大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA得提取
一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理
提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器
1)实验材料:大肠杆菌
2)实验试剂:
LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇
3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅
3、溶液配制
1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5
g/L,NaCl 10g/L,去离子水。
(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、)
2)TE缓冲液:
1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)
1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)
TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml
0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液
定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)
3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用)
4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到
65℃使之溶解,然后室温保存)
4、实验方法步骤
1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。
2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液
3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠
4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。
5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。
6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min
7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心10min
8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10min
9、取上清液,加入300ul得异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min
10、加500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min
11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解
12、溶解于20ul TE中,20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒:
1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒
DP30202 50次 420元
2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒
TaKaRa DV810A 50 650元
3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒
GD241101 Bacterial gDNA kit 50次 423元
GD241102 Bacterial gDNA kit 250次 1798元
4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒
BSC12S1 50次 400元
BSC12M1 100次 750元
5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒
D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210元
D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元
D335002 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 200 3350元
荧光定量PCR试验(标准曲线法) 定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR) 得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。其中靶可以就是 DNA、 cDNA 或 RNA。
【实验原理】
在实时定量实验中,反应就是在PCR 产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得PCR 产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。在PCR 得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。该预定义得PCR 循环范围称为基线。首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度(与基线循环相对应得 Rn 值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn [?Rn] 值)与阈值交叉得点。?Rn 值与阈值交叉得分数循环定义为 CT。
一、试验设计
使用StepOne软件中得Design Wizard(设计导向)创建新实验
1、定义实验属性
在Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验得标识信息,然后选择要设计得实验类型。
1)Experiment Name (实验名称)。
2)Barcode (条码),然后输入您得 PCR 反应板上得条码。(可不填)
3)User Name (用户名)。
4)ments (注释)。(可不填)
5)选择Quantitation (定量)实验类型
6)Next> (下一步)
2、定义方法与材料
在Methods & Materials (方法与材料)屏幕上,选择用于实验得定量方法、试剂、升降温速度与 PCR 模板。
1)将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。
将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。标准曲线实验确定样本中靶序列得绝对量。从已知量得稀释序列中构建得标准曲线用于归档结果。当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品与样本。
用于标准曲线实验得 PCR 反应包括以下组分:
? 样本－其中靶数量未知得样本。
? 标准品－数量已知得样本。
? 标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线得标准品稀释液 (例如,1:2、
1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。
? 重复数－含有相同组分与量得相同反应数。
? 阴性对照－含有水或缓冲液得样本,不含模板;也称为“无模板对照
(NTC)”。阴性对照应不会扩增。
2)为试剂选择TaqMan? Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。
–如果使用TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择TaqMan? Reagents ( TaqMan 试剂) 。TaqMan 试剂包括两个引物与一个TaqMan? 探针。引物设计用于扩增靶。TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。
