蛋白质组技术研究人血清功能蛋白质的新进展
文章编号:1673 8640(2008)03 0327 04 中图分类号:Q51 文献标识码:A
蛋白质组技术研究人血清功能蛋白质的新进展
金宏伟1
, 曾新华2
, 黄河清
2
(1.厦门大学附属中山医院临床检验中心,福建厦门361005;
2.厦门大学生命科学学院分析测试中心,厦门361005)
关键词:蛋白质;蛋白质组技术;分离;进展;标志物基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470372)。
作者简介:金宏伟,男,1975年生,学士,主管技师,主要从事临床化学检验和蛋白质功能研究。通讯作者:黄河清,联系电话:0592 *******。
在人血清蛋白质组的组成、结构与功能研究领域中,目前已拓展一种较为完善的非在线双向凝胶电泳分离与质谱鉴定联用分析技术,可同时鉴定人血清中490种蛋白质[1],使医学科学家从当初对人血清单个蛋白质结构与功能的研究模式跨入对人血清蛋白质组研究的新阶段。人血清蛋白质研究的延伸过程大致可分为3个阶段(1)人血清单个蛋白质认识的初步阶段:在此阶段,科学家主要是采取简便的化学粗分离方法来认识、发现和研究血清单一蛋白质;(2)人血清单个蛋白质组成与功能研究阶段:侧重采用酶学检测和单克隆抗体方法研究人血清蛋白质的生理功能;(3)人血清蛋白组研究阶段:主要是采取各种现代分离、分析与鉴定蛋白质等技术,高分辨地分离人血清蛋白质组,旨在发现更多低丰度功能多肽、蛋白质和其他生物大分子,并鉴定其组成、类型、结构和功能。采纳比较筛选学,筛选与肿瘤疾病有关的特异性标志蛋白质[2],用于诊断人类各种重大疾病,尤其在早期诊断。例如:A dkins 等[1]曾在2002年报道了用液相色谱/液相色谱/质谱/质谱(LC /LC /M S /M S)联用技术同时鉴定了人血清中490种蛋白质;Poon 等[3]选用双相凝胶电泳分离与质谱分析(2DE M S)联用技术对原发性肝细胞癌(HCC)患者的血清蛋白质组进行较为详细地研究,发现了HCC 患者血清中除了甲胎蛋白(A FP)上调外,还伴有补体因子C4和铜蓝蛋白的上调;指出补体因子C4和铜蓝蛋白可能是原发性肝细胞癌的标志物。
目前由双相凝胶电泳(或双相无胶分离)、质谱分析技术和生物信息学组成的蛋白质组技术已经在研究人血清功能蛋白质组和筛选诊断人类重大疾病标志物等方面的研究发挥极其重要的作用,尤其在临床诊断方面所起的作用更为显著[4],是目前生命科学研究领域中最有挑战性和前瞻性的分析技术之一。
一、高效分离人血清蛋白质技术的进展
无论是建立人血清蛋白质组数据库或采用蛋白质组技术研究人类重大疾病发病机制、疾病诊断、药物疗效和
药物作用靶标等医学科学难题,其中最关键的问题之一在于如何有效富集人血清中的低丰度蛋白质。目前常用的分离技术多数均以双向凝胶电泳和多维色谱分离法为主要手段,但这2种分离技术仍然无法完全去除高丰度蛋白质,这给拓展临床诊断疾病应用范围研究带来了一定的难度[1,4]。为解决这一难题,近年来,医学科学界中的部分科学家侧重于开展人血清蛋白质组预分离研究,促使优化分离方法的研究成为人血清蛋白质组学研究领域中的热点课题之一[4,5]。常用于人血清样本预处理方法有以下几种。
1.超滤离心法 G eorg i ou 等[6]发现了超滤离心技术能有效去除血清白蛋白和部分其他高丰度蛋白质。人血清中白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和脂蛋白等高丰度蛋白质一旦经超滤离心去除后,所富集的低丰度蛋白质适合于直接质谱分析[7]。此外,在超滤分离高丰度蛋白质过程中,有机溶剂洗脱相常常会引起部分蛋白质发生去折叠现象,从而消弱白蛋白与其他小肽或蛋白质之间相互作用强度,有利于直接质谱分析。如果低丰度蛋白质或小肽经胰酶酶解后,再经强阳离子交换柱分离和毛细管液相色谱与串联质谱在线分析后,可鉴定出340种蛋白质,其中没有发现任何肽段是来自人血清白蛋白的酶解产物。
