实验一 植物组织培养1-培养基

中国海洋大学实验报告

2015 年 4 月16 日姓名###年级####### 专业####学号###########

课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导培养基的配制

一、实验目的

1.掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理；

2.掌握植物培养基的制作过程；

3.掌握灭菌锅的使用。

二、实验原理

植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

培养基（medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物，含氮物质，无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等。有的培养基还含有抗菌素、色素、激素和血清。培养基按照化学组成分类可以分为天然培养基、组合培养基（又称为合成培养基或综合培养基）、半组合培养基。

MS培养基是目前使用最普遍的植物组织培养基，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速遇上组织的生长。由于配方中的粒子浓度高，在配制、储存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS 固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养。本实验配制的就是MS固体培养基。

三、实验仪器试剂

1、仪器：高压灭菌锅、橡皮筋、报纸、培养瓶、试剂瓶、培养皿、铁烧杯、电炉、玻

璃棒、移液管；

2、试剂：配制MS培养基所需的母液、2,4-D、蔗糖、琼脂、盐酸、NaOH

四、实验步骤：

（一）MS培养基的配制

1、母液的配置

预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。

母液编号化合物吸取母液的量（ml）

1 NH4NO325

KNO3

KH2PO4

MgSO4·7H2O

2 CaCl22H2O 25

3 ZnSO4·2H2O 5

MnSO4·4H2O

H3BO3

4 NaMoO4·2H2O 0.5

CuSO4·5H2O

CoCl2·6H2O

5 KI 5

6 Na-EDTA 2.5

FeSO·7H2O

7 盐酸硫胺素0.05

8 盐酸吡哆醇0.25

9 肌醇 2.5

10 甘氨酸 1

11 烟酸0.25

12 蔗糖15（g）

2、培养基的配制

1）按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积500ml 而量取不同体积的母液（吸取量如图），先加三蒸水至大约400ml

2）然后加入2,4-D 1ml。

3）称取15g蔗糖加入到铁杯中，用盐酸调节溶液的pH在5.7-5.8。

4）加入4.5g琼脂，然后将铁杯放在电炉上加热并且搅拌溶解，防止蔗糖黏在铁杯的底部。等到第一个大气泡从液体底部冒出时，将铁杯取下，用玻璃棒沾取一滴液体，滴在试纸张上，检测培养基是否会凝固。

5）在若短时间内该液滴凝固，则可将液体分装在100ml的三角培养瓶中，一般以容器的1/3～1/4体积为宜，拧紧瓶盖。

6）贴好标签。

二）准备工作

1、灭菌

放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm-2，121℃保持15～20分钟即可。为保证灭菌彻底，在增压前应先将灭菌锅内的冷空气排尽，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。

2、准备植物组织培养的实验过程中所需要的器具

每人准备100ml/瓶去离子水，然后灭菌；100ml烧杯/试剂瓶，进行灭菌；每2人一套平板并清洗灭菌。

3、培养基存放

经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。

五．实验结果

植物组织培养所用的培养基可以凝固，而且没有产生污染，基本成功。

六．思考题解答与讨论

1、培养基配制应注意哪些问题？

（1）母液的加入顺序不能颠倒；

（2）配制培养基所使用的蒸馏水最好是三蒸水；

（3）在母液的添加过程中，要避免各个母液之间的交叉污染，每一种母液要有专门的移液管；

（4）注意调节培养基的pH；

（5）记得加入2,4-D！

（6）培养基分瓶时要及时否则会凝固。

2、培养基灭菌冷却后不凝固，请分析原因并提出解决办法。

培养基不凝固的原因：

1）.在培养基配制的过程中没有调节pH或者是pH调节得过低都会导致琼脂不凝固；

解决：再次配制培养基的时候要注意调节pH并且不能讲pH调节得太低。2）.琼脂的质量不好或者是浓度不够也会导致培养基不凝固。

解决：建议使用质量好的琼脂或者继续加热，加入少量琼脂，溶解即可。