切记！Applied Biosystems 不建议将TAMRATM 染料随StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。
–如果使用SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择SYBR? Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。SYBR Green 试剂包括两个引物与SYBR Green 染料。引物设计用于扩增靶。SYBR Green 染料可在结合到双链DNA 时产生荧光信号。SYBR Green 染料通常就是添加到反应得SYBR Green 母液得一部分。如果使用SYBR Green 染料:
选择Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶得解链曲线分析。将Standard (标准)选为升降温速度。Applied Biosystems 不提供SYBR Green 试剂得 Fast 母液。
3)为升降温速度选择Standard (~2 hours to plete a run) (标准 (约两小时完成运行)) 。
–如果为PCR 反应使用Fast 试剂,则选择Fast (~40 Minutes to plete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。
–如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂与 TaqMan 试剂) ,则选择Standard (~2 Hours to plete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行)) 。
4)为模板类型选择gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。
5)Next> (下一步) 。
3、设置靶
在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量得靶数量,然后为每个靶设置检测。
1)单击How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶？)字段,然后输入1(根据需要填)。
注意: 靶检测表中得行数将以您输入得数字更新。
2)选择Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。
建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线。
注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。
3)设置靶 1 检测:
a、单击Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入RNase P(示例)。
b、从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择FAM (默认) 。
–如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得5′ 端,则选择FAM。
–如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得5′ 端,则选择JOE。
–如果要将VIC? 染料加在您用于检测靶得TaqMan 探针得5′ 端,则选择VIC。
–如果您正使用 SYBR? Green 染料以检测双链 DNA,则选择SYBR。
c、从 Quencher (淬火基团)下拉菜单中,选择NFQMGB (默认) 。
–如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶得 TaqMan
探针得3′ 端,则选择NFQMGB。
–如果您正使用 SYBR Green 染料,则选择None (无) 。
4)Next> (下一步) 。
4、设置标准品
在Standards (标准品)屏幕上,为所有标准曲线输入反应板中得点数与重复数。对于每条标准曲线,输入起始量并选择序列倍数。
1)单击How many points do you need for each standard curve? (每条标准曲线您需要多少个点？)字段,然后输入5。
建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。
2)单击How many replicates do you need for each point? (每个点您需要多少次重复反应？)字段,然后输入3。
建议每个点三次重复反应。
3)为 RNase P (示例)检测定义标准品数量范围:
a、单击Enter Starting Quantity (输入起始量)字段,然后输入10000。
由于标准品数量得范围会影响扩增效率计算,因此应仔细为您得检测考虑标准品数量得适当范围:
–为了更准确地测量扩增效率,请使用大范围得标准品数量,扩大到5 个至6 个对数级之间。如果您为标准品指定大范围得数量,您需使用PCR 产物或高度浓缩得模板,如 cDNA 克隆。
–如果您得 cDNA 模板数量有限且/或靶就是低拷贝数转录物,或已知在给定范围之内,则可能需要小范围得标准品数量。
b、从 Select Serial Factor (选择序列倍数)下列菜单中,选择1:2。
序列倍数用于计算标准曲线所有点中得数量。如果您得起始数量就是最高数
量,则选择如1:2、1:3 之类得稀释倍数。如果您得起始数量就是最低数量,则选择如 2X、 3X 之类得浓缩倍数。
4)查瞧Standard Curve Preview (标准品曲线预览)窗格。标准曲线应包含如下点:10000、 5000、 2500、 1250 与 625。
5)Next> (下一步) 。
5、设置样本
在Samples (样本)屏幕上,输入反应板中要包括得样本、重复数与阴性对照数,然后选择样本/靶反应以进行设置。
1)单击How many samples do you want to test in the reaction plate? (您想在反应板中检测多少样本？)字段,然后输入2。(根据需要填)
2)单击How many replicates do you need? (您需要多少次重复反应？)字段,然后输入3。
建议对每个样本反应重复三次反应。
3)单击How many negative controls do you need for each target assay? (每个靶检测您需要多少阴性对照？) ,然后输入3。
建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。
4)4、设置样本 1:
a、单击Enter Sample Name (输入样本名)字段,然后输入pop1 (用于重复组 1) 。
b、保留 Color (颜色)字段中得默认设置。
5)设置样本 2:
a、单击Enter Sample Name (输入样本名)字段,然后输入pop2 (用于重复组 2) 。
b、保留 Color (颜色)字段中得默认设置。
6)选择All Sample/Target Reactions (所有样本/靶反应)以检测所有样本中得所有靶。
–选择All Sample/Target Reactions (所有样本/靶反应)以检测所有样本中得所有靶。
–选择Specify Sample/Target Reactions (指定样本/靶反应)以指定每个样本中要检测得靶。
7)在 Well Count (反应孔数)窗格中,确认存在:
? 6 个未知反应孔U
? 15 个标准品反应孔S
? 3 个阴性对照反应孔N
? 24 个空反应孔
8)在 View Plate Layout (查瞧检测板布局)选项卡上:
a、从Arrange Plate by (反应板布局方式)下拉菜单中,选择Rows (按行)
(默认) 。
b、从Place Negative Controls (放置阴性对照)下拉菜单中,选择Upper
Left(左上角) (默认) 。
9)Next> (下一步) 。
6、设置运行方式
在Run Method (运行方法)屏幕上,查瞧默认运行方法得反应体积与温度变化过程设置。若需要,您可调整默认运行方法或用Run Method (运行方法)库中得某种方法进行替换。
