杆状病毒在气升式反应器中感染悬浮棉铃虫细胞感染策略优化

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

病毒感染与靶细胞凋亡

病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。

越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,

病毒感染细胞实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理

细胞氧化应激基本概念讲解

1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -·、H2O2 及HO2·、·OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。

气升式环流反应器

实验9 气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定一．实验目的 1．了解气升式环流反应器的工作原理、结构形式及应用的领域。 2．掌握气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定方法。 3．掌握电导仪及测氧仪的使用方法。 4．学习利用组态王软件进行实验过程的数据采集和数据处理的方法。 二．实验原理 气升式环流反应器是近年来作为化学反应器和生化反应器而发展起来的一种新型高效气-液两相反应器和气-液-固三相反应器。气升式环流反应器是利用反应气体的喷射动能和液体的循环流动来搅动反应物料，所以具有结构简单、造价低、易密封、能耗低，也不会由于机械搅拌破坏生物细胞等优点。广泛用于化工、石油化工、生物化工、食品工业、制药工程和环境保护等领域。对反应器的结构尺寸进行恰当的设计后，能得到较好的环流流动的循环强度，在反应器内形成良好的循环，促进固体催化剂粒子的搅动。因而环流反应器对于反应物之间的混合、扩散、传热和传质均很有利，既适合处理量大的较高粘度的流体又适合处理热敏感性的生物物质，还可用于气-液两相或气-液-固三相之间的非均相化学反应。 根据气升式环流反应器降液管的形式可将环流反应器分为内环流反应器和外环流反应器两种。内环流反应器是指气体从升气管下方喷射进入反应器，使得升气管中液体的气含率大于降液管中液体的气含率，引起两者之间存在密度差，从而使得环流反应器中的液体在气体带动下得以循环起来。外环流反应器是指将降液管移到反应器的外面，循环原理和内环流反应器相同。 实验中利用体积膨胀高度法测定气含率ε；利用电导脉冲示踪法测量液体循环速度u L；利用动态溶氧法测定氧体积传质系数K L a。 三．实验装置和流程 1．实验装置 气升式内环流反应器的结构简图见图2-9-1，实物装置见图2-9-2。进入反应器的气体喷

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

第五章 病毒与宿主细胞的相互作用

第五章病毒与宿主细胞的相互作用 第一节病毒与宿主细胞的相互作用 1.1病毒感染及病毒性疾病 １.病毒感染(viral infection)：病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染，有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。 ２病毒性疾病(viral disