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油红O染色液(细胞涂片专用)

简介：

油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，较易与甘油三脂结合呈小脂滴状，与磷脂结合力稍差，其染色原理一般认为是物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色。染料在细胞内脂质的溶解度较原溶剂中的溶解度更大，所以在染色时染料就从有机溶剂转移入脂质而使脂肪染色。

Leagene油红O染色液(细胞涂片专用)简称ORO染色液，可显示最小的脂滴，可优先为脂类从溶剂中吸附染料，可用于细胞涂片、骨髓涂片、体液涂片、血液涂片等的油红O染色。标本不采用含有乙醇的固定液，如需要固定可采用10%福尔马林。脂肪阳性染色结果呈橘黄至红色，但具体颜色因脂质浓度而定。

组成：

编号名称DL0009

4×20ml

DL0009

4×50ml

Storage

试剂(A): ORO Fixative 20ml 50ml RT 避光

试剂(B): ORO Stain B1: ORO Stain A 12ml 30ml 4℃避光B2: ORO Stain B 8ml 20ml 4℃

按B1:B2=3:2比例混合静置10min, 即为ORO Stain，不宜提前配制。

试剂(C): Mayer苏木素染色液20ml 50ml 4℃避光试剂(D): ORO Buffer 20ml 50ml RT

使用说明书1份

自备材料：

1、60%异丙醇

2、蒸馏水

操作步骤(仅供参考)：

1、制备新鲜骨髓、血液、细胞涂片，入ORO Fixative固定。

2、取出涂片，放于流通的空气中。

3、入新配制好的ORO Stain浸染。

4、入60%异丙醇漂洗，流水冲洗，入蒸馏水稍微清洗。

5、入Mayer苏木素染色液复染核。

6、入ORO Buffer。

7、流水冲洗，晾干。

染色结果:

中性脂肪橙红色或橘红色

磷脂粉红色

细胞核蓝色

注意事项:

1、ORO染色液不够稳定，易产生沉淀，不宜提前配制。

2、Mayer 苏木素染色液复染时间不能过长。

3、染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

细胞染色方法总结

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。 JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

培养细胞常用染色与固定方法

培养细胞常用染色与固定方法培养细胞常用染色与固定方法一、普通染色观察苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS 或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min， 10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。（一）HE染色法 1.染液配制 (1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g 铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。 (2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液。 2.染色程序（1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。（3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱

碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。（5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。（6）入伊红染液30s～1 min。（7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次) 各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。（8）用二甲苯透明2次，各5min。（9）树胶封固。 3.染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。（二）吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。 1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。（3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。 2.染色程序

细胞染色方法大全

细胞染色方法大全 The manuscript was revised on the evening of 2021

细胞染色方法

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，染色与观察：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.

注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。

实验室做细胞常用染色word文档良心出品

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min,间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1 ％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥（至此即可用于普通染色）。 5、多聚L赖氨酸（1:10溶于去离子水）浸泡5min，振荡。 6入60C烤箱1 h,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学）。、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2. 培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS 漂洗2?3次后，备固定制对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS 液漂洗2?3 3. 常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 (锇酸 )。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如 Mueller 固定液、 Flemming 固液、FAA 固定液、Carnoy 固定液、Rossman 固定液、Altmann 固定液、Bouing 固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1) 4%甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含 40%甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。 4%甲醛-PBS 使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用 40%甲醛水溶液：PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2) 丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮 (4 °C )固定细胞内酶效果较佳。 (3) 乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的适宜浓度为70%?100%。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。片；次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。液，酸、

细胞染色方法

一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽” 现象。 2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA凝胶电泳（一）、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。（二）结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA 法检测。（一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体? 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合… 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合? 4、加酶的底物，测光吸收制。（二）用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析（一）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点： 1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2)、可以做许多相关性分析 3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

细胞固定、染色原理与方法

细胞固定、染色原理与方法一、固定与固定液 (一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。 (2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。 (3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 (4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 2.时期 (1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。 (2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。 3.固定时的注意事项 (1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。 (2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。 (3)固定的时间要合适：与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。 (二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。 1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。 (2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。 (3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。 (4)使细胞内的成分凝固或沉淀。 (5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。

细胞各种染色方法

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。第一节培养细胞的常规检查和观察方法细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为：一、肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。二、显微镜观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。三、细胞的生长状态细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。四、微生物污染细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等

实验室做细胞常用染色

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 ..

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 ..