1)单击选择Graphical View (图形视图)选项卡 (默认)或Tabular View (表格视图)选项卡。
2)单击Reaction Volume Per Well (每个反应孔得反应体积)字段,然后输入25 μL。
为“反应体积/反应孔”输入介于10 至30 得值。StepOne 系统支持10 至30 μL 之间得反应体积。
3)确保温度变化过程设置显示保持与循环阶段。
–确保温度变化过程设置适合试剂。
–如果正执行一步法RTPCR 扩增,则包括一个反转录步骤。
如果实验需要一个不同得温度变化过程设置,调整温度变化过程设置或用Run Method (运行方法)库中得某个温度变化过程设置进行替换。Run Method(运行方法)库包括在 StepOne 软件中。
4)Next> (下一步) 。
7、查瞧反应设置
在Reaction Setup (反应设置)屏幕上,选择检测类型(如果使用TaqMan 试剂),然后查瞧为准备PCR 反应、标准稀释序列与样本稀释而计算得剂量。若需要,您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度与/或稀释后样本浓度。
切记！对反应板中得每个靶检测执行这些步骤。
完成 Reaction Mix Calculations (反应预混液计算)选项卡
1)选择 Reaction Mix Calculations (反应预混液计算)选项卡 (默认)。
2)从 Select Target (选择靶)窗格中,选择RNase P。
3)从 Assay Type (检测类型)下拉菜单中,选择Inventoried/Made to Order(库存/定制) 。
如果正使用 TaqMan 试剂,选择所使用得检测类型:
–如果正使用 Applied Biosystems TaqMan? Gene Expression Assays (库存/定制)或Applied Biosystems Custom TaqMan? Gene Expression Assays,则选择Inventoried/Made to Order (库存/定制)。
–如果正使用Primer Express? 软件设计检测,则选择Custom (定制)。
4)确认Reaction Volume Per Well (每个反应孔得反应体积)字段中显示25 μL。
为“反应体积/反应孔”输入介于10 至30 得值。StepOne 系统支持10 至30 μL 之间得反应体积。
5)确认 Excess Reaction Volume (额外反应体积)字段中显示10%。
包括额外反应体积以弥补移液过程中得损失。建议至少准备10% 得额外反应体积。
6)在 Reactions for RNase P ( RNase P 反应)窗格中:
a、确认 Master Mix Concentration (母液浓度)字段中显示2、0X。
b、确认 Assay Mix Concentration (检测预混液浓度)字段中显示20、0X。
c、查瞧 PCR 反应得组分与计算得剂量。
7)在 Standard Dilution Series for RNase P ( RNase P 得标准品稀释序列)窗格中:
a、单击Standard Concentration in Stock (储液中标准品得浓度)字段,然后输入20000。
b、单击 units (单位)字段,然后输入copies per μL。
c、查瞧为准备标准品稀释序列计算得剂量。
完成 Sample Dilution Calculations (样本稀释计算)选项卡
1)选择Sample Dilution Calculations (样本稀释计算)选项卡。
2)单击Diluted Sample Concentration (10X for Reaction Mix) (稀释后样本浓度)(对于反应预混液为 10X) ,然后输入6、6。
3)从单位下拉菜单中,选择ng/μL (默认) 。
4)查瞧为样本稀释计算得剂量。
8、实验材料订购
在 Materials List (材料列表)屏幕上,查瞧建议用于准备 PCR 反应板得材料列表。或者,您可从 Applied Biosystems Store ( Applied Biosystems 产品仓库)订购所建议得材料。创建购物篮,向购物列表中添加项目,然后登录以提交您得订单。您必须具有不受限制得网络连接才能访问Applied Biosystems Store ( AppliedBiosystems 产品仓库) 。
1)在 Applied Biosystems Store ( Applied Biosystems 产品仓库)网站上查找靶检测套件:
a、确保您得计算机已连接到因特网。
b、单击Enter Gene Name(输入基因名)字段,输入RNase P,然后单击FindAssay (查找检测套件) 。
c、在Find Assay Results (发现检测套件结果)对话框中,选择您得检测套件。
d、单击Apply Assay Selection (应用检测套件选择) 。
2)完成 Experiment Materials List (实验材料列表)窗格:
a、从 Display (显示)下拉菜单中,选择All Items (所有项) (默认) ,然后查瞧建议得材料。若需要,使用右侧得滚动条查瞧所有项。
3)用于进行定量实验得Inventoried/Made to Order 检测设计用于配合以下TaqMan? 母液使用:
TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix (2?), No AmpErase? UNG, 250 次反应,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, 200 次反应,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, 2000 次反应,编号
10 包装 TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG,200 次反应,编号
TaqMan? 2?Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG, 2000 次反应,编号
10 包装TaqMan? 2?Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG,编号
4)靶DNA 或 cDNA有几种 TaqMan 与 SYBR Green 试剂可用于定量实验。
a、TaqMan? 试剂
TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix (2?), No AmpErase? UNG, 250 次反应
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, 200 次反应,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, 2000 次反应,编号
10 包装 TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix ,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, No,AmpErase? UNG, 200 次反应,编号
TaqMan? 2? Universal PCR Master Mix, NoAmpErase? UNG, 2000 次反应,编号
10 包装TaqMan? 2?Universal PCR Master Mix,No AmpErase? UNG, 编号
TaqMan? PCR Core Reagents Kit, 200 次反应,编号N8080228
b、SYBR? Green 试剂
Power SYBR? Green PCR Master Mix (1 mL),40 次反应,编号
Power SYBR? Green PCR Master Mix (5mL),200 次反应,编号
Power SYBR? Green PCR Master Mix(10 × 5mL), 2000 次反应,编号
Power SYBR? Green PCR Master Mix (50 mL),2000 次反应,编号
SYBR? Green PCR Master Mix (1mL), 40 次反应,编号
SYBR? Green PCR Master Mix (5mL), 200 次反应,编号
