_斑马鱼高分辨率整胚原位杂交实验方法与流程
HEREDITAS (Beijing)2013年4月,35(4):522―528ISSN https://www.wendangku.net/doc/0513782067.html,
实验指南
收稿日期:2012?11?14;修回日期:2012?12?27
作者简介:张春霞,在读博士研究生,专业方向：细胞生物学。Tel:010-********;E-mail:zhangchxa@https://www.wendangku.net/doc/0513782067.html, 通讯作者:刘峰,研究员,研究方向：血液与心血管发育生物学。E-mail:liuf@https://www.wendangku.net/doc/0513782067.html, 网络出版时间:2013-1-3016:14:36
URL:https://www.wendangku.net/doc/0513782067.html,/kcms/detail/11.1913.R.20130130.1614.003.html
DOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00522
斑马鱼高分辨率整胚原位杂交实验方法与流程
张春霞,刘峰
中国科学院动物研究所,生物膜与膜生物工程国家重点实验室,北京100101
摘要:整胚原位杂交技术是利用反义RNA 探针检测体内mRNA 表达的一项技术,在利用模式动物研究基因时
空表达方面有着重要的应用。如何使用该技术得到特异、高敏感度的表达结果,对每一个使用该技术的实验室来说都很重要。本实验室参照常规的实验方法,对该技术加以改进,使之更加灵敏,结果更加特异。文章主要以斑马鱼为例,介绍了整胚原位杂交技术的发展历史,并重点介绍了本实验室所用的整胚原位杂交实验流程,同时还分析了实验结果不理想的原因及其解决方法。
关键词:斑马鱼;整胚原位杂交
A brief protocol for high-resolution whole mount in situ
hybridization in zebrafish
ZHANG Chun-Xia,LIU Feng
State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology ,Institute of Zoology ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100101,China
Abstract:Whole mount in situ hybridization (WISH)is a popular technique that is used to study temporal-spatial gene
expression at mRNA level in model systems.Sensitive and high-resolution WISH is important for every laboratory that uses this technique to study expression pattern of genes in wildtype and perturbed embryos.Based on the commonly used protocols in fish community,our lab optimizes them to get more sensitive and specific results.Here,we briefly summarize the history of this technology using zebrafish as an example,describe a detailed experimental protocol,and provide troubleshooting for imperfect results and their solution.
Keywords:zebrafish;whole mount in situ hybridization
整胚原位杂交技术是利用反义RNA 探针检测体内mRNA 表达的一项技术,在研究基因时空表达方面有着重要的应用。其原理如图1所示：在胚胎组织或细胞结构保持不变的情况下,根据碱基互补配对原则,地高辛标记的反义RNA 探针与细胞内的mRNA 特异性结合,利用免疫组织化学的方法,碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体与杂交的核酸探针特异性结合,然后用碱性磷酸酶的发光底物进行显色。这一过程可将基因在体内的表达信号放大,利用显微镜检测基因的时空表达方式及其表达水平。
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整胚原位杂交技术已经广泛应用在各种模式动物中。以斑马鱼为例,整胚原位杂交技术主要应用在以下方面：(1)检测基因的时空表达,为研究该基因功能以及基因分类提供线索;(2)在高通量药物筛选或突变体筛选中,特异表达的基因标记可作为筛选的重要依据。
