结核分枝杆菌及耐药基因的特征
系统细菌学
课程论文
题目：结核分枝杆菌及其耐药基因的特征专业：生物工程
姓名：魏文凭
学号： 2016304120036
中国·武汉
二0一六年十二月
结核分枝杆菌及其耐药基因的特征
摘要：分枝杆菌属主要包括结核分枝杆菌复合群（包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌。造成人畜共患病的结核分枝杆菌和引起麻风病的麻风分枝杆菌是威胁人类健康的两类病原菌，而非结核分枝杆菌病疫情也逐年增加。因此关注分枝杆菌具有重要的科学意义及应用价值，对农业、卫生和环境都用深远影响。本文主要介绍分枝杆菌的特征和一些耐药基因的研究。
关键词：耐药机制结核病生物学特征
1、结核病的认识及治疗发展
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）是全球第二大致死性传染病—结核病的病原体。结核分枝杆菌最大的特点就是持留性（persistence）[1]，有时感染可达几十年，因此全球约有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，其中每年死于结核病的人数高达180万（World Health Organization. 2016）。中国是结核病高发的国家，已被世界卫生组织列为全球22个结核病高负担和特别警示的高耐药国家之一。
结核病很早就存在，在考古学界，从新石器时代人遗骨中发现有骨结核，古埃及木乃伊中也发现有结核病，说明结核病的历史可追溯到公元前2400-3400年。在中国历史上，结核病也是广泛流行的，当时称为痨病，是一种慢性呼吸道疾病，在认识到它的致病菌之前，人们没有治疗的手段，只能通过环境的影响，在空气清新、气候湿润的地域抑制结核病的发作。在1882年，德国微生物学家罗伯特·科赫（Robert Koch）通过特殊的染色技术，发现了细棒状的结核杆菌，又通过血清培养基获得了结核杆菌，证实了结核杆菌是结核病的病原菌。自此对结核病有了清晰的认识，对于结核病的检测技术也不断发展。法国科学家卡尔梅特（Calmette）和格林（Guerin）在1908年和1919年间，经过230次的传代，获得了一株牛分枝杆菌减毒株，卡介苗[2]。自1921年首次使用以来，成为有效治疗儿童结核病的疫苗，但对于成人型结核病的的治疗很有限。到了上世纪中期以来，临床上又应用了一些抗结核的药物，如异烟肼（INH）、利福平（RIF）、链
霉素（SM）、吡嗪酰胺（PZA）等，使得结核病的防治得到了有效控制。但到了90年代，耐多药菌和广泛耐药菌的发现，以及世人对结核病防治的放松导致该病大有席卷重来之势。因此对结核分枝杆菌疗效确切、治疗周期短、安全性高的疫苗的研发迫在眉睫。
2、结核分枝杆菌的特点
2.1 细胞结构特点
结核分枝杆菌是一种胞内菌，属于放线菌，传统革兰氏染色效果不明显，因为其细胞壁含有分枝菌酸，抗酸性染色为阳性。分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小为1-4×0.4μm，无鞭毛，无芽孢，不能产生内外毒素，需要特殊的培养基进行培养，生长极度缓慢，菌体成分为糖类、脂质、蛋白质等。科学工作者研究一般选择耻垢分枝杆菌，它是分枝杆菌的模式生物，具有快速生长无致病性的优点[3]。
分枝杆菌具有大量的脂质，占菌体重量的20%—40%，胞壁中含量最多。几乎没有其他生物能像结核杆菌这样产生如此多的脂溶性分子，多项研究表明细菌的毒力与其所含的脂质分子有关，尤其是糖类[3]。脂质可防止菌体水分丢失，
因此结核杆菌对干燥的抵抗力特别强。对酸（3% HCl或6% H
2SO
4
）或碱（4% NaOH）
有抵抗力，15min内不受影响。对多种抗生素敏感，但长期使用易引起耐药性，而且耐药基因能够遗传。
结核分枝杆菌能侵染机体的任何组织、器官，其生长极度好氧，肺部感染是最主要的致病方式，目前研究发现其毒力因子很多，包括索状因子、脂阿拉伯甘露聚糖、分泌蛋白、代谢相关因子、转录因子、双组份调节系统、分泌系统和应激蛋白等[4]。从分子生物学角度来看，对毒力基因的了解知之甚少。研究较多的是：编码毒素-抗毒素系统的基因，控制细胞的程序性死亡以应对环境压力[5]。编码sigma因子的基因，通过与whiB3相互作用而活化相关基因的表达[6]。编码过氧化氢酶的基因应对低氧胁迫及对抗宿主巨噬细胞的活性氧[7]。Lam，KatG 对细菌在巨噬细胞中的生存起作用[8]。
2.2 基因组和比较基因组特点
M. tuberculosis H37Rv全基因序列图于1998年由英国和法国科学家联合完成，2001年临床分离株CDC1551的全基因组测序完成，标志着分枝杆菌的研
究进入到后基因组时代。对基因组的注释及分析成为当务之急，近些年来，全球组学的研究取得了巨大进展，为分枝杆菌的诊断、进化、靶标提供了良好的基础。
H37Rv全基因组由4411529bp组成，包括4000多个基因，已发现4005个ORFs[9]。其基因组有几个重要的特征，G+C 含量相对稳定，高达65.6%；起始密码子中有35%是GTG，远远高于枯草杆菌的9%和大肠杆菌的14%，这造成结核菌高G+C偏向；有明确功能的基因大概有2441个，不含插入序列的假基因有6个，仍有600多个基因不知其功能[10]。值得注意的是其有相当多的基因编码参与到脂肪代谢的酶类中，有10%的基因编码PE和PPE蛋白家族，这是分枝杆菌特有的重复序列基因，而其功能仍未知，不过根据已有的研究表明，它们在免疫学方面有重要作用[9]。
近年来，有人通过芯片技术来比较不同分枝杆菌菌株的基因组差异。在无毒性的耻垢分枝杆菌中，mutY和mutM在维持耻垢非致病性起作用，另外耻垢通过半胱氨酸天冬酰胺酶依赖途径来诱导宿主细胞凋亡，相比结核杆菌，非致病菌能诱导机体产生更强的天然免疫应答[11]。在结核分枝杆菌特有的129个开放阅读框中（ORF），指出有39个ORF在卡介苗BCG中缺失（主要存在3个RD区域），29个在部分BCG菌株中缺失[3]。这些H37Rv特有的ORF在无毒株中缺失，表明这些基因可能是代表了毒性因子编码基因，也可能是结核分枝杆菌保护性抗原编码基因[12]。
3、结核分枝杆菌的致病机理
结核分枝杆菌在长期的宿主-细菌相互作用过程中，形成了自身独特的生活习性，使其能够适应宿主的免疫系统[13]。在感染宿主后机体会调动自身免疫防御系统来抵御外来入侵者，巨噬细胞在其中起重要作用。巨噬细胞是人体抵御外界压力的第一道天然免疫屏障，在巨噬细胞感染后会利用吞噬溶酶体来降解细菌，并和树突状细胞一起引起宿主的一系列信号传导导致感染的细胞死亡[14]。结核分枝杆菌通过调控相关蛋白的表达使其能够在宿主中存活几十年，和宿主达到一种平衡[15]。
在成熟的吞噬溶酶体内，会由细胞氧化酶和诱导性氮氧化物合酶生成大量的活性氧，从而杀死病原菌。而分枝杆菌则通过分泌GroEL2蛋白与巨噬细胞发生相互作用，影响巨噬细胞的识别与吸附[16]。通过也会阻止吞噬溶酶体的形成和