SYBR? Green PCR Master Mix (50mL), 2000 次反应,编号
SYBR? Green PCR Core Reagents, 200 次反应,编号
9、完成设计向导
要完成Design Wizard (设计向导)工作流程,查瞧反应板布局,然后选择一个退出选项。
1)在Review Plate for Experiment (查瞧实验得反应板)窗口中,查瞧反应板布局。
2)单击Save Experiment (保存实验) 。
3)在 Save Experiment (保存实验)对话框中,单击Save (保存)以接受默认文件名与位置。示例实验被保存并关闭,并且您返回到 Home (主页)屏幕。
二、准备反应工作
如何为标准曲线实验准备 PCR 反应。
1、准备样本稀释
在将样本添加到最终反应预混液之前,执行样本稀释。采用StepOneTM 软件计算得剂量稀释样本。(样本稀释计算)
根据储液中得样品浓度？ng/μL,Stepone软件计算出稀释剂量。因为在StepOne 软件中,样本量仅限于反应总量得 10%,因此需要进行样本稀释。反应总量为每次反应25 μL,因此样本量为每次反应2、5 μL。根据“样本稀释计算”表稀释样本。
1)所需材料
用于稀释样本得稀释液(TE缓冲液或水)、样本储液
微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机
2)为每份拟稀释样本标记一个单独得微量离心管:Population 1、 Population 2等
3)将所需剂量得稀释液添加到每个空反应管内。(14、2μL)
4)将所需剂量得样本储液添加到每个反应管内。(1μL)
5)振荡每份稀释得样本 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
6)将稀释后样本置于冰上,直到准备好反应板。
2、准备标准品稀释序列
采用 StepOne 软件计算得剂量准备标准品稀释序列。(反应预混液计算)根据储液中得标准品浓度？copies/μL,Stepone软件计算出剂量。
1)所需材料
用于稀释标准品得稀释液(TE缓冲液或水)、标准品储液
微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机
2)为每份标准品标记一个单独得微量离心管:Std、1、Std、2、Std、3、Std、 4、Std、 5。
3)将所需剂量得稀释液添加到每个空反应管内:Std、1(14、5μL)、Std、2(9、1μL)、Std、3(9、1μL)、Std、 4(9、1μL)、Std、 5(9、1μL)。
4)在Std、 1 反应管中准备稀释液 1:
a、振荡储液 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
b、使用新得移液枪枪头,将 3、6 μL 储液添加到Std、 1 反应管中。
c、振荡 St
d、 1 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
5) 在Std、 2 反应管中准备稀释液 2:
a、使用新得移液枪枪头,将 9、1 μL 稀释液 1 添加到Std、 2 反应管中。
b、振荡 Std、 2 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
6)在Std、 3 反应管中准备稀释液 3:
a、使用新得移液枪枪头,将 9、1 μL 稀释液 2 添加到Std、 3 反应管中。
b、振荡 Std、 3 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
7)在Std、 4 反应管中准备稀释液 4:
a、使用新得移液枪枪头,将 9、1 μL 稀释液 3 添加到Std、 4 反应管中。
b、振荡 Std、 4 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
8)在Std、 5 反应管中准备稀释液 5:
a、使用新得移液枪枪头,将 9、1 μL 稀释液 4 添加到Std、 5 反应管中。
b、振荡 Std、 5 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。
9)将标准品置于冰上,直到准备好反应板。
3、准备反应预混液
使用 StepOne 软件计算得组分与剂量准备反应预混液。(反应预混液计算) 若实验包括一个以上得靶检测,则为每个靶检测单独准备反应预混液
1)所需材料
各反应预混液组分
微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机
2)为反应预混液标记一个适当大小得反应管: Reaction Mix。
3)将所需剂量得每种组分添加到反应管中:母液(2、0X)12、5μL、检测母液(20、0X)1、3μL、水8、8μL,总剂量22、6μL,加上10%得超额量2、26μL,共计24、86μL,24次反应所需剂量为596、6μL
注意:将检测母液置于冰柜中避光储存,直到准备使用。过多暴露在光线下会影响荧光探针。
计算中包括额外剂量,以便为试剂转移期间发生得损失提供多余剂量。建议至少准备 10% 得超额量。
4)用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上反应管盖。
5)短暂地离心反应管以除去气泡。
6)将反应预混液置于冰上,直到准备好反应板。
注意:使用之前,请执行以下操作:
–摇晃瓶子,彻底混合母液。
–振荡反应管以重新悬浮检测母液,然后短暂地离心反应管。
–将任何冷冻样本置于冰上将其解冻。解冻时,进行振荡以重新悬浮样本, 然后短暂地离心反应管。
4、准备反应板
为每个重复组准备反应物,然后将它们转移到反应板。采用StepOne 软件中显示得反应板布局。
1)所需材料
反应预混液Reaction Mix、标准品、样本、水
MicroAmpTM Fast Optical 48Well Reaction Plate
MicroAmpTM Optical 48Well Adhesive Film
微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机
2)准备靶阴性对照反应预混液:
a、向一个适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与水。
b、用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上反应管盖。
c、短暂地离心反应管以除去气泡。
d、向反应板得相应反应孔中分别加入 25 μL 得阴性对照反应预混液。
3)对于每个重复组,准备标准品反应预混液:
向适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与标准品。
a、
b、用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上各反应管盖。
c、短暂地离心各反应管以除去气泡。
d、向反应板得相应反应孔中加入 25 μL 得标准品反应预混液。
4)对于每个重复组,准备未知样本得反应预混液:
a、向适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与样本。
b、用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上各反应管盖。
c、短暂地离心各反应管以除去气泡。
d、向反应板得相应反应孔中加入 25 μL 得未知 (样本)反应预混液。
5) 用孔板高透光度盖膜密封反应板。
6) 短暂地离心反应板以除去气泡。
7) 在您准备好运行实验之前,将反应板置于阴暗处得冰上。
注意:当您准备自己得标准曲线实验时:
? 确保您使用适当得耗材。
? 确保 PCR 反应得安排与 StepOne 软件中显示得反应板布局一致。您可以: –接受软件自动生成得反应板布局。
或
–使用 Advanced Setup (高级设置)工作流程更改软件中得反应板布局。
三、运行试验
1、准备运行
打开实验并将密封得 MicroAmpTM Fast Optical 48Well Reaction Plate 装载到StepOneTM 扩增仪以准备运行。
1) 打开设计得实验
a、打开StepOne
b、从Home屏幕上,单击Open
c、在Open对话框中,导航到experiments文件夹(默认)
d、找到创建得试验设计,打开。
2)装载反应板(带无粉手套)
a、打开扩增仪抽屉
