细胞免疫学论文

【摘要】作为一种具有靶向性的生物大分子，单克隆抗体始终是人们关注

的热点之一，被广泛用于治疗肿瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源单克隆

抗体的临床应用受限于诱导产生人抗鼠抗体、肿瘤渗入量低、亲和力低和半衰

期短等。随着分子生物学技术的发展及其向各学科的渗透，通过基因操作技术

对抗体进行改造，可使其适用于多种疾病的治疗。抗体人源化已经成为治疗性

抗体的发展趋势，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗

体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了利器。本文简要介绍上述技术的

基本原理、特点和治疗性抗体的研究进展。

【关键词】人--鼠嵌合抗体生物导弹人源化抗体双特异性抗体

【正文】

一、治疗性抗体技术的研究背景

2000年前，人们将自白喉杆菌培养上清液中分离到的可溶性毒素注入马体内，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。随

着免疫学和分子生物学技术的发展，以及抗体基因结构的阐明，DNA 重组技术

开始被用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造，

以消除抗体应用的不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备

各种形式的重组抗体，标志着基因工程抗体时代的来临。自第一个基因工程抗体———人--鼠嵌合抗体于1984 年诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子

抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体等）、某些特殊类型的抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫黏连素等）等。用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中

又一突破性进展。在噬菌体抗体库的基础上，近年来又发展了核糖体展示抗体

库技术，利用核糖体展示技术筛选抗体的整个过程均在体外进行，不经过大肠

杆菌转化步骤，因此可以构建高容量、高质量的抗体库，更易于筛选高亲和力

抗体和利用体外进行的方法对抗体性状进行改造，核糖体展示抗体库技术代表

了抗体工程的未来发展趋势。

二、各种抗体治疗作用的机理与应用

2.1 抗体的基本组成

抗体的基本单位是由4 条肽链组成的对称结构，包括2 条相同的重链和2

条相同的轻链。重链和轻链分别由可变区和恒定区组成。可变区中的互补决定区与抗体和抗原结合的多样性直接有关，而恒定区的结构与抗体的生物学活性

相关。在少数情况下，抗体与抗原结合后可以对机体直接起保护作用，如用抗

体中和毒素的毒性，但在多数情况下需要通过效应功能灭活或清除外来抗原。

抗体的效应功能有2 类，一类是通过激活补体，产生多种生物学效应，如细胞裂解、免疫黏附及调理作用，促进炎症反应；另一类是通过抗体分子中的Fc 段与细胞表面Fc 受体的相互作用，通过其Fc段分别介导调理作用或抗体依赖性细胞毒作用。此外，治疗性抗体的效应和作用机理直接取决于它所识别的抗原决定簇，例如治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤的抗CD20 抗体能影响细胞膜上离子通道的功能，从而调节细胞的分化、增殖和凋亡。

由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现。自从1978 年成功制备出第一株抗黑色素瘤单抗以来，相继出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体。单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是抗体依赖性细胞介导的细胞效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗，已越来越受到重视。另外，用单抗给予T 细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T 淋巴细胞，可用于特异性、被动性的免疫治疗。

自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。利用基因工程技术可制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用，或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。目前针对不同的发病机制，治疗方法趋于多样化。许多变态反应与IgE 有关。Fc 片段可与变应原特异性IgE竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。此外，还可生产出与患者IgE 竞争结合变应原的Fab 样分子。

2.2 免疫毒素

免疫毒素是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的融合蛋白，它能通过靶向结构域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀死肿瘤细胞。早期的免疫毒素是由无修饰生物毒素和鼠源抗体连接而成的，连接的方式常为化学偶联法。由于非人源的毒素和鼠源抗体导致的免疫排斥反应，以及低亲和力和无靶向特异性，使免疫毒素无法在临床中得到运用。

新型免疫毒素是将毒素肽和细胞选择性靶向配体都进行改造后，再用工程菌或工程细胞实现高效表达。细胞选择性靶向配体使用了工程抗体、转铁蛋白、表皮生长因子以及IL-2等。抗体的改造主要集中在降低免疫原性、提高亲和力和增强实体肿瘤渗入率等方面，包括改用小分子工程抗体、人源化抗体、人源抗体和突变的高亲和力抗体等。