2.免疫亲和层析 S teel 等[8]发现在抗人血清白蛋白(HSA )的单克隆抗体免疫亲合柱分离血清样本过程中,可以起到去除白蛋白和白蛋白酶解片段的效果。P i eper 等[5]用免疫亲和层析法在去除血清高丰度蛋白质基础上,又采用阴离子交换和排阻色谱技术分离血清样本为74个单元组分,随后采用双相凝胶电泳分离技术对这些单元组分逐一分离,最终获得3700个蛋白质斑点。这些蛋白质斑点经质谱鉴定后,发现其中325个蛋白质斑点是来自于修饰蛋白质,检测灵敏度为10 g /L,例如白细胞介素、组织蛋白酶和肽类激素等微量组分均能被有效分离与检测。大量实验结果表明,免疫亲和层析法不仅
具有特异性好的优势,而且能有效地去除血清中的干扰物,其分离效果优于超滤离心法。
3.等电聚焦预分离法 利用蛋白质相对分子质量的大小和抗原抗体的特异性反应也是有效去除血清中高丰度蛋白质的有效措施。如果根据蛋白质具有等电点差异性和不同等电聚焦的特点,对人血清蛋白质组分馏为一系列连续不同p H值的混合组分,并按常规电泳分离方式进行二次分离,其结果至少能提高血清蛋白质上样量6~ 30倍,适合于低丰度蛋白质的分离与纯化,起到富集低丰度蛋白质的浓缩效果[9]。W ang等[10]用等电聚焦方法将血清样本分成为20个组分,然后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(M ALD I TO F M S)技术鉴定出262个蛋白质和多肽组分。
4.多维液相色谱法 A dkins等[1]用白蛋白/球蛋白(A/G)方法去除血清免疫球蛋白(高丰度蛋白质),并用强阳离子交换柱分离不同肽段的组分,最后再采用反相毛细管液相色谱法和质谱技术在线鉴定了490个蛋白质组分,其检测效果比现有的分析技术提高3~5倍,检测蛋白质浓度的下限范围为 g水平,可以检测到血清浓度为0.15~2.5ng/L的血管紧张素原。还可检测如人血清中的人生长激素(hu m an grow t hho r mone,hGH)、白细胞介素 12、前列腺特异抗原等微量蛋白质。虽然目前多维液相色谱分离法一直是分离人血清蛋白质组的有效方法之一,但如果能进一步对血清样本进行优化预处理,其结果不仅能大幅度提高鉴定血清蛋白质种类,而且还能筛选出更多具有医学价值的微量或超微量的蛋白质标志物。
二、血清蛋白质的筛选与鉴定
根据人血清蛋白质组中有许多蛋白质具有相似的理化特性特点,学者们曾对人血清蛋白质组进行亚蛋白质组分类,其目的在于降低分析与鉴定的难度。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELD I TOF M S)技术兼并上述优势,能使分析与鉴定人血清中目标蛋白质组的过程简单化。该技术通过固定在蛋白质芯片上的特殊功能基团专一性地结合目标蛋白质,去除非结合性蛋白质亚组,从而提高质谱分析目标蛋白质的灵敏度,并具有快速、高通量特点。此外,SELD I TOF M S技术可以同时筛选多个生物标记物及鉴定低丰度、小相对分子质量的蛋白质,但该蛋白质芯片成本较高,不适合在地方医院进行临床推广应用[11]。以美国C iphergen B i o syste m s公司的产品为例,蛋白芯片分为化学表面芯片和生物表面芯片,其中化学表面芯片又分为疏水、亲水、阳离子、阴离子、金属离子螯合等5种芯片,将血浆蛋白质依据理化性质分为5类,可以检测到小相对分子质量、低丰度和未知的蛋白质。一旦相应的蛋白质与芯片结合后再经SELD I TO F M S检测后,所获得蛋白质的质量指纹图谱适用于各类疾病的早期诊断、药物疗效判定和不良反应的监测。