b、将反应载体放置在样本加热块中。反应板得方向取决于您所用耗材得类型:
? 若使用一个反应板,让 A1 反应孔位于样本加热块得左后角。
? 若使用反应管条带,则将条带置于样本加热块中。
c、小心地关闭扩增仪抽屉。
2、启动运行
若计算机已通过 StepOne 系统线缆直接连接到StepOne 扩增仪,则执行下列步骤。(并置启动)
1)在 StepOne 软件中,单击Temperature Plot (温度曲线) 。
2)单击START RUN (启动运行) 。
3、监视运行
1)并置监视
运行期间,定期查瞧StepOne 软件提供得所有三条曲线就是否存在潜在问题。
a、停止运行
在 StepOne 软件中,单击STOP RUN (停止运行)。对话框中包括:
–Stop Immediately (立即停止)以立即停止运行。
–Stop after Current Cycle/Hold (当前循环 / 保持阶段后停止)以在当前循环或保持阶段之后停止运行。
–Cancel (取消)以继续运行。
b、实时查瞧扩增数据
Amplification Plot (扩增曲线)屏幕允许在StepOne 扩增仪运行期间采集荧光数据时查瞧样本扩增。若设置了某种方法以采集实时数据, Amplification Plot(扩增曲线)屏幕上会显示在View Plate Layout (查瞧反应板布局)选项卡中所选反应孔得数据。扩增曲线将对照归一化染料荧光(?Rn) 循环数。
Amplification Plot (扩增曲线)屏幕对识别与检查异常扩增十分有用。异常扩增可能包括以下情况:
? 阴性对照反应孔中荧光增强。
? 预期循环中不存在可检测荧光(在相同情况下使用相同试剂从先前类似得实验运行确定) 。
c、实时查瞧运行得温度数据。
运行期间, Temperature Plot (温度曲线)屏幕上实时显示样本加热块、受热护盖门与样本 (已计算)得温度。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA得提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 2、实验试剂与仪器 1)实验材料:大肠杆菌 2)实验试剂: LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇 3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅
3、溶液配制 1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5 g/L,NaCl 10g/L,去离子水。 (搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、) 2)TE缓冲液: 1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解) 1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用) TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml 0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液 定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存) 3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用) 4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到 65℃使之溶解,然后室温保存) 4、实验方法步骤 1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。 2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液 3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠 4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。 5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。 6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min
大肠杆菌的基因型
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大肠杆菌染色体基因组的结构和功能
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中8％的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和维生素合成代谢的一些酶类的基因，以及大多数碳、氮化合物分解代谢的酶类的基因。另外，核糖体大小亚基中50多种蛋白质的基因也已经鉴定了。 除了有些具有相关功能的基因在一个操纵子内由一个启动子转录外，大多数基因的相对位置可以说是随机分布的。如控制小分子合成和分解代谢的基因，大分子合成和组装的基因分布在大肠杆菌基因组的许多部位，而不是集中在一起。再如，有关糖酵解的酶类的基因分布在染色体基因组的各个部位。进一步发现，大肠杆菌和与其分类关系上相近的其他肠道菌如志贺氏杆菌属（Shigella）、沙门氏菌属（Salmonella）等具有相似的基因组结构。伤寒沙门氏杆菌（Salmonellatyphimurium）几乎与大肠杆菌的基因组结构相同，虽然有10％的基因组序列和大肠杆菌相比发生颠倒，但是其基因的功能仍正常。这更进一步说明染色体上的基因似乎没有固定的格局，相对位置的改变不会影响其功能。 在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录，23个操纵子按反时针方向转录，即DNA两条链作为模板指导mRNA合成的机率差不多相等。在大肠杆菌染色体基因组中，差不多所有的基因都是单拷贝基因，因为多拷贝基因在同一条染色体上很不稳定，极易通过同源重组的方式丢失重复的基因序列。另外，由于大肠杆菌细胞分裂极快，可以在20分钟内完成一次分裂，因此，携带多拷贝基因的大肠杆菌并不比单拷贝基因的大肠杆菌更为有利；相反，由于多拷贝基因的存在，使E.coli的整个基因组增大，复制时间延长，因而更为不利，除非在某种环境下，需要有多拷贝基因用来编码大量的基因产物，例如，在有极少量乳糖或乳糖衍生物的培养基上，乳糖操纵子的多拷贝化可以使大肠杆菌充分利用的乳糖分子。但是，一旦这种选择压力消失，如将大肠杆菌移到有丰富的乳糖培养基上，多拷贝的乳糖操纵子便没有存在的必要，相反，由于需要较长的复制时间，这种重复的多拷贝基因会重新丢失。 大肠杆菌染色体基因组中，大多数rRNA基因集中于基因组的复制起点oriC的位置附近。这种位置有利于rRNA基因在早期复制后马上作为模板进行rRNA的合成以便进行核糖体组装和蛋白质的合成。从这一点上看，大肠杆菌基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系。
基因组DNA提取步骤
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
细菌基因组的结构和功能
