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有机化学实验十柱色谱

实验十柱色谱

一.实验目的:

1. 学习柱色谱的原理及方法。

二.实验重点和难点:

1.学习柱色谱的原理及方法。

实验类型:基础性实验学时:4学时

三.实验装置和药品:

主要实验仪器:色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶

普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯

主要化学试剂:石油醚(600C—900C)丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g

菠菜色素95%乙醇

四.实验装置图:

五.实验原理:

柱色谱法是色谱方法之一。

图 1 柱色谱装置色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。

(一)色谱法的基本原理:

是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同,或其它亲

和作用的性能的差异,使混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配等作用,从

而将各组分分开。

(二)色谱法的分类:

1.根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。

2.根据操作条件的不同,可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相

色谱等类型。

(三)柱色谱原理:

柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配,属于固--液吸附层析。

图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液

体样品从柱顶加入流经吸附柱时,即被吸附在柱的上端,然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同,以不同速度沿柱下移,形成若干色带。再用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出,分别收集各组分,再逐个鉴定。

1.吸附剂:常用的吸附剂有:氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般

要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸

附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗,流速快分离效果不好。颗粒小,表面积大,吸附能力

就高,但流速慢,因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性

三种。

2.溶质的结构与吸附能力的关系:化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强,

吸附能力越大。分子中所含极性较大的基团,其吸附能力也较强。具有下列极性基团的化合物,其吸附能力按下列排列次序递增:

CL-Br-I-〈>C=C〈-OCH3〈-CO2R〈>C=O 〈-CHO 〈-SH 〈-NH2 〈-OH 〈-COOH

氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减:

酸和碱〉醇、胺、硫醇〉酯、醛、酮〉芳香族化合物〉卤代物、醚〉烯〉饱和烃

3.溶剂:吸附剂的吸附能力与吸附剂和溶剂的性质有关。选择溶剂时还应考虑到被分离物各组分的极性和溶解度。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中,选用的溶剂极性应低,体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小,则可加入少量极性较大的溶剂,使溶液体积不致太大。色层的展开首先使用极性较小的溶剂,使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂,将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。

常用的洗脱剂的极性按以下次序递增:

己烷和石油醚〈环已烷〈四氯化碳〈三氯乙烯〈二硫化碳〈甲苯〈苯〈二氯甲烷〈氯仿〈乙醚〈乙酸乙酯〈丙酮〈丙醇〈乙醇〈甲醇〈水〈吡啶〈乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥,否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

4.装柱:吸附柱色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择,而且与制成的色谱柱有关。

色谱柱的大小,视处理量而定。柱的长度于直径之比约为1:10---1:20,固定相用量与分离物质的量比约为1:50---100。先将玻璃管洗净干燥,柱底铺一层玻璃棉或脱脂棉,再铺上一层约0.5cm厚的海石砂然后将氧化铝装入管内,必须装填均匀,严格排除空气,吸附剂不能有裂缝,装填方法有湿法和干法两种:

(1)湿法:是将溶剂装入管内,再将氧化铝和溶剂调成浆状,慢慢倒入管中,将管子下端活塞打开,使溶剂流出,吸附剂渐渐下沉,加完氧化铝后,继续让溶剂流出,至氧化铝沉淀不变为止。

(2)干法:是在管的上端放一漏斗,将氧化铝均匀装入管内,轻敲玻璃管,使之填装均匀,然后加入溶剂,至氧化铝全部润湿,氧化铝的高度为管长的3/4。氧化铝顶部盖一层约0.5cm厚的砂子,敲打柱子,使氧化铝顶端和砂子上层保持水平。先用纯溶剂洗柱,再将要分离的物质加入,溶液流经柱后,流速保持1-2滴/s,可由柱下的活塞控制。最后用溶剂洗脱。整个过程都应有溶剂覆盖吸附剂。

六.实验內容及步骤:

1.取25ml酸式滴定管一支作色谱柱,垂直装置以25ml锥行瓶作洗脱液的接受器。

2.按图所示依次装入脱脂棉。

3.取少量石油醚于层析柱中,打开旋塞,检查其密闭性,确定不漏水后,再加入石油醚至层析柱高的2/3。

4.称取20g的中性氧化铝,从玻璃漏斗中缓缓加入到层析柱中,小心打开柱下旋钮,保持石油醚高度不变,并轻轻敲击(轻敲柱子将填料弄平,必要时可用吸气机将氧化铝填料吸实),流下的氧化铝在柱在柱子中堆积。

5.当溶剂液石油醚的高度距氧化铝表面5mm时,关闭旋塞,然后在层析柱上端加入少量脱脂棉(注:脱脂棉必须完全盖住氧化铝表面,在任何情况下,氧化铝表面不得露出液面)。

6.将上次实验菠菜色素的浓缩液滴入层析柱中(使用滴管),打开下端旋塞,让液面下

降到柱面以下1mm左右,关闭旋塞,用滴管加数滴石油醚安,打开旋塞,使液面下降,重复,直到色素全部进入柱体。控制流速

7.加入约15mL的9:1石油醚与丙酮混合液,打开旋塞,当第一个有色成分即将滴出时,取一试管收集,得橙黄溶液(?-胡萝卜素)。控制流速

8.用同样的方法,用体积比7:3石油醚—丙酮作洗脱剂,分出第二个色带(浅黄液,叶黄素),再用95%乙醇洗脱得蓝色液(叶绿素a)和黄绿色液(叶绿素b)(叶绿素a,b两组份颜色差别小,可能导致色带模糊)。