酸化，抑制自噬的形成，从而维持分枝杆菌的蛋白活性[17]。分枝杆菌在低氧的环境中会进行休眠，并合成大量的交叉连结肽聚糖维持自身的生存，PhoP等双组份调控系统对于应对低氧胁迫有重要作用[18]。DosR蛋白与分枝杆菌的潜伏感染息息相关，DosR能调控约50个快速响应的基因，起到应对低氧环境紧急措施的目的；在低氧处理一段时间后，受到调节的基因达到几百个。显然这些持久性低氧胁迫基因与结核分枝杆菌的潜伏持留感染有关[19]。
4、结核分枝杆菌中的耐药基因
结核分枝杆菌在抗结核药物研发出来时，有很好的治疗效果，但由于结核杆菌耐药机制的形成，造成药物的长期使用疗效急速下降。而目前结核杆菌的耐药机制仍未完全了解清楚。近几十年的研究表明药物作用的靶标的改变是大部分结核杆菌产生耐药的主要原因，但也包括细菌的药物外排泵机制、细胞膜通透性的改变等[20, 21]。
结核杆菌耐INH的原因很多，涉及到katG、NADH脱氢酶基因ndh、烯酰基载体蛋白还原酶基因 ihhA、酮酰基酰基转移蛋白酶基因 kasA 以及烷基过氧化氢酶基因 ahpC等。其中主要的是katG的突变，katG编码过氧化氢-过氧化物酶，该酶能将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，从而抑制细胞壁枝菌酸的合成[22, 23]。
利福平的作用是通过与结核杆菌RNA聚合酶的β亚单位结合，干扰转录的开始和RNA的延伸。若β亚单位突变，则阻止利福平的结合，造成耐药；而细胞壁结构的改变则会导致药物的摄入减少，这种情况在鸟分枝杆菌复合群中有发现；因此两种可能都不能排除[24]。
链霉素是第一种有效的抗结合药物，目前在没有新药出现的情况下仍是结核病治疗的一线药物。它是一种氨基环醇糖苷类抗生素，通过干扰蛋白质的合成而发挥作用。编码核糖体蛋白S12基因和16S rRNA基因的突变是目前认为耐SM 的的原因，但具体机制不完全清楚[21]。
吡嗪酰胺是一种烟酰胺类似物，PZA渗透入吞噬细胞后并进入结核杆菌菌体内，菌体内的酰胺酶使其脱去酰胺基，转化为吡嗪酸而发挥抗菌作用。pncA基因突变导致吡嗪酰胺酶活性下降或丧失，严重影响酶的功能。在耐PZA的一部分分离株中，发现pncA基因并未突变，说明还有其他的耐药机制[25]。
5、小结
耐多药菌和广泛耐药菌的出现以及未有新的抗结核药上市的情况下，人类正面临着结核分枝杆菌的严重威胁，对抗结核药物的新靶点的发现、全新抗结核药物机制的筛选，以及结核治疗靶向给药系统等的研究将为人类有效控制结核病奠定了基础。
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江苏省260株结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究
江苏省２６０株结核分枝杆菌Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ 基因分型研究 刘巧许卫国万康林王建明杨丹丹吕冰邵燕汪华 ［摘要］ 目的 研究江苏省结核分枝杆菌ＤＮＡ指纹图谱的分布特征，分析北京家族株与结 核分枝杆菌耐药的关联性。方法 江苏省３０个耐药监测点收集２６０株结核分枝杆菌分离株，应用 比例法检测分离株对于一线抗结核药物（异烟肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇）的耐药性，应用间隔 区寡核苷酸分型（ Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ）方法进行基因分型，使用ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ ５．０软件进行聚类分析，并 与ＳｐｏｌＤＢ４数据库比对。结果 ２６０株结核分枝杆菌分离株可分为３４个基因型（２７个独特基因型 和７个共享基因型），菌株经聚类分析分为两个家族：北京家族（８０．４％，２０９／２６０）和非北京家族 （１９．６％，５１／２６０）。ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析显示，北京家族株能增加结核分枝杆菌耐多药的发生风险 （ＯＲ＝ １１．０７，９５％ＣＩ：１．４５～８４．５０）。非北京家族包括Ｔ１、Ｔ２、Ｈ３、Ｈ４、ＣＡＳ、ＬＡＭ、Ｕ和ＭＡＮＵ２，其 中ＣＡＳ、ＬＡＭ和ＭＡＮＵ２家族在中国比较罕见，在江苏省是首次报道。结论 江苏省结核分枝杆 菌流行株具有明显的基因多态性，其主要流行型为北京家族，且该家族可能与结核分枝杆菌耐多 药之间存在关联。 结核分枝杆菌；基因分型；北京家族 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ２６０ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ ＬＩＵ Ｑｉａｏ１ＸＵ Ｗｅｉ－ｇｕｏ２ＷＡＮ Ｋａｎｇ－ｌｉｎ３ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｍｉｎｇ１ＹＡＮＧ Ｄａｎ－ ｄａｎＬＶ Ｂｉｎｇ３ＳＨＡＯ Ｙａｎ２， ＷＡＮＧ Ｈｕａ１１ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２９， Ｃｈｉｎａ； ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ； ３ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｋｅｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｍｅｇａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｎｏ． ２００８ＺＸ１０００３－０１０） ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａ （Ｎｏ． ２００９ＺＸ １０００４－９０４ ）． ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＇Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ＇ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｗｏ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｓｉｘｔｙ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ３０ ｄｒｕｇ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｄｒｕｇｓ （ｉｓｏｎｉａｚｉｄ， ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ， ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ ａｎｄ ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ， ２６０ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ３４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２７ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ７ ｓｈａｒｅｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ． Ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ （８０．４％， ２０９／２６０） ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｏｎ－Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ （ １９．６％， ５１／２６０）． Ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＯＲ （９５％ ＣＩ） ｏｆ １１．０７ （１．４５－８４．５０）． Ｎｏｎ－Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｔ１， Ｔ２， Ｈ３， Ｈ４， ＣＡＳ， ＬＡＭ， Ｕ ａｎｄ ＭＡＮＵ２ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｆｏｕｎｄ． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ， ｔｈｅ ＣＡＳ， ＬＡＭ ａｎｄ ＭＡＮＵ２ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｅｒｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｔ ｗａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｄ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｄｉｄ ｅｘｉｓｔ ｉｎ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ； Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ； Ｂｅｉｊｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ １０．３７６０／ｃｍａ．ｊ ．ｉｓｓｎ．０２５４－６４５０．２０１１．１２．０１６ 国家科技重大传染病专项（ ２００８ＺＸ １０００３－０１０）；国家科技重大专项（２００９ＺＸ１０００４－９０４） 作者单位：２１００２９ 南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系（刘巧、王建明、汪华）；江苏省疾病预防控制中心慢性非传染病防治所（许卫国、杨丹丹、邵燕）；中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室（万康林、吕冰）
结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析
结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析 目的探讨结核分枝杆菌耐药情况及基因检测分析。方法从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，对所有患者结核分枝杆菌进行耐药分析及rpsL、rpoB、embB、KatG基因检测。结果62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，差异无统计学意义（P>0.05）。结论结核分枝杆菌耐药的产生同菌株基因具有较大关联，且耐药率同治疗次数有关，在结核病临床治疗中，需根据患者耐药情况，选择联合用药方案，提高治疗效果。 [Abstract] Objective To investigate the analysis in drug resistance of bacteriology tuberculosis and genetic testing. Methods 62 cases of TB patients from March 2012 to March 2014 in our hospital were selected as the objects，and allocated into an observation group and a control group according to the randomly grouping method，first diagnosis and treatment in 39 patients in the observation group，first diagnosis and treatment failure underwent secondary treatment of 23 patients in the control group，all patients were resistant Bacteriology tuberculosis was analyzed and rpsL，rpoB，embB，KatG genetic were tested. Results 62 cases of patients with 19 cases of drug resistance，the drug resistance rate was 1，the control group of patients with 26.09% was compared with the control group（10.26%），（P＜0.05），2 drug resistance rate was 17.39% and 7.69%，the differences were significant （P＜0.05），3 drug resistance rate was 8.70%，compared with the