细菌和病毒一样同属原核生物，因而细菌基因组的结构特点在许多方面与病毒的基因组特点相似，而在另一些方面又有其独特的结构和功能。本节首先介绍细菌染色体基因组的一般结构特点，然后再具体介绍大肠杆菌染色体基因组的结构和功能。 ?细菌染色体基因组结构的一般特点 ?大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 细菌染色体基因组结构的一般特点 （1）细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染 色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。 类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双 链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。 在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。 （2）具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因表达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因 （regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。 （3）在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。 （4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。 （5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。 （6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会 出现基因重叠现象。 （7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区 TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺 序。 （8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA 聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT 结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT 结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。 大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法： 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
大肠杆菌的基因组大小是多少bp
问答题： 1、大肠杆菌的基因组大小是多少bp？原核生物复制叉的速度是多少？正常情况下大肠杆 菌是多长时间繁殖一代？为什么在营养丰富的情况下20min繁殖一代？ 4.6X106 bp；1kb/s; 40min; 上一次复制没有完成下一代就开始了 2、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差 异 ①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式 ②真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。 ③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子 ④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。 ⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5’上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。 在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合 ⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 ⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。 简答题 1、DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能 2、表观遗传学的特点 1.可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传； 2.可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变； 3.没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。 3、中心法则（图示） 4、遗传印迹的特点： 基因组印迹依靠单亲传递某种性状的遗传信息，被印迹的基因会随着其来自父源或母源而表现不同，即源自双亲的两个等位基因中一个不表达或表达很弱。 不遵循孟德尔定律，是一种典型的非孟德尔遗传，正反交结果不同。 5、原核生物和真核生物mRNA的结构差别： 在原核生物中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所分开，这种mRNA称这为多顺反子mRNA； 在真核生物中，mRNA则为一条RNA多聚链 6、反义RNA作为调节物质的作用机制： ①与mRNA上核糖体结合位点结合，使得翻译不能起始； ②与mRNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物；
大肠杆菌基因型说明
大肠杆菌基因型及遗传符号说明 前言：实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp，基因间的平均间隔为118bp（基因Ⅷ）。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。 利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。 分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。 大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec, et, al. 1966）： 一、一般规则： 1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3个小写斜体字母来表示。例如：DNA Adenine Methylase→dam。 2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。例如：Recombination→recA、recB、recC。 3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE44（sup基因座E的44位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。 4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。 5、对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以F因子为例，F-：F因子缺失；F+：自主性F因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F’：携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性F因子；Hfr：整合到染色体上的F因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）”或“/”等以区别。例如：/F' [traD3 6、proAB、lac I q、lacZ M15] 6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“ ”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为( lac-proAB)。 7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin抗性→Str
大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌基因组DNA的提取方式 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋 白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降 解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解 细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 2、实验试剂与仪器 1）实验材料：大肠杆菌