Z hang 等[12]将血浆糖蛋白接合在固相载体上,利用稳定同位素标记糖肽,再用肽N 端糖苷酶F降解N 连接糖蛋白,回收释放出的糖肽组分,并采用多级质谱技术进行鉴定,从而对血清中的N端糖基化的蛋白进行了鉴定和定量分析。为了降低血清蛋白质组分析过程的复杂性,人们陆续拓展了M ALD I TO F M S、电喷雾电离飞行时间质谱(ESI TOF M S)和M S/M S技术,并用于人血清蛋白质组的组成、结构与功能的研究。W u等[13]为了探索离子阱质谱技术鉴定和定量复杂生物样品中低丰度蛋白质的可行性,这些学者将质谱鸟枪法应用在血清蛋白质组的研究,靶蛋白是1种在人血浆中含量低于f m o l/L水平的蛋白质h GH,约为1.6 g/L。如果将外源性hGH加入血清中,使其浓度达到原有浓度的10倍,刚好是疾病状态下血清h GH的浓度(如肢端肥大症)。在未经任何预纯化步骤条件下,采用一维和二维液相色谱/串联质谱技术能有效地鉴定hGH,这说明鸟枪测序法适合于鉴定复杂溶质样本中的低丰度蛋白质,尤其适于鉴定血清中低丰度蛋白质的种类和含量。
由于血清蛋白质组成复杂性、高度异源性等特点,因此对人血清蛋白质组的组成与结构分析相对于其他混合蛋白质体系呈现出更大的难度。但是随着分离与鉴定技术的不断拓展和完善,现有的研究成果已取得实质性进展。目前在人血清蛋白质样本中已有490个蛋白质被发现和鉴定[1],同时在筛选与人类各类重大疾病相关的蛋白质和药物毒物反应蛋白质方面的研究也获得了可喜的成果。
P oon等[14]对38例肝癌的血清样本进行阴离子交换柱分离和蛋白质芯片及SELD I TOF M S鉴定,确定肿瘤特异性较高的血清蛋白质亚组的特征指纹图谱,提出这一特征图谱对肝细胞癌的诊断具有一定的应用价值,认为已测定的2384个质谱峰中有250个质谱峰是肝癌患者血清相对正常人血清所表现的差异峰,这一特征图谱对肝癌的诊断特异度和敏感度分别提升到90%和92%。王征等人[15]采用双向电泳和质谱技术联用技术分析了10例肝癌患者的血清和3份正常对照血清,发现在早期肝癌患者血清中,明显下调的蛋白质是与机体免疫功能有关的限制性膜蛋白;明显上调及所表达的蛋白质均与细胞增殖、分化有关的生长因子或肿瘤相关基因的蛋白质,例如转化生长因子2 !受体、尿激酶纤维蛋白酶原激活因子受体及起始转录因子4D等。此外,SELD I TOF M S 技术不仅可用于肝癌患者疾病的筛选工作,而且适合于卵巢癌、乳癌、食管癌、前列腺癌等肿瘤标志物的筛选工作。P etr i co i n等[16]曾将10 L血清加在蛋白质芯片上,利用蛋白质芯片SELD I TOF M S技术进行目标蛋白质组分析,发现质量/电荷(m/z)比在534、989、2111、2251和2465处的5个质谱峰的丰度同时发生变化,这一技术对卵巢癌诊断有着潜在的应用价值。用血清蛋白指纹图谱进行盲法分析过程中,同样也获得较为理想的分析结果,即灵敏度为100%,特异性为95%,阳性预测值为94%。而相同样本测定糖抗原(CA)125阳性预测值仅为35%。
这一现象说明,蛋白质芯片质谱联用技术只需要很少量血清样本即可在30m i n内获得诊断结果,在临床诊断方面显示出独特的优势[17]。