自1969年Gall和Pardue利用放射性标记DNA 在爪蟾组织切片中检测基因表达以后[1],原位杂交的方法就逐渐应用到基因定位的研究中。在后续的应用中,原位杂交的方法不断得以改进并广泛应用。在斑马鱼发展成为一种动物模型后,Westerfield 等[2]便用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年,Nusslein-Volhard等[3]将Cox建立的RNA原位杂交技术进行了改进,用地高辛标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达[4]。随后,整胚原位杂交技术迅速应用于斑马鱼领域。2008年,Bernard Thisse等将该技术进一步优化,使之更敏感,也提高了基因表达检测的分辨率。
自2009年成立实验室以来,我们一直致力于斑马鱼造血干细胞发育的研究,整胚原位杂交技术成为实验室的一项基本技术,用于检测造血干细胞发育相关调控因子的表达变化[6]。我们参考“The Zebrafish Book”[7]以及Bernard Thisse[5]提供的方法,根据需要加以优化,成功降低了染色背景,提高了敏感度。现将本实验室常规使用的斑马鱼整胚原位杂交的具体实验方法与流程介绍如下。
1材料
1.1探针制备及原位杂交所需试剂
T7RNA polymerase(Promega,P2075);SP6
RNA
图1斑马鱼整胚原位杂交技术原理
地高辛标记的反义RNA探针与细胞内的mRNA特异性结合,利用免疫组织化学的方法,碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体与杂交的核酸探针特异性结合,然后用碱性磷酸酶的发光底物进行显色。图中原位杂交结果为14hpf myoD基因表达情况。
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polymerase(Promega,P1085);DNase I(NEB,M0303S);Heparin sodium salt (Sigma,H4784);tRNA(RNA from torlua yeast,Type VI,Sigma,R6225);Pronase (Sigma,P6911);Protease K(Amresco,0706);Blocking Reagent(Roche,11096176001);anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments(Roche,11093274910);BM Purple(Roche,11442074001),PFA(Paraformaldehyde,Merck,104005);其余试剂均购自北京化工。1.2
探针制备及原位杂交所需器材
LF-杂交炉,ZF-A4原位杂交仪(北京直方,可选)。1.3
原位杂交所需溶液配制
10×PBS 储液(1L,室温保存)：80g NaCl,2g KCl,27.98g Na 2HPO 4·12H 2O,2.4g KH 2PO 4,溶于1L 双蒸水。
1×PBST(1L,室温保存)：100mL 10×PBS,1mL Tween 20,用双蒸水定容至1L 。
4%PFA(500mL,4℃保存)：20g PFA 粉末,溶于500mL 1×PBS 。PFA 不易溶解,需要加热搅拌,但加热温度不能高于70℃。
20×SSC 储液(pH7.0,1L,室温保存)：175.3g NaCl,100.5g C 6H 5Na 3O 7·2H 2O,溶于1L 双蒸水。
2×SSC(200mL,使用前65℃预热)：20mL 20×SSC,200μL Tween-20,用双蒸水定容至200mL 。
0.2×SSC(500mL,使用前65℃预热)：5mL 20×SSC,500μL Tween-20,用双蒸水定容至500mL 。
Pronase(Pronase,30mg/mL,20℃保存)：390mg Pronase 粉末,溶于13mL 缓冲液中,然后置于37℃水浴1h,分装,?20℃保存。使用时,用1×PBS 稀释至1mg/mL,可回收利用2~3次。缓冲液(100mL)：121.1g Tris,58.5g NaCl,溶于100mL 双蒸水中。
Protease K(?20℃保存)：将Protease K 按照10mg/mL 的浓度,溶于双蒸水中制成储液。使用时,按照1:1000的比例将储液加入1×PBST 中,使其终浓度为10μg/mL 。
预杂交液Hybe-(1L,室温保存,使用前65℃预热)：
500mL 甲酰胺,250mL 20×SSC,9.2mL 1mol/L 柠檬酸,1mL Tween-20,用双蒸水定容至1L 。
杂交液Hybe+(4℃保存,使用前65℃预热)：向Hybe-溶液中加入tRNA 和肝素,使其终浓度分别为500μg/mL 和50μg/mL 。
tRNA 储液(50mg/mL,4℃保存)：5g tRNA 粉末,溶于100mL 双蒸水中。注意：tRNA 不易溶解,配制时间相对较长。
肝素储液(100mg/mL,?20℃保存)：100mg 肝素粉末,溶于1mL 双蒸水中。
MAB 溶液(1L,室温保存)：11.6g 马来酸,8.8g NaCl,溶于950mL 双蒸水中,约用8g NaOH 固体调节pH 值至7.5,用双蒸水定容至1L 。
MABT 溶液(1L,室温保存)：1L MAB 溶液中加入1mL Tween-20使其终浓度为0.1%(v/v)。