2）实验试剂： LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇 3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅 3、溶液配制 1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用 20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.) 2）TE缓冲液： 1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解） 1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用） TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris- HClBufferPH=8.05ml 0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定 容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存） 3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）
实验1 试剂盒方法提取基因组DNA组和质粒DNA
实验一试剂盒方法提取基因组DNA和质粒DNA 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用试剂盒方法提取nchpzh008植物DNA组，本组可以在电泳图谱中清晰看到DNA条带，而在用不同引物组合来对DNA进行PCR，在聚丙烯凝胶电泳图谱中可以看到，引物组合me4em3、me5em2、me5em3对植物DNA使比较好的，这些引物组合可以用在不同物种的遗传特性分析。利用柱式试剂盒提取PUC18和500bp质粒DNA，其中1-3组提取PUC18，4-6组提取500bp质粒DNA。结果是提取PUC18质粒DNA的同学没能将质粒提取出来，而提取500bp的全部都可以提出来。说明了PUC18质粒没有成功转化大肠杆菌，而500bp则转进了大肠杆菌。 关键词：试剂盒；DNA基因组；PCR技术；质粒DNA 植物细胞通常有三套基因组，即染色体基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组，其对应的DNA分别称为基因组DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。植物细胞的总DNA中95%以上是基因组DNA，而且在常规提取条件下，mtDNA和ctDNA因裸露存在，没有蛋白质的保护，会由于提取缓冲液中酸、碱的水解而丢失。 质粒是存在于细菌细胞中的染色体外小分子DNA，一般呈双链闭合环状，能自我复制和垂直遗传，并赋予宿主细胞一些新表性，但质粒的存在对细胞本身的存在并不是必需的。质粒本身或经过一定改造后的质粒常被用作基因载体，将外源基因带入受体细胞中复制和扩增，甚至表达。质粒有严谨型和松弛型之分，基因工程研究中所用的质粒主要是松弛型质粒，或是经过遗传修饰的人工质粒。 DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低，质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。用试剂盒方法提取DNA组是一种比较方便和高效的方法。 1 材料与方法 1.1 试供材料 nchpfszh004、nchpfzh01101、nchpfzh01102、农场和平1号、nchpzh021、nchpzh008、大肠杆菌 1.2 试剂配制 氯仿、异丙醇、Tris、Hcl、EDTA、75%乙醇、灭菌水、TBE缓冲液、硼酸、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、琼脂糖等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 1.4 试剂盒方法提取DNA组步骤 1)65℃预热柱式植物DNAout溶液A，使其沉淀融化，充分混匀，取0.75ml加入到5ml
大肠杆菌基因组DNA提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组的提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组。 1、实验原理 提取的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（）和蛋白酶 K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的溶 液经乙醇沉淀使从溶液中析出。 的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键 受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱 蛋白酶，其重要特性是能在和（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的 活性。在匀浆后提取的反应体系中，可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使 组织蛋白和分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使分子完整地 分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀。为获得高纯度，操作过程中常加入除去。（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶 解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 ）是可溶的，当降低 溶液盐浓度到一定的程度（0.3 ）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将核酸的 复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀，而溶于乙醇或异 丙醇而除去。 2、实验试剂与仪器 1）实验材料：大肠杆菌 2）实验试剂： 液体培养基，溶液，10，蛋白酶K，5 ，溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70% 乙醇 3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅 3、溶液配制 1）液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 ，细菌培养用酵母提取物5 ，10，去离子水。
(搅拌溶解后，用5调至7.0.用去离子水定容100，用20/50摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 高压下蒸汽灭菌20.) 2）缓冲液： 1M 溶液（取242.2g，加2O至1600，加热溶解） 1M 8.0 溶液（取 1M 溶液160用分析纯盐酸调至8.0（需浓盐酸约8.5），加2O定容至200，高压灭菌备用） 缓冲液（10 1 8.0，1M 8.0 5 0.5M =8.0 1向烧杯中加入约400 H2O均匀混合;将溶液定容到500后，高 温高压灭菌，室温保存） 3）蛋白酶K：（20蛋白酶K溶于1无菌双蒸水，-20℃备用） 4）溶液：（5% ，5溶于100 0.5M 溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温 保存） 4、实验方法步骤 1、将大肠杆菌接种到灭菌好的培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。 2、取菌液1.5置于离心管中，以5000冷冻离心1，弃上清液 3、加190 悬浮沉淀，并加10 10,摇匀直至溶液变粘稠 4、加入1蛋白酶K（20），混匀，37℃保温1小时。 5、加30 5 ,混匀。 6、加30 溶液，混匀，65℃保温20 7、加入300酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000离心10 8、取上清液，加入300氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000离心10
大肠杆菌基因型
