0-连接的糖基化在高尔基体中进行,通常第一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖,连
蛋白酪氨酸激酶
蛋白酪氨酸激酶(PTK)是多种肿瘤最常见的生长因子受体，抑制其活性可破坏肿瘤细胞的信号传导，抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成，而对正常细胞影响较小。常见的受体型包括表皮生长因子受体(EGFR)家族、胰岛素受体(IGFR)家族、血小板衍化生长因子受体(PDGFR)家族、VEGFR家族、纤维细胞生长因子受体(。FGFR)家族等。非受体型包括SRC、ABL、JAK、ACK、CSK、FAK、FES、FRK、TEC、SYK家族等。以PTK为靶点的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年抗肿瘤药研究的热点。2005年之前，美国FDA批准以PTK为靶点的单克隆抗体曲妥珠单抗(1998年)、贝伐单抗(2004年)和西妥昔珠单抗(2004年)和小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(2001年)、吉非替尼(2003年)、埃罗替尼(2004年)等靶向药物应用于临床。2005年后TKI制剂不断上市，且多靶点药已成为新的研究方向。 Neratinib 伯舒替尼(Bosutinib，惠氏公司)是强效Src和Abl激酶双重抑制剂，既能抑制多种人肿瘤细胞中Src蛋白的自主磷酸化，也能抑制Src和Ab底物的磷酸化过程，具有高效的抗增殖活性，可抑制CMI。细胞的增殖和存活，对伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼等已产生耐药的CML，或ALL患者也取得了较好的疗效。目前，正在进行CML的Ⅲ期临床研究。 Motesanib(安进公司)能选择性地作用于VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR和c-kit受体，可致内皮细胞程序性死亡增加和血管面积减少，抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤消退。目前，本品NSCLC的Ⅲ期临床研究正在进行中；其GIST、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌等适应证的研究也处于Ⅱ期临床研究阶段。 凡德他尼(Vandetanib，阿斯利康公司)是口服小分子EGFR、VEGFR、RET多靶点酪氨酸激酶抑制剂。Ⅱ期临床显示，单用或与多西他赛联合用药，其在NSCLC患者的二线／三线治疗中均有效。 Vatalanib(拜耳／诺华)是经高通量筛选出的VEGF、PDGF、c-kit多靶点小分子TKl，对VEGFR-2作用最强。与FOLFOX方案联合治疗转移性结直肠癌的2个Ⅲ期研究正在进行中。目前，发现体内乳酸脱氢酶水平较高的患者疾病PFS显著提高。 BIBtr 1120(勃林格殷格翰公司)是一种新的口服抗血管生成药，抑制VEGF、PDGF、FGF等的作用，目前分别开展了治疗晚期卵巢癌和NSCLC的Ⅲ期临床研究。