observation group，the difference was statistically significant （P＜0.05）；rpoB，embB，rpsL，KatG gene mutation rate was 86.11%，88.89%，91.67%，83.33%，x2 test showed no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The generation of drug-resistant Bacteriology tuberculosis strains with genes associated with a larger，and the number of drug-related rates with treatment in the clinical treatment of tuberculosis，to be based drug resistance in patients choose combination therapy programs，improve the therapeutic effect. [Key words] Bacteriology tuberculosis；Drug resistance；Gene；Detect 重大传染性疾病对于人们健康及社会稳定均具有较大危害，因此，对其进行快速诊断历来为人类生存发展所必须。自1882年发现结核分枝杆菌以来，结核病便成为严重影响患者健康的重要传染疾病。世界卫生组织1993年称“全球结核病处于紧急状态”，1998年称“遏制结核病行动刻不容缓，1999年数据显示[1]，全世界每年因结核病死亡人数高达300万，是其他传染病死亡人数之和；世界卫生组织（WHO）将结核病与艾滋病、疟疾列为21世纪人类需要攻克的三大传染
结核分枝杆菌及耐药基因的特征
系统细菌学 课程论文 题目：结核分枝杆菌及其耐药基因的特征专业：生物工程 姓名：魏文凭 学号： 2016304120036 中国·武汉 二0一六年十二月
结核分枝杆菌及其耐药基因的特征 摘要：分枝杆菌属主要包括结核分枝杆菌复合群（包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌。造成人畜共患病的结核分枝杆菌和引起麻风病的麻风分枝杆菌是威胁人类健康的两类病原菌，而非结核分枝杆菌病疫情也逐年增加。因此关注分枝杆菌具有重要的科学意义及应用价值，对农业、卫生和环境都用深远影响。本文主要介绍分枝杆菌的特征和一些耐药基因的研究。 关键词：耐药机制结核病生物学特征 1、结核病的认识及治疗发展 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）是全球第二大致死性传染病—结核病的病原体。结核分枝杆菌最大的特点就是持留性（persistence）[1]，有时感染可达几十年，因此全球约有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，其中每年死于结核病的人数高达180万（World Health Organization. 2016）。中国是结核病高发的国家，已被世界卫生组织列为全球22个结核病高负担和特别警示的高耐药国家之一。 结核病很早就存在，在考古学界，从新石器时代人遗骨中发现有骨结核，古埃及木乃伊中也发现有结核病，说明结核病的历史可追溯到公元前2400-3400年。在中国历史上，结核病也是广泛流行的，当时称为痨病，是一种慢性呼吸道疾病，在认识到它的致病菌之前，人们没有治疗的手段，只能通过环境的影响，在空气清新、气候湿润的地域抑制结核病的发作。在1882年，德国微生物学家罗伯特·科赫（Robert Koch）通过特殊的染色技术，发现了细棒状的结核杆菌，又通过血清培养基获得了结核杆菌，证实了结核杆菌是结核病的病原菌。自此对结核病有了清晰的认识，对于结核病的检测技术也不断发展。法国科学家卡尔梅特（Calmette）和格林（Guerin）在1908年和1919年间，经过230次的传代，获得了一株牛分枝杆菌减毒株，卡介苗[2]。自1921年首次使用以来，成为有效治疗儿童结核病的疫苗，但对于成人型结核病的的治疗很有限。到了上世纪中期以来，临床上又应用了一些抗结核的药物，如异烟肼（INH）、利福平（RIF）、链
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据 NCCLS 标准，通过测量纸片 扩散法、肉汤稀释法和 E 试验的抑菌圈直径、 MIC 值和 IC 值获得。也可通过以下方法进行 检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床 上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、 万古霉素中介的葡萄球菌、 耐万古霉素肠球菌及氨基糖 苷类高水平耐药的肠球菌等。 （ 2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点 MIC ），而不使用 测定 MIC 时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感 试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱B 兰 阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林 扩大现 象（协同），说明测试菌产生超广谱B -内酰胺酶 （ 4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如： Microscan 等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的 MIC 值。 2．B -内酰胺酶检测： 主要有碘淀粉测定法 （ iodometric test ）和头孢硝噻吩纸片法 （ nitrocefin test ）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，B -内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟 菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如B -内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、 氨苄西林、 阿莫西林耐药； 表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素 （包括氨基、 羧基和脲基青霉素） 耐 药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的 MecA 基因，大肠埃希菌与B -内酰胺类耐药有关的 blaTEM 、blaSHV 、blaOXA 基因，肠球菌与万古 霉素耐药有关的 vanA 、 vanB 、 vanC 、 vanD 基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有： PCR 扩增、PCR-RFLP 分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术 、自动 DNA 测序 4．