大肠杆菌基因型的表示方法 （Demerec, et, al. 1966） 分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec 等1966 年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。 一、一般规则： 1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3 个小写斜体字母来表示。 例如：DNA Adenine Methylase→dam。 2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在 3 个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。例如：Recombination→rec A、rec B、recC。 3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE44（sup 基因座E 的44 位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。 4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示 符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。 5、对于携带附加体的菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以F 因子为例，F-：F 因子缺失；F+：自主性F 因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F’：携带有遗传可识别细菌染色体片段的自主性F 因子；Hfr：整合到染色体上的F 因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）”或“/”等以区别。例如：/F' [traD3 6、proAB、lac I q、l acZ M15] 6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“”表示。例如：lac-proAB 基因缺失时它的基因型表示为( lac-proAB)。 7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Strepto mycin 抗性→Str__+或Str r，Ampicillin 敏感性→Amp-。(第一个字母要大写,“+”或“r”表示有抗性,“-”表示无抗性或敏感)。 8、根据某些特异性蛋白的变异及其导致的结果变化进行表示。 例如：TH2 菌株上有一种基因型表示如下：hsdS20 (rB-、mB-)，其中S20 代表特异性识别蛋白发生变异，()中的rB-、mB-表示由于S20 的变异而导致B 株来源的hs dR 和hsdM 的功能缺失。 9、蛋白质的名称与对应的基因或等位基因相同，但不用斜体，且首字母大写，如，U vrA、UvrB。 二、基因符号和意义（见表1） 部分基因符号和意义 基因符号意义注释 Δ缺失缺失突变用“Δ”表示，其后的（）中是缺失基因的名称、等位基因
各种Taq酶中大肠杆菌基因组DNA残留
各种Taq酶中大肠杆菌基因组DNA残留对实验的影响 “酶：大多是蛋白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子也具有催化功能。此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶类似的催化活性，包括人工合成的DNA。有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂……”边看书边打瞌睡的小新实在熬不住了，把书扔了，还是去实验室点小实验比较有意思。【千万不要学小新不爱读书，隔三差五要被领导教育QAQ】 实验室里围了一圈同事，原来是前几天新订的Taq酶到货了，可是拿到东西的大师兄在做实验的过程中犯了难。忍不住好奇的小新也把脑袋伸了过去。 原来是因为近期的技术服务需要做一个细菌16s的扩增，但是不同浓度的试验样本做出来的结果居然都是一样的，小新死皮赖脸的把这份不正常的结果拿来了，情况确实很糟糕：大师兄的试验采用梯度稀释的样本，分别由1稀释到10-6，但是从试验结果来看，各个样本的CT值均围绕在15-17之间，也就是说，从荧光结果上完全看不出任何样本差异啊！ 引物序列：（F）TGTGTAGCGGTGAAATGCG （R）TCGTTTACGGCGTGGAC 该对引物序列扩增产物片段长度为138bp
为了搞清楚为什么，小新开始重复大师兄的试验，出来的结果依旧如此，排除实验员操作的问题，那就是体系的原因了。正准备逐一排查到底是哪个实验成分有问题时，小新发现了对照组阴性【就是没有加入DNA模板的那组】居然和其他组的结果一样，那就说明是体系里混进去了其他的DNA模板，并且是细菌的DNA模板。由于换了新的Taq酶才开始出现这种结果，那么头号怀疑对象当然就是新的Taq酶咯。 问了一下师兄，现在的Taq酶是哪家公司的，师兄说是JL的，恰好小新手上还有一些其他公司的Taq酶，那就正好来个大检查，看看到底是哪家公司的Taq酶混进去的DNA最多，还是大家生产的酶都混进去了很多DNA。 试验过程倒是很简单，通过简单的阴性试验就能出来结果。 小新选取了四种不同公司的酶：1、莱枫，2、JL，3、康为，4、TaKaRa，采用引物序列依旧是16s的通用引物。在此基础上进行了全阴性试验。一个多小时的等待，实验结果终于出来了。 图中的荧光线从前往后所用的酶依次是：JL、康为、TaKaRa、莱枫 观察实验结果，根据CT值的分析，JL的CT值最小，也就是说其含细菌DNA浓度最高，其次是康为和TaKaRa，细菌DNA含量最低的是莱枫。也就是说无论是哪家公司的Taq酶都无法做出真正意义上的阴性结果。那么这样的Taq酶对长片段的16sPCR扩增是否也存在影响呢？好奇的小新进行了长片段16s PCR全阴性扩增，再对扩增产物进行电泳，出来的结果如图： 注：普通的16s 采用的引物序列为：F
实验一--大肠杆菌基因组提取
在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用到的试验方法）做一定的解释。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这些过程并不是每一位同学都参与了的，故在本实验报告的开篇写出。 （一）制备1%的琼脂糖凝胶 称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 mL的1 × TAE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，取出摇匀。 （二）胶板的制备 1. 用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。 2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子。 3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶的厚度在3-5mm之间。 4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。 5. 向电泳槽中加入1 × TAE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。 （三）加样 1. 在样品中加入适量的10 ×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。 2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔） （四）电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的2/3处时，停止电泳。
（五）染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）。 （六）观察实验结果 在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。 实验一大肠杆菌基因组提取 【实验目的】 1.学习并掌握细菌基因组的提取方法 【实验原理】 DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种
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