2.3 抗体－细胞因子融合蛋白

细胞因子能激活某些免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细

胞和B细胞等。应用细胞因子治疗癌症能够引起免疫应答，但这种免疫反应是非特异的，常产生全身毒性。有人尝试使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成融合蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的靶细胞上聚集，在局部杀伤肿瘤细胞，而非特异性毒性将减少或消失。常用的细胞因子包括IL-2、IL-12和GM-CSF 等，融合的部位可以是全长型抗体或ScFv的N端或C端。抗体－细胞因子融合蛋白作为一种新型的肿瘤免疫治疗药物，其抗体功能域可引导细胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答，多重作用的相加使抗体－细胞因子融合蛋白对肿瘤的抑制作用明显强于单独使用抗体或细胞因子。由于全长型抗体Fc上存在两个效应细胞结合位点，功能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激活效应细胞，另一个与FcγR结合，引发抗体依赖细胞的细胞毒作用 (ADCC)。

三、治疗性抗体的制备技术与研究意义

由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体称为单克隆抗体，可视为第二代抗体。由于其具有特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少等优点，已经在基础研究、临床诊断及治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。在治疗上，单克隆抗体主要用于抗肿瘤、抗器官移植排斥反应、抗感染、解毒等。近年来将单抗与核素、各种毒素（如白喉外毒素或蓖麻毒素）或药物通过化学偶联或基因重组制备成导向药物，用于肿瘤的治疗成为研究的重点。制备单克隆抗体的常规方法是免疫小鼠，杂交瘤可在实验动物中产生无限量单克隆抗体。对大多数杂交瘤来说，现已可用体外方法生产单克隆抗体而无需应用动物。体外单克隆抗体生产系统已有多种，但大规模生产治疗性单克隆抗体需用中空纤维系统，其成功与否取决于杂交瘤的固有特性，如细胞生长和单克隆抗体生产能力等。因此，大量生产以供临床研究应用还有困难，但有几种方法可以解决这些问题，如嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人单克隆抗体的产生。其中，人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。

人源化抗体是从鼠源单抗到全人抗体的过渡形式，在鼠单抗的基础上，用人抗体恒定区置换鼠抗体的相应部位，形成人鼠嵌合抗体。利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达人鼠嵌合抗体，其人源化程度可达到70%左右。嵌合抗体完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和性，降低了免疫原性。美

国食品药品管理局（FDA）批准的抗体药物中有4个是嵌合抗体。但由于其整个可变区都是异源的，所以嵌合抗体的异源性还很明显，解决HAMA的效果并不理想。

由于天然抗体主要是通过调理作用、ADCC 或依赖补体的细胞毒效应起到杀伤靶细胞的作用，因此天然抗体的细胞毒效应有限。下列几种途径可以增加抗

体对靶细胞的杀伤，如免疫结合物、抗体细胞因子融合蛋白、双特异性抗体、

细胞内抗体等。

双特异性抗体亦称双功能抗体，是同一抗体的3 个抗原结合部位分别针对

3 个不同的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能是单价的。双特异

性抗体可以用化学交联、细胞融合和基因工程等方法获得。由于它可以同时与3种抗原发生反应，并使之交联，因而可介导标记物与靶抗原的结合，或使某种效应分子定位于靶细胞；此外，又由于它与抗原结合的单价性，不易引起靶抗