特殊耐药菌检测 （1 ）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1u g 苯唑西林纸片的抑菌圈直径W 10伽，或其MIC > 4u g/ml 的金黄色葡萄球菌和对 1u g 苯唑西林纸片的抑菌圈直径W 17 mm,或MIC > 0.5u g/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（ MRS ）。对MRS 不论其体外药敏试验 结果，所有的B -内酰胺类药物和B -内酰胺/B -内酰胺酶抑制剂均显示临床无效；绝大多数 的 MRS 常为多重耐药,耐药范围包括氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等。 （2） 耐青霉素肺炎链球菌检测：当对 1u g 苯唑西林纸片抑菌圈直径〈20 mm 或MIC > 0.06 u g/ml 均应视为耐青霉素肺炎链球菌 （PRSP ）。临床治疗显示 PRSP 对氨卞西林、氨卞西林 /舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟,临床治疗疗效很差,但应检测对头胞曲松、头胞噻肟和美 洛培南等的 MIC 以判断是否对这些抗生素敏感。 （3） 耐万古霉素肠球菌检测： 肠球菌对30 g 万古霉素纸片抑菌圈直径W 14 mm 或MIC > 32 u g/ml 被称为耐万古霉素肠球菌（VRE ）。针对多重万古霉素药物目前尚无有效治疗方法， 但对青霉素敏感的 VRE 可用青霉素和庆大霉素联合治疗,若对青霉素耐药而不是高水平耐 氨基糖甙类可用壁霉素 +庆大霉素。 （4） 产超广谱B -内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测： 超广谱B -内酰胺酶是一种能水解青霉素、 -内酰胺酶（ESBLs ）革 /克拉维酸方向有抑菌圈 Vitek-2 、BD-Pheonix 、
结核分枝杆菌耐药分子机制的研究进展
Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2020, 10(7), 1292-1297 Published Online July 2020 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/0a14913804.html,/journal/acm https://https://www.wendangku.net/doc/0a14913804.html,/10.12677/acm.2020.107196 Research Progress on Molecular Mechanism of Drug Resistance of Mycobacterium tuberculosis Lan Yang, Qiulian Wu The Second People’s Hospital of Nanning, Nanning Guangxi Received: Jun. 14th, 2020; accepted: Jul. 7th, 2020; published: Jul. 14th, 2020 Abstract At present, the incidence and mortality of tuberculosis are increasing in many areas, but the pro-liferation and unreasonable application of anti-tuberculosis drugs have led to the emergence of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, which has hindered the diagnosis and treatment of tuberculosis. Therefore, understanding the molecular mechanism of drug resistance and common drug resistance of Mycobacterium tuberculosis is of great significance for formulating effective treatment programs, timely diagnosis and effective treatment of tuberculosis, and improving the prognosis of tuberculosis patients. This article summarizes the drug-resistant molecular mechan-ism of Mycobacterium tuberculosis and the drug-resistant molecular mechanisms of commonly used anti-tuberculosis drugs, so as to provide clinical reference. Keywords Mycobacterium tuberculosis, Molecular Mechanisms of Drug Resistance 结核分枝杆菌耐药分子机制的研究进展 杨兰，吴秋莲 南宁市第二人民医院，广西南宁 收稿日期：2020年6月14日；录用日期：2020年7月7日；发布日期：2020年7月14日 摘要 目前许多地区结核病的发病率和病死率出现上升现象，但抗结核药物的泛滥及不合理应用，所致耐药结
