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实验五 柱色谱

实验柱色谱

[教学目的]

1、学习柱色谱技术的原理和应用。

2、掌握色谱分离技术和操作。

[教学内容]

一、实验原理

柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。实验室常用的是吸附色谱,其原理是利用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解析能力不同,让混合物随流动相流过固定相,发生多次的吸附和解析过程,从而使混合物分离成两种或多种单一的组分。

吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小不同分别形成一段一段的层带。随着洗脱过程的进行从柱子底端流出,分别收集不同的层带,再将洗脱剂蒸发,就可以得到单一的纯净物质。

二、实验装置及样品

色谱柱、样品为甲基橙与亚甲基蓝的乙醇溶液

1、吸附剂的选择

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种:酸性氧化铝为用1%盐酸浸泡后,再用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4,用于分离酸性物质。中性氧化铝其悬浮液的pH为7.5,用于分离中性物质。碱性氧化铝其悬浮液的pH为10,用于胺或其它碱性物质的分离。

大多数吸附剂都能强烈地吸水,而且水分易被其它化合物置换,因此吸附剂的活性降低,通常有加热方法使吸附剂活化。氧化铝随着表面含水量的不同,而分成各种活性等级。活性等级的测定一般采用勃劳克曼(Brockmann)标准测定法。

2、溶质的结构与吸附能力的关系

化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减:酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代

物、醚> 烯> 饱和烃

3、洗脱剂的选择

溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。一般洗脱剂的选择是通过薄层色谱实验来选择的。选择洗脱剂的另一个原则是:洗脱剂的极性不能大于样品中各组分的极性。这样的话,样品会一直留在流动相中,而达不到分离的效果。

常用洗脱剂的极性按如下次序递增:石油醚、己烷、环己烷、四氯化碳、三氯乙烯、二硫化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸。

注意:所用溶剂必须纯粹和干燥,否则会影响吸附剂的活性和分离效果;本实验所用溶剂为95%的乙醇。

三、实验操作步骤:

1、装柱(湿法)

将吸附剂中性氧化铝用洗脱剂95%乙醇调成糊状;用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部,轻轻塞紧;再在脱脂棉上盖上一层厚0.5 cm的石英砂,关闭活塞;向柱中倒入95%的乙醇至约为柱高的3/4处,打开活塞,控制流出速度为1-2d/s;再将调好的吸附剂边敲边倒入柱中,当装柱至3/4时,再在上面加一层厚0.5 cm的石英砂。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于砂子的上层。

2、加样品(1 mL 甲基橙和亚甲基蓝的乙醇溶液)

当溶剂液面刚好流至石英砂面时,立即沿柱壁加入1 mL甲基橙和亚甲基蓝的乙醇溶液,当此溶液流至接近石英砂面时,再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗下来,如此连续2—3次,直至洗净为止。

3、洗脱

用95%的乙醇洗脱,控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。

亚甲基蓝由于与氧化铝的作用力较小首先向下移动,较大的加甲基橙则留在柱的上端,形成不同的色带(蓝色的亚甲基蓝和黄色的甲基橙)。当最先下行的色带快流出时,更换接受瓶,继续洗脱,直至滴出液无色为止。之后,将洗脱液改为水,洗脱甲基橙,并接受黄色的流出液,直至滴出液无色为止。停止洗脱。

4、回收溶剂乙醇

将先洗脱的洗脱液倒入蒸馏烧瓶中,常压蒸馏回收乙醇;而将后洗脱的水溶液,弃去。

实验注意事项:

1、色谱柱填充要紧密,要求无断层、无缝隙。若松紧不匀,特别有断层时,影响流速和色带的均匀,但如果装时过分的敲击,色谱柱填充过紧,又使流速太慢。

2、在装柱、洗脱过程中,始终保持有洗脱剂覆盖吸附剂。

3、在洗脱过程中,一定注意一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉,否则组分之间不能完全的分离。

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