免疫荧光细胞化学染色方法

免疫荧光细胞化学染色方法一、标本制作可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。二、荧光抗体染色方法（一）直接法 1．染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。 2．洗片倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或 pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。 3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检 4．对照染色 ①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。 ②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替

未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。（二）间接法（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下： ①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。

Hoechst染色方法

Hoechst染色方法实验步骤 1．贴壁细胞 1) 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片至于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%——80%满。 2)刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 3) 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 4) 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 6) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡，使细胞接触封片液，切勿弄反。 7) 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 2. 悬浮细胞 1) 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 2) 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 3) 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 4) 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 5) 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 6) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 7) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 8) H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

实验室做细胞常用染色

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing 固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。 (3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固

细胞染色方法大全

染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane

常见细胞染色试剂简介

常见细胞染色试剂简介 1、酸性品红（Acid fuchsin）酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。 2、刚果红（Congo red）刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。它能作染料，也用作指示剂。它在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速 3、甲基蓝（Methyl blue）甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。 4、固绿（Fast green）固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。 5．苯胺蓝（Aniline blue）是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。此染料一般很难溶于水，也不易溶于酒精（1.5％）。植物制片中可与番红合用，作为组织染色；也可作藻类植物染色。因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。 6、苏丹Ⅲ（Sudan Ⅲ）苏丹Ⅲ是弱酸性染料，不溶解于水，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。常用70％酒精中的饱和溶液。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。 7、苏丹Ⅳ（Sudan Ⅳ）苏丹Ⅳ是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹Ⅲ，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质等结构，也可使叶绿体染成暗红色。 s8、伊红（Eosin）这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。 9、碱性品（复）红（Basic fuchsin）碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏响应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。 10、结晶紫（Crystal violet）结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度

染色方法总结

mydye 发表于 2006-3-4 14:37:00 AgNOR染色法: 1、试剂配制：（1）AgNOR染色液：甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。（2）AgNOR工作液取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。 2、步骤：（1）切片脱蜡至水（2）双蒸水洗2次（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）（4）双蒸水洗3次（5）脱水,透明,封固 3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。 B 鞭毛染色法: １．试剂配制：甲液：丹宁酸５克氯化铁（ＦｅＣｌ3）１．５克福尔马林（１５％）２．０毫升氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％１．０毫升乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3）２克蒸馏水１００毫升制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。２．染色方法：（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可）【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

细胞涂片染色分析

细胞涂片染色分析学习细胞学时，对常规的技术环节曾作了大致总结，请指正：染色不良原因分析细胞涂片常规巴氏染色步骤及原理：具体步骤： 1、涂片投入95%酒精固定液固定15分钟。目的：细胞及胞内物质形态稳定（由半液态变为半固态），易于染色。原因：固态比液态（流动性）更具稳定性，着色更迅速，染色效果也更稳定。 2、水洗用浓度由高到低的梯度酒精入水或直接自来水漂洗。目的：脱醇—置换出细胞内酒精，以便使水溶性苏木素进入。 3、苏木（水溶液）染核时间灵活掌握，根据镜下观察染色效果确定。 4、水洗洗去过多残留苏木染液， 5、碱水（饱和碳酸锂）返蓝目的：使苏木色精进一步形成，且使胞浆偏碱性，以便更好的与酸性染料结合。 6、水洗去多余碱水。 7、脱水用浓度由低到高的梯度酒精或直接由水进入95%酒精。 8、橘黄和EA（O—E染色）染胞浆操作：每次染后进入95% 酒精漂净多余染液，以保证不影响下一步。 9、无水酒精脱水——二甲苯透明——树胶封固。可能出现误差的步骤： 1、固定时间要求是：大于15 分钟，小于48小时。如果制完片后马上进入水洗染色，固定效果必然欠佳。 2、水洗脱醇应保证足够的时间和换水次数，否则脱醇不彻底，会干扰水溶性苏木素进入细胞内进行染色反应。 3、苏木素的染色效果与本身的浓度、纯度，染色反应的速度直接相关。此外，染色速度还受温度影响（温度越高，染色速度越快，效果越好）。所以：本步骤注意事项为：苏木素的质量——每日过滤并加新液；天气温度（室温）的变化——调整时间，温高则时间短，温度低则时间长，皆以镜下观察的效果为准灵活掌握。 4、碱水返蓝：为水溶液,其浓度和纯度都会影响返蓝效果。如果碱水使用时间过长，未及时更换，其浓度、纯度必然下降。为加快速度或工作时间调整，玻片放入碱水中的时间常常偏长或偏短。偏短——苏木色精形成不充分；偏长——涂片在水溶液中浸泡过久会影响细胞固定效果,从而影响染色效果。以至于影响苏木素的显色效果和下一步胞浆染色效果。 5、橘黄和EA的染色效果，由染液质量（配方、浓度、纯度）和染色时间决定。且橘黄和EA一般都使用醇溶液，所以，此前的酒精漂洗脱水步骤也很重要。