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？ 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。 乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。 乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义 HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。 通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。 乙肝的治疗方式有哪些？ HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。 乙肝病毒产生耐药的机理是什么？ HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种： （1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降； （2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降； （3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。 HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。 HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。 核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV 的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。
结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与分析
分类号：R 378.91+1 密级：一般 U D C ：616-093 编号：2010212554 广州医学院 硕士学位论文 结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与分析 研究生：杨辉 导师：吴爱武教授 陈心春教授 申请学位级别：医学硕士年级：二零一零级 学科专业：临床检验诊断学研究方向：感染与免疫 论文提交日期：2013年5月论文答辩日期：2013年6月 学位类型：医学科学学位学位授予单位：广州医学院 答辩委员会主席： 评议人： 二0一三年三月
广州医学院 硕士研究生学位论文 结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与 分析 Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis 专业名称: 临床检验诊断学 研究生: 杨辉 导师: 吴爱武教授 陈心春教授 二0一三年三月·广州
目录 中文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1 英文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4 英文缩略词~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 7 前言~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~8 第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB 基因的检测与分析~~~~~~~~~~~~ 11 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 11 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~16 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~18 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~20 第二部分异烟肼耐药结核分枝杆菌相关耐药基因的检测与分析~~~~~~~~~~~21 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 21 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~27 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~30 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~31 第三部分HRMA技术检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药~~~~~~~~~~~~ 32 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 32 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~36 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~42 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~44 全文总结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 45 参考文献~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 46 综述~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~51 附录~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~59 攻读学位期间取得研究成果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 61 致谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~63 学位原创性声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 学术论文知识产权声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 关于学术论文使用授权的说明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64
结核分枝杆菌耐药机制的研究进展