原的调变，从而可提高抗体的某些生物学效应。双特异性抗体重链的异质性使

其FC 片段与FC受体结合的能力明显减弱，减少了该抗体在体内的非特异性分布。双特异性抗体的这些特性使它在诊断和治疗上有广泛的应用前景。目前，

作为治疗肿瘤用的双功能抗体常采用抗肿瘤相关抗原（TAA）及CD3 或抗TAA

及CD16，这类双特异性抗体在

荷瘤动物模型中无论是抑瘤试验还是杀伤试验均获得了良好结果。无论采

用何种免疫活性细胞的效应分子，其杀伤均无MHC限制，这为临床应用提供了

许多方便，目前已有一些双功能抗体正在进行临床试验。

一般的抗体在细胞内合成后分泌到胞外，如果在抗体的N端或C端加入引

导序列，就能使抗体表达定位在亚细胞部位，如胞浆、线粒体、内质网或细胞

核部位。这种在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为细胞内抗体或内抗体。细胞内抗体可以提供一种独有的研究分子功能的新方法，它可以在细胞内

抑制病毒复制、抑制生长因子受体或癌蛋白表达，因此有用于基因治疗的前景，研究较多的是用细胞内抗体抑制I型人类免疫缺损病毒I型（HIV-I）和抗肿瘤。

双特异抗体是指具有两种抗原结合特性的抗体，可同时结合两个不同的抗

原或抗原决定簇。与mAb相比，双特异抗体具有以下优点：(1)较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；(2)对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用；(3)激活结合的细胞毒性T淋巴细胞，发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。早期研制双特异抗体的方法是采用细胞工程，即将两株各自分泌不

同特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞再融合得到四源杂交瘤，或将一株杂交瘤细

胞与免疫的脾细胞融合得到三源杂交瘤，这两种杂交瘤被称为二次杂交瘤)。多

倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。20世纪90年代起，基因工程和蛋白质工程在抗体生产和改造中得到了成功应用，由此产生了抗体工程。应用抗体工程生产BsAb，具有分子量小、方法稳定、可大量生产、成本显著降低和操作简便等优点。

四、治疗性抗体的研究方向与存在问题

抗体应用于人类疾病的治疗已有很长的历史，但其发展历程是曲折的，自单克隆抗体;杂交瘤技术宣告诞生以来，历经多年反复。目前，FDA 已经批准21个治疗性单抗上市。近年来，科学界和医药产业界都对治疗性抗体的研究表现出越来越多的关注。人源化抗体和人抗体的出现为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望。但人抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。影响抗体免疫原性的因素很多，如抗原呈递方式、次级信号系统以及患者的个体差异性等，而抗体的人源化只能解决一个方面的问题。同样，抗体衍生物也会面临诸如免疫原性、毒副作用等自身固有的问题，所以可行的发展方向是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究。根据临床实际设计灵活的治疗方案，使人源化抗体和抗体衍生物互为补充，达到最佳治疗效果。从已上市的抗体药物不难看出，未来的治疗性抗体将朝着人源化和小型化发展，两条途径的结合将最大程度地克服鼠单抗的缺陷使抗体药物得到更为深入和广泛的应用。

五、治疗性抗体的发展前景

单克隆抗体技术的问世,使研究和生产治疗性单抗药物成为现实。随着基因工程技术的发展,新型的重组抗体技术也随之而生。

人们可以利用DNA重组技术对鼠源抗体进行人源化改造、构建合成或半合成抗体库及噬菌体抗体库,从中筛选获得人源抗体,甚至利用转基因小鼠直接获得人源抗体。抗体药物发展的趋势也从鼠源、人-鼠嵌合、人源化到全人源。近年获得批准的抗体药物以全人源为主。1996年至2008年间进入临床研究的人源化单克隆抗体中45%用于治疗肿瘤,28%个用于治疗免疫紊乱。抗体药物的发展进入研发、回报的良性循环,成了国际制药业争夺的焦点。文章就治疗性抗体发展的历史、现状、市场及未来展望作了简要综述。利用抗体工程研制更有效的治疗性抗体的前景非常光明尽管还存在很多问题。实践已经证明，许多新型工程抗体可以在原核或真核细胞中实现高效表达，它们具有较长的半衰期和生物学效应，大多为ScFv、Fab或它们的多聚体，能够有效进入肿瘤细胞，具有比较理想的治疗效果。新型抗体工程技术的不断出现，将为抗体改造提供了强有力的技术平台。相信不久的将来，治疗性抗体会在人类疾病的治疗中扮演重要的

角色。

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