封闭液(MAB Block,1L,?20℃保存)：20g Blocking Reagent,溶于1L MAB 溶液,使之终浓度为2%(w/v),在65℃加热,每隔几分钟摇晃一次,彻底溶解后分装,?20℃保存,使用时提前解冻。
抗体溶液(现用现配)：将anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments 按照1∶5000溶于封闭液中。
平衡缓冲液(BCL Buffer Ⅲ,200mL,现用现配)：1mol/L Tris-HCl(pH9.5)20mL,5mol/L NaCl 4mL,0.5mol/L MgCl 210mL,20%Tween-201mL,用双蒸水定容至50mL 。
2
实验流程
2.1
探针制备实验流程
反义RNA 探针的获得是通过DNA 转录而来
的。本实验室常采用的方法是以总RNA 反转录产物为模板,克隆得到相应的DNA 片段,并将该片段连接到pGEM-T 或pGEM-T easy 载体中,通过转化获得反向重组质粒。并以此为模板,在体外用相应的T7或SP6RNA 聚合酶进行转录。相对于直接用PCR 产物为模板转录得到反义RNA 探针的方法,该方法所需时间比较长,但探针获得量较大,而且各阶段所得的产物相对比较稳定,可长时间储存。
引物设计原则：为避免反义RNA 探针的非特异性结合,在设计引物时,一般选择3′非翻译区,PCR 产物长度一般为800~1200bp 。
在获得重组质粒后,需将质粒线性化：以T7正向为例,选择片段中不含有、T7方向含有的酶切位点进行线性化。在后期转录时,以线性化质粒为模板,用SP6进行转录。转录结束后,取1μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测。获得转录产物后,每管加入
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1μL DNaseⅠ置于37℃水浴消化15min。消化完毕,每管用RNase Free ddH2O补至100μL,加入2倍体积(200μL)RNase Free的无水乙醇和1/10体积(10μL)RNase Free的醋酸钠(3mol/L),点振混匀,置于?20℃沉淀至少30min。沉淀后的RNA产物,每管加入50~80μL(按电泳条带亮度确定)RNase Free ddH2O充分溶解RNA,浓度约为30~100ng/μL。用Hybe+稀释至1∶10储液,?80℃储存,使用时用Hybe+稀释至1∶200。
表1体外转录反应体系
成分体积
DNA template11μL
5×Buffer4μL
DDT2μL
DIG-Labeling Mix2μL
RNase inhibitor0.5μL
SP6RNA Polymerase1μL
37℃水浴,1.5h
2.2整胚原位杂交实验流程
本实验室整胚原位杂交第1d步骤手动操作,第2d与第3d的清洗步骤使用ZF-A4原位杂交仪(可选)进行操作。
2.2.1整胚原位杂交准备工作
1.取所需时期的斑马鱼胚胎(24hpf以后的胚胎需用含0.003%PTU的鱼水培养以防色素生成),用Pronase除掉卵壳或在显微镜下用显微镊徒手剥去卵壳,然后加入4%PFA,置于4℃过夜固定。
2.吸出4%PFA,加入无水甲醇,置于?20℃脱水至少2h。
2.2.2第1d探针杂交
1.选择合适时期的胚胎(每管胚胎不超过30枚),按如下步骤逐步复水至PBST：
75%methanol+25%PBST,5min;
50%methanol+50%PBST,5min;
25%methanol+75%PBST,5min;
100%PBST,5min,4次;
2.用10μg/mL Protease K处理胚胎,进行通透。处理时间根据时期作不同处理,参考值：24hpf 之前的时期不用处理,24hpf胚胎处理8~9min,36 hpf胚胎处理13min,4dpf胚胎处理40min;
3.用PBST洗5min,2次;
4.用4%PFA室温固定20min;
5.用PBST洗5min,5次,在室温下放在摇床上慢速摇晃;
6.用50%PBST+50%Hybe-洗5min;
7.加入预杂交液Hybe-,65℃(LF-杂交炉)预杂交至少1h;
8.加入100~200μL用杂交液Hybe+按照1∶200稀释的RNA探针(200μL杂交液约含30~100ng RNA),65℃杂交过夜。
注意：如果晚期胚胎长有色素,需在步骤4固定后进行以下脱色处理。
脱色液需现用现配：10mL脱色液含有5.67mL H2O,3.33mL H2O2,1mL(50%formamide+5×SSC),充分混合均匀,加入装有胚胎的EP管中,置于强光下进行脱色(一般置于显微镜下,打底光照射),4d 的胚胎需用8~10min,在脱色过程中要及时放气,以防EP管崩开。脱色完毕,转至上述步骤3。
2.2.3第2d抗体孵育
若采用手动清洗,按照以下步骤进行：
1.将探针吸出回收,贮存于?20℃(探针可回收利用约4~6次);
2.在65℃进行如下梯度洗涤：
100%Hybe-,10min;
75%Hybe-+25%2×SSC,10min;
50%Hybe-+50%2×SSC,10min;
25%Hybe-+75%2×SSC,10min;
2×SSC,10min;