结核分枝杆菌耐药机制的研究进展 孙勇李传友许绍发 【摘要】在人类的传染病中，结核病死亡率最高。每年约有２００万人死于结核病Ｉ而且估计每年有 ９２０万的新发病例，更为严重的是全世界１／３的人口都感染过结核分枝杆菌。据ＷＨＯ统计，目前全世界耐多药结核患者已占２０％．而且这个数字在逐年递增。因此．明确结核分枝杆菌耐药机制不仅能够建立快速、灵敏、准确的检测方法，更重要的是能找到抗结核药物靶点，开发新的抗结核药物。控制结核病疫情．减轻患者的负担与痛苦。 【关键词】结核分枝杆菌；耐药机制；细胞壁；分子机制；外排泵 ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｌｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＳＵＮＹｏｎｇ，ＬＩＣｈｕａｎ—ｙｏｕ，ｘｕＳｈａｏ－ｆａ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。ＢｅｉｊｉｎｇＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｄＴｈｏｒａｃｉｃＴｕｍｏｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ。Ｂｅｉｊｉｎｇ１０１１４９，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＩＣｈｕａｎ—ｙｏｕ，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｈｕａｎｙｏｕ６６８８＠ｈｏｔｍａｉｌ．（Ｄ研 ＸＵＳｈａｏ－ｆａ，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｓｈａｏｆａ＠２６３．ｎｅｔ ［Ａｈｔｍｃｔ］Ｉｎｈｕｍａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔｈｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，ａｂｏｕｔｔｗｏｍｉｌｌｉｏｎｐｅｏｐｌｅｄｉｅｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｅｖｅｒｙｙｅａｒ．Ｉｔｉｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｈａｔｎｅｗｃａｓｅｓａｒｅ９．２ｍｉｌｌｉｏｎｅａｃｈｙｅａｒ．Ｍｏｒｅｓｅｒｉｏｕｓｌｙ，ｏｎｅｔｈｉｒｄｏｆｔｈｅｗｏｒｌｄ’ｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｈａｓｂｅｅｎｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔＯ ＷＨＯｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｒｏｕｎｄｔｈｅｗｏｒｌｄｈａｖｅａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒ２０％．ａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｉｓｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｙｅａｒｂｙｙｅａｒ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ａｃｌｅａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｃａｎｎｏｔｏｎｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｂｕｔａｌｓｏｆｉｎｄａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｓ，ｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｄｒｕｇｓ。ｃｏｎｔｒｏｌｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｂｕｒｄｅｎａｎｄｓｕｆｆｅｒｉｎｇｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ． ［ＫｅｙｗｏｒｄｓｌＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＩＤｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ；Ｃｅｌｌｗａｌｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｉ Ｅｆｆｌｕｘｐｕｍｐ 目前对于结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）耐药性机制研究很多，但主要有 ３种观点：①细胞壁结构与组成变化，使细胞壁通透 性改变。药物通透性降低．产生降解或灭活酶类。改 变了药物作用靶位。②可能存在耐药质粒或转座子 介导的耐药；在ＭＴＢ中己经发现了活跃的药物外 排泵系统，外排泵能将菌体内药物泵出，使得胞内药 物浓度不能有效抑制或杀死分枝杆菌。从而产生耐 药性。③结核杆菌耐药性的产生多见于其基因组上 编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变 Ｉ）（）ｌｌ１０．３７６０／ｃｍａ．ｉ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３６Ｘ．２０１０．０２４．００９ 基金项目ｌ同家重大科技专项（２００８ＺＸｌ０００３—００５） 作者单位１１０１１４９北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫 学室（孙勇、李传友）．胸外科（许绍发） 通信作者ｌ李传友．ＥｍａｉｌｌＩ．ｃｈｕａｎｙｏｕ６６８８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ 许绍发．Ｅｍａｉｌｌｘｕｓｈａｏｆａ＠２６３．ｎｅｔ ?１５０ｌ?．综述． 所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。本文就这三个方面与耐药机制关系作一综述。１ＭＴＢ的细胞壁的结构与组成变化 ＭＴＢ的细胞壁和其他细菌有着很大的差别，其肽聚糖主要由Ｎ一乙酰葡萄糖胺和Ｎ一乙酰胞壁酸组成，类脂质含量超过６０％，而革兰阴性细菌类脂质含量仅占２０％左右。类脂质是一类复杂的复合物，它赋予ＭＴＢ表面疏水性，含有分枝菌酸、索状因子、多糖类、磷脂、蜡质Ｄ等［１】。分枝菌酸是ＭＴＢ和棒状杆菌属独有的结构，主要由２２—２４碳短链和４０－６４长链分枝脂肪酸组成．分枝菌酸层能形成有效的屏障。使ＭＴＢ免受溶菌酶、自由基等损伤。抵抗亲水性化合物或抗生素的攻击。而阿拉伯半乳聚糖层又能阻止疏水性分子的进入。此外。分枝杆菌细胞壁上有选择性阳离子的孔蛋白．能有效控制或阻滞亲水性小分子的扩散，大大降低了化合物的渗