9.实验完毕,洗净仪器,整理实验台。

10.当液面接近氧化铝填料时,将2.0 mL植物色素的浓缩提取液小心地加到色谱柱顶部。加完后,打开下端活塞,让液面下降到高于氧化铝填料1 mm左右,关闭活塞,加2 mL石油醚,打开活塞,使液面下降,经几次反复洗涤,使色素全部进入氧化铝柱体。待色素全部进入柱体后,在柱顶小心加入25 mL石油醚-丙酮(9:1)溶液,适当加压洗脱出第一个有色组分―橙黄色的β?胡萝卜素溶液。然后用约石油醚-丙酮(7:3)溶液洗脱出第二个黄色带―叶黄素溶液,和第三个色带―叶绿素a(蓝绿色)。最后用石油醚-丙酮(1:1)溶液洗脱叶绿素b(黄绿色)组分。收集各色带后,转入棕色瓶低温保存。七.实验注意事项:

1.色谱柱填装紧密与否,对分离效果很有影响。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀(更不能有断层或暗沟)时,会影响渗滤速度和显色的均匀。但如果填装时过分敲击,又会因太紧密而流速太慢。

2.为了保持色谱柱的均一性,使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶剂或溶液流干时,就会使柱身干裂,影响渗透和显色的均一性。

3.最好用移液管或滴管将分离的溶液转移至柱中。

4.如不装置滴液漏斗,也可用每次倒入10mL洗脱剂的方法进行洗脱。

5.中性氧化铝应在500℃烘干4 h,然后冷却至100℃,迅速装瓶,置于干燥器中待用。

6.分离后的单一色素提取液不宜长期存放,必要时应抽干充氮避光低温保存。

八.实验相关內容:

柱色谱

柱色谱法(column chromatography)

柱色谱法又称柱层析。固定相装于柱内,流动相为液体,样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离,包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。

(一)液--固色谱原理:液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术,柱色谱属于液-固吸附色谱。

当混合物溶液加在固定相上,固体表面借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分,以不同的作用强度被吸附在固体表面。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同,当流动相流过固体表面时,混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少,吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动,吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动,在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配,新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程,结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面,吸附强的组分移动在后面,吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动,各种化合物在色谱柱中形成带状分布,实现混合物的分离。

(二)柱色谱分离条件:

⑴固定相选择:

柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时,非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用,吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用,有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为:

成盐作用 > 配位作用 > 氢键作用 > 偶极作用 > 范德华力作用。有机物的极性越强,在氧化铝上的吸附越强。

常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等(表1)。

色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5,用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5,用于分离中性物质,应用最广;碱性氧化铝pH为9-10,用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低,活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。活性氧化铝不溶解于水,也不溶于有机溶剂,含水的与无水的物质都可使用这种吸附剂。

硅胶是中性的吸附剂,可用于分离各种有机物,是应用最为广泛的固定相材料之一。

活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。

吸附剂的粒度越小,比表面越大,分离效果越明显,但流动相流过越慢,有时会产生分离带的在重叠,适得其反。

⑵流动相选择:色谱分离使用的流动相又称展开剂。

展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。

在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配,强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多,弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多,随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。

在氧化铝柱中,选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带,流出色谱柱。

当一种溶剂不能实现很好的分离时,选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物,对其它组分不能展开洗脱,需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。

(三)柱色谱分离操作:

⑴柱色谱装置:柱色谱装置包括色谱柱、滴液漏斗、接受瓶。

色谱柱有玻璃制的和有机玻璃制的,后者只用于水做展开剂的场合。色谱柱下端配有旋塞,色谱柱的长径比应不小于7-8:1。

⑵分离操作:

①装柱:色谱柱的装填有干装和湿装两种方法。

干装时,先在柱底塞上少许玻璃纤维,再加入一些细粒石英砂,然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中,边加入边敲击柱身,务必使吸附剂装填均匀,不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的30-40倍,必要时可多达100倍。加够以后,在吸附剂上覆盖少许石英砂。

湿装时,将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊,如干装时一样准备好色谱柱,将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中,加入时不停敲击柱身,务必使吸附剂装填均匀,不能有气泡和裂隙,还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。

②洗柱:

干柱在使用前要洗柱,目的是排除吸附剂间隙中的空气,使吸附剂填充密实。

洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂,适当放开柱下端的旋塞。加入时先快加,再放慢滴加速度,使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身,排出气泡。

③装样和洗脱:

将待分离的混合物用最小量展开剂溶解,小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时,旋开滴液漏斗旋塞,滴加展开剂。滴加速度以1-2滴/秒为适度。整个过程中,应使展开剂始终覆盖吸附剂。

九.思考题:

1.柱色谱中为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱?

2.柱中若留有空气或填装不匀,对分离效果有何影响? 如何避免?

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