0.2×SSC,15min,4次;
3.在慢速摇晃的摇床上室温进行下列梯度洗涤：
75%0.2×SSC+25%MABT,5min;
50%0.2×SSC+50%MABT,5min;
25%0.2×SSC+75%MABT,5min;
100%MABT,5min;
4.用封闭液(即MAB Block)进行封闭,室温1h,慢速摇晃;
5.吸走MAB Block,加入1∶5000稀释的抗体(Roche),室温摇晃1h,放于4℃过夜。
若采用机器自动清洗,按照以下步骤进行：
1.按上述步骤1回收探针后,每管加入500μL 65℃预热的Hybe-溶液,用塑料吸管轻轻将胚胎吹
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起,并将之缓慢转移至含有足量65℃预热Hybe-溶液的杂交槽中;
2.将杂交槽放入原位杂交仪中,选择第2d 程序,按顺序摆放第2d 所需溶液,如图2程序所示,进行清洗;
3.100%MABT 清洗完毕后,将杂交槽从杂交仪中取出,加入足量封闭液(即MAB Block,提前从?20℃取出)进行封闭,室温1h,慢速摇晃;
4.吸走MAB Block,加入足量1∶5000稀释的抗体(Roche),室温摇晃1h,放于4℃过夜。2.2.4
第3d 染色
若采用手动清洗,按照以下步骤进行：
1.将隔夜孵育的样品置于室温摇晃1h,然后吸走抗体(抗体可回收利用2次);
2.室温下用MABT 洗涤15min,8次;
3.用BCL Buffer Ⅲ洗涤5min,3次;
4.用BCL Buffer Ⅲ与BM Purple 按1∶1配成显色液,在室温下避光显色;
5.显色完成后,用4%PFA 室温固定至少20min;
6.用PBST 洗涤5min,3次;
7.最后吸走PBST,加入90%glycerol,置于4℃储存,用于后续观察和拍照。
注意：在显色过程中,如果染色速度很快,则可在4℃进行缓慢染色或稀释显色液。
图2斑马鱼整胚原位杂交自动程序
A:ZF-A4原位杂交仪;B ：原位杂交仪中设定的第2d 和第3d 的程序。
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若采用机器自动清洗,按照以下步骤进行：
1.按上述步骤1回收抗体后,将杂交槽放入原位杂交仪中,按顺序摆放第3d所需溶液,如图2程序所示,进行清洗。
2.将杂交槽从杂交仪中取出,用塑料吸管轻轻将胚胎转移至新的EP管中,用BCL BufferⅢ与BM Purple按1∶1配成显色液,分别加入各管中,在室温下避光显色;
3.显色完毕,按上述步骤5~7进行终止。
2.2.5图像采集
90%glycerol储存的染色胚胎置于玻璃反应板中,如图3A所示,在外置光源下,用Nikon SMZ1500体视显微镜和Nikon DIGITAL SIGHT DS-Ri1数码摄像头进行拍照。3常见问题及解决方案
常见问题及解决方案见表2。
4结果示例及经验总结
使用本文所述的实验流程得到的结果如图3B 和3C所示,胚胎染色清晰,结构完整。而且,使用原位杂交仪进行清洗,省时省力,同时避免了人为因素的影响,实验结果更加稳定。但是需要注意,转移胚胎的过程动作一定要轻柔,使用杂交槽之前,务必确保杂交槽干净,以免有杂物沾染胚胎。
相对于常规原位杂交方法,本方法对胚胎处理及清洗过程都进行了严格的优化,能够成功降低背景,提高特异性。例如,在清洗过程中进行充分的梯度溶液转换,避免胚胎受不同溶液的影响;
清洗时
图3斑马鱼整胚原位杂交结果拍照及范例
A：原位杂交结果图像采集,将在90%glycerol储存的染色胚胎置于玻璃反应板中,在外置光源下进行拍摄;B和C分别为10hpf shh 和4dpf rag1表达结果。
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表2整胚原位杂交技术常见问题及解决方案
常见问题原因
解决方案
胚胎破碎
蛋白酶K 处理太过
严格控制好蛋白酶K 处理的浓度和时间
胚胎固定问题最好用新鲜配制的4%PFA 溶液进行固定,控制好固定时间吸取胚胎用力过猛
胚胎操作,动作一定要轻柔
染色背景过高杂交温度太低RNA-RNA 杂交温度最好为65℃,严格控制杂交温度清洗不彻底保证清洗所需的时间及温度
蛋白酶K 处理不足
严格控制好蛋白酶K 处理的浓度和时间染色呈蓝绿色
探针浓度过高
将探针稀释至合适浓度
无染色探针合成问题或探针降解探针合成后一定要跑电泳检测探针合成的质量基因表达时间与胚胎时期不一致用RT-PCR 检测基因表达时间
染色只在表面
PFA 固定时间太长或固定温度过高最好用新鲜配制的4%PFA 溶液进行固定,控制好固定时间和温度胚胎发生黏连
控制好蛋白酶K 处理时间,遇到黏连情况应及时将胚胎轻轻吹散开
间也比较充分,降低染色背景;另外,如果样品量大,可以选择本文提供的原位杂交仪清洗步骤。对于低表达基因,建议适当提高探针浓度(可稍高于100ng),延长染色时间。
本文所述的整胚原位杂交技术流程主要是以地高辛标记的RNA 探针-抗地高辛抗体-BM Purple 为例介绍的,除此之外,荧光素等可代替地高辛、NBT/BCIP 等可代替BM Purple 来进行实验,可参考本文提供的步骤并按照相应试剂说明书进行改进。
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