HBV耐药基因突变检测
HBV耐药基因突变检测 项目简介：HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。国内外公认的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类药物两类。核苷（酸）类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。 长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。耐药发生的直接后果即为药物疗效的降低和丧失，具体表现为肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至出现肝衰竭。 乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒 P 基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA 批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒 P 基因变异有关。如拉米夫定耐药相关突变位点为D 区M204V/ I、B 区L180M，阿德福韦相关突变位点为D 区N236T、B 区A181V，替比夫定为M204I，L180M，病毒只需要1 个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M +M204I/V)，同时出现Al84G 或S202I 或M250V 突变。随着用药时间推移，各类核苷酸类似物发生耐药的几率是不尽相同的。其中拉米夫定几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4 年内都维持在1.1%。 因此通过检测HBV耐药基因突变点有助于判断治疗的效果、制定个体化抗病毒治疗方案。使用核苷酸药物导致耐药基因突变原理如下图所示。
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测 近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。 1.2 引物序列为 1.3 方法 1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。 1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。 1.3.3 SSCP银染PCR扩增阳性的标本进行SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液95℃变性10 min，立即冰浴5 min，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为6℃/100V电压，电泳约2~3 h，电泳结束后，取凝胶板经硝酸银染色，观察结果并照相。 2 结果 2.1 61株结核分支杆菌临床分离株中，26株药物敏感株中，各有1株KatG 基因和rpoB基因发生突变。35株同时耐异烟肼和利福平分离株中，有22株有KatG基因突变，突变率62.9％。同时有31株有rpoB基因发生突变，突变率为88.6％。结果见表1。 2.2 用PCR-SSCP技术分析对39例同时耐INH和耐RFP肺结核病患者的痰标本和24例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。以结核分支杆菌H37RV为对照，39例耐RFP痰标本中31例PCR扩增阳性，其中25例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，rpoB突变率为64.1％。耐INH肺结核病患者的痰标本有28例扩增阳性，17例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异，突变率为4 3.5％。24例非结核病患者的痰标本rpoB基因和KatG基因PCR扩增
耐药基因型检测
耐药基因型检测操作规程作业指导书 1目的 本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。 2适用范围 适用于HIV-1耐药基因型测定。 3职责 在使用in-house方法进行耐药性检测过程中，研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。 4作业程序 4.1核酸提取：推荐使用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取RNA。 4.2引物 4.2.1 扩增引物 第一轮PCR： 外侧上游引物MAW 26：5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’; HXB2 2028-2050 外侧下游引物RT21：5’-CTGTA TTTCTGCTA TTAAGTCTTTTGA TGGG-3’; HXB2 3509-3539 第二轮PCR： 内侧上游引物PRO-1 ：5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’; HXB2 2147-2166 内侧下游引物RT20 ：5’-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3’; HXB2 3441-3462 4.2.2 测序引物 正向测序引物： PROS3 ：5’-GCCAACAGCCCCACCA-3’ RTAS ：5’-CTCAGA TTGGTTGCAC-3’ RTBS ：5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’; HXB2 2946-2967 反向测序引物： PROC1S ：5’-GCTGGGTGTGGTA TTCC-3’ RT20S3 ：5’-GTTCTAGCTCTGCTTC-3’ 参照国际标准株HXB2株（全基因1-9719bp）POL基因序列(2253-5096bp)，其中蛋白酶(2253-2549bp)，逆转录酶基因(2250-4229bp)，整合酶基因(4230-5096bp)。我们所使用的方法扩增产物长度为1.3kb，包括蛋白酶基因全长（1-99 codon）和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300 codon)。