M a rsha ll等[18]随机选取6例心肌梗死患者的血清和6名正常人的血清进行对比试验。先将血清样品稀释10倍,然后通过反相C18柱进行脱盐并富集低丰度蛋白质,随后采用MA LD I TOF M S检测与疾病发生和形成相关的差异蛋白质的结构信息,其分析结果为阐明心肌梗死起因新的学术观点。目前临床上诊断肺癌的主要技术是采用非侵入性的放射性检查法?计算机X线断层扫描(CT)或正电子发射电子计算机断层扫描(PET)#。虽然这类检查可以给肿瘤定位,但却无法辨别是否为恶性,还必须采用组织病理学进一步确诊。然而,M ALD I TO F M S检测技术可依靠软件分析功能缩小检测标志物分析范围,提高检测的灵敏度和可靠性,并有可能替代现有的CT或PET方法。H ow ard等[19]选取24例肺癌患者及17名正常人的血清,采用液相等电聚焦(IEF)分离技术将血清进行预分离后,再进行M ALD I TOF M S检测分析。通过比对大量实验数据,发现差异蛋白质实际上是血清淀粉蛋白A (SAA,m/z为11702?14),其结果通过采用酶解测序和免疫印迹法进一步证实。用酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测SAA,发现肿瘤患者血清中的S AA含量(286ng/mL)显著高于正常人水平(34.1ng/mL),这些实验结果进一步证实了采用上述实验方法所获得的测试结果的可靠性和可行性。
三、人血清蛋白质分离技术的发展趋势
M agnan i等[20]发现4种化学材料(玻璃、氨基硅烷化玻璃、透明质盐和硫代透明质盐)具有能吸收人血清蛋白质的特点,并采用双向凝胶电泳给予分离。W ang等[21]研制出一种亲和旋转过滤管,能有效地去除人血清中高丰度蛋白质并富集低丰度蛋白质,适合于采用双向凝胶电泳进一步分离与筛选新标志物。M artosell a等[22]选用免疫亲和液相色谱技术去除人血清中6种高丰度蛋白质,对剩余的低丰度蛋白质样本用反相 液相色谱仪进一步分离,并用MA LD I TDF M S技术进行蛋白质鉴定。Chromy 等[4]拓展双相差异凝胶电泳法,在去除6种人血清高丰度蛋白质的基础上,分离出约1500个蛋白质斑点,认为该分离技术适合于研究人血清蛋白质组学。Z i m m er m an 等[23]发明以单相十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S PAGE)技术分离人血清蛋白质,采用胶内酶解和液质联用技术鉴定人血清中的蛋白质,无需事先预分离血清中的高丰度蛋白质就可以获得理想结果。M isek等[24]选用3种不同颜色的染料标志物标志人血清中的蛋白质,在去除高丰度蛋白质的基础上,对人血清样本进行三相分离(电荷、疏水性和相对分子质量),最终获得高达5000条的蛋白质带,显示出极高的分辨率。B j o rhall 等[25]选用5根亲和分离柱组成多维分离系统,在去除人血清中高丰度蛋白质后,采用双相凝胶电泳技术进一步分离低丰度蛋白质;所富集的低丰度蛋白质样本同样也适合于直接质谱分析。
近期,我们曾采用不同的激光强度分解由24个亚基高度对称性组成的铁蛋白为游离亚基混合物,并形成分子离子供质谱分析。此外,该项技术已用于削弱人血清中蛋白质之间的相互作用强度,提高生物大分子离子化率,并用于筛选可诊断人类各种重大疾病的蛋白质标志物[26]。鉴于上述对各种电泳和质谱联用技术研究人血清蛋白质组的描述,因此目前分离人血清蛋白质的最大缺陷在于去除高丰度蛋白质同时,会使许多已络合于高丰度蛋白质的多肽随之丢失,推测这些生物大分子多数为具有一定医学价值的新标志物。如何富集这些生物大分子将是今后开展人血清蛋白质组学研究必需解决的另一个新的关键性问题。
参考文献
[1] Adk i ns J N,Varnu m SM,Auberry K J,et a.l To w ard a hu m an
b l ood serum p rot eo m e:anal ys i s by mu lti d i m ens i onal s ep ara
ti on coup led w i th mass s p ectro m etry[J].M o l C ell Pro
t eo m ics,2002,1(12):947 955.
