文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 大花三色堇FPNI—PCR反应体系的优化

大花三色堇FPNI—PCR反应体系的优化

龙源期刊网 http://www.wendangku.net/doc/0ac0ea72fbd6195f312b3169a45177232f60e4f4.html

大花三色堇FPNI—PCR反应体系的优化

作者:李婧曾媛龚胜

来源:《江苏农业科学》2016年第05期

摘要:融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇(Viola×wittrockiana Gams.)为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度,降低非特异性条带的干扰,对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比,优化了第3轮反应中引物浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、缓冲液用量,筛选了第3轮特异性引物的退火温度,进一步完善

了FPNI-PCR反应体系。各因素优化比对试验表明:FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板,20 μL体系中,用量在4.5~10 ng。第3轮最优反应体系为:20 μL反应体系

中,特异性引物浓度0.2 μmol/L,引物SP2浓度0.75 μmol/L,Taq DNA酶用量1.0 U,dNTP

用量2 μL,10×buffer(20 mmol/L,Mg2+ plus)用量2 μL,模板1 μL(第2轮反应稀释100

倍后取1 μL为模板),ddH2O补足。第3轮反应中,退火温度为64 ℃或66 ℃时条带最为清晰。

关键词:大花三色堇;FPNI-PCR;体系优化

中图分类号: Q785文献标志码: A[HK]

融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)是一种基于热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)技术原理的PCR方法[1],主要是利用目标序列旁的已知序列设计3 个嵌套特异性引物,与给出的9个特

殊设计的随机简并引物(arbitrary degenerate prime,AD)相结合,进行1次巢式反应,并在简并引物的基础上设计2个嵌套的特殊引物替换第1轮PCR所用随机引物用于第2、3轮的扩增。FPNI-PCR中融合引物(fusion primer),即特殊设计的随机简并引物,由3′端的随机寡核苷酸(arbitrary degenerate oligonucleotides)和5′端可设计特异引物的一段序列组成,该序列用以替换初次PCR所用简并引物。经过热不对称循环后的产物含有特异引物结合位点,能有效降低产物稀释后非特异性扩增的影响[2]。FPNI-PCR具有高效灵敏、产物特异性高、重复性好、能够在较短的时间内获得目标片段等优点,是扩增基因侧翼序列特别是启动子的有效方法[3]。

FPNI-PCR与TAIL-PCR技术类似,其反应产物的稳定性、可重复性明显受到反应体系模板、引物、Taq DNA 聚合酶、Buffer以及3轮退火温度等因素的影响[4]。在进行 FPNI-PCR 反应获取未知序列时,有必要根据上述因素,对不同因素进行优化组合,以获得最优的反应结果。

大花三色堇(Viola×wittrockiana Gams.)是重要的冬春季花卉,有着十分丰富的花色和花斑类型,是研究植物花斑形成的理想植物[5]。笔者所在实验室先前的研究表明,二氢黄酮醇