[2] L i LH,T ang H,W u Z,et a.l Data m i n i ng techn i ques for
cancer detection us i ng serum p rot eo m ic p rofiling[J].Arti f In
t ellM ed,2004,32(2):71 83.
[3] Poon TC,Johnson PJ.Proteo m e anal ys i s and it s i m pact on t he
d i scovery of serol ogical t um or m ark ers[J].C li n Ch i m A ct a,
2001,313(1 2):231 239.
[4] Ch ro m y BA,Gon z a l es AD,Perk i n s J,et a.l P rot eo m ic anal y
s i s of hum an serum by t w o d i m ens i ona ld ifferenti al gel el ectro
phores i s after depleti on of h i gh abund ant p rot eins[J].J Pro
t eo m e Res,2004,3(6):1120 1127.
[5] P i eper R,Su Q,Gatli n CL,et a.l M u l ti co m pon ent i m muno
affi n i ty s ub tracti on ch ro m at ography:an i nnovati ve step t o
w ards a co m prehens i ve s u rvey of t he hum an p las m a proteo m e
[J].Proteo m i cs,2003,3(4):422 432.
[6] Georgiou HM,R ice GE,BakerM S.Proteo m ic anal ysis of hu
m an plas m a:f ailure of cen trif ugal u ltrafiltrati on t o re m ove al
bum i n and other h i gh mo l ec u lar w ei gh t protei n s[J].Pro
t eo m ics,2001,1(12):1503 1506.
[7] T irum al aiRS,Chan KC,Priet o DA,et a.l Characteri zati on of
t he l o w m olecu l ar w ei ght hu m an serum proteo m e[J].M ol
Cell Proteo m i cs,2003,2(10):1096 1103.
[8] SteelLF,T rotterM G,Nakaji m a PB,et a.l E ffici en t and s p e
cifi c re m ova l of al bum i n fro m human serum sa mp les[J].M ol
Cell Proteo m i cs,2003,2(4):262 270.
[9] Zuo X,SpeicherD W.Co m prehens i ve ana l ysis of co m plex pro
t eo m es us i ng m icroscale sol uti on is oel ectrof ocus i ng pri or to
narro w p H range t w o d i m ens i on al electrophoresis[J].Pro
t eo m ics,2002,2(1):58 68.
[10] W angM Z,H o w ard B,Ca m pa M J,et a.l Ana l ysis of hu m an
serum p rotei ns by li qu i d phase is oel ectri c focu si ng and matri x
assisted laser d esorpti on/i on i zati on m ass spectro m etry[J].
Proteom ics,2003,3(9):1661 1666.
[11] S ei bert V,EbertM P,Buschm ann T.Advances in cli n i cal
can cer prot eo m ics:SELD I ToF m ass spectro m etry and b i o
m arker d iscovery[J].Brief Funct Geno m i c Proteo m i c,2005,
4(1):16 26.
[12] Zh ang H,LiX J,M arti n DB,et a.l Identification and quanti
fi cati on of N li nked gl ycop rotei ns us i ng hydraz i de che m i stry,
stab l e is otope l abeli ng and m ass spectro m etry[J].N at B i o
techno,l2003,21(6):660 666.
[13] W u SL,Amato H,B iri nger R,et a.l Targeted proteo m i cs of
lo w l evel protei n s in human p l as m a by LC/M Sn:using hum an
gro w th hor m one as a model s yste m[J].J Proteo m e Res,
2002,1(5):459 465.
[14] Poon TC,Y i p TT,Chan AT,et a.l Co m prehens i ve p rot eo m ic
profili ng i den tifi es serum proteom ic s i gnat u res for detecti on of
h epat ocellular carci nom a and its s ub t ypes[J].C lin Che m,
2003,49(5):752 760.
[15] W ang Z,Ruan YB,Gu an Y.An al ysis of p roteo m i c co m po
n ents of sera fro m p ati en ts w ith hepatocell u l ar carci no m as by
t w o d i m ensional electrophoresis and matri x ass i sted l aser de
s orp tion/i on izati on ti m e of fl y i ng m ass spectro m etry[J].
Zhonghua B i ng L iXue Za Zh,i2003,32(4):333 336. [16] Petri co i n EF,A rdekan iA M,H ittBA,et a.l U se of p rot eo m ic
patt erns i n serum t o i d entif y ovari an can cer[J].Lancet,
2002,359(9306):572 577.
[17] S chw egler EE,Caz ares L,S t eel LF,et a.l SELDI TOF M S
profili ng of serum f or detecti on of t he progres s i on of chron ic
h epatitis C to hepatocell u l ar carci no m a[J].H epat o l ogy,
2005,41(3):634 642.
[18] M ars hall J,Kupchak P,Zhu W,et a.l Processi ng of serum
protei ns underlies them ass spectral fi ngerp ri nti ng ofm yocard i
al i n f arction[J].J Proteo m e Res,2003,2(4):361 372. [19] H o w ard BA,W ang M Z,C a mpa M J,et a.l Iden tifi cati on and
validati on of a poten tial l ung can cer s erum b i o m arker detected
by m atri x as s i s t ed laser des orpti on/i on iz ati on ti m e of fli gh t
spectra anal ys i s[J].Proteo m i cs,2003,3(9):1720 1724. [20] M agnan iA,B arbucciR,La m pon i S,et a.l Tw o step el u tion
of hum an serum protei n s from d i ff eren t glass m od ified b ioac
ti ve surfaces:a co m parative proteo m ic an al ysis of ad s orpti on
patter n s[J].E lectrophoresis,2004,25(14):2413 2424. [21] W ang YY,Cheng P,Chan D W.A si m p l e affi n ity s p i n t ube
filterm et hod for re movi ng h i gh abundan t co mmon protei n s or
en ri ch i ng l o w abundan t b i o m ark ers for serum proteo m ic anal y
s i s[J].Proteo m ics,2003,3(3):243 248.
[22] M artos ell a J,Zol otarj ova N,L i u H,et a.l R eversed phas e
h i gh perf or m ance li qu i d ch ro m at ograph i c p refracti onati on of
i m munod epleted hum an ser um protei n s to enhan ce mass spec
tro m etry i den tifi cati on of l o w er abundan t p rotei ns[J].J Pro
t eo m e Res,2005,4(5):1522 1537.
[23] Z i m m er m an LJ,W ernke GR,Capri oliR M,et a.l Iden tifi ca
ti on of protei n frag m en t s as pattern feat u res inM ALDI M S an
alyses of s erum[J].J Proteo m e Res,2005,4(5):1672
1680.
[24] M is ek DE,Ku i ck R,W ang H,et a.l A w i d e range of protei n
is ofor m s i n seru m and p l as m a uncovered by a quantit ati ve i n
t act protei n analysis syste m[J].Proteom ics,2005,5(13):
3343 3352.
[25] B j orhallK,M ili oti s T,Davi dsson P.Co m pari son of d iff eren t
dep leti on strateg i es for i m proved res o l uti on i n p rot eo m ic anal y
s i s of hum an s erum sa m ples[J].Proteo m ics,2005,5(1):
307 317.
[26] HuangHQ,X iao Z Q,L i n Q M,et a.l C haracteristics of trap
p i ng various organophos phorus pestici des w it h a ferriti n reactor
of s hark li ver(Sphyrna zygaena)[J].Anal Che m,2005,77
(6):1920 1927.
(收稿日期:2007 08 06)
(本文编辑:龚晓霖)
简讯
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拟定于2008年7月中下旬在南宁市举办国家级继续教育%血栓与止血学临床检验质量保证及新进展学习班&[2008 11 00 040(国),?类学分8分],由多学科有丰富经验的优秀专家分别对以下6个专题进行学术交流:(1)血栓与止血学检验质量保证;(2)血栓与止血学检验新进展;(3)血栓与止血学检验仪器与使用;(4)血栓与止血学与临床;(5)检验医学论文中统计学处理的缺陷分析、循证医学检验统计学方法与循证医学科研思维;(6)医学论文(含SCI论文)撰写。欢迎检验与临床医务工作者参加。同时,接收尚未公开发表的相关论文投稿,并汇编论文资料。现可通过网上信箱、来信、电话报名或投稿。正式会议通知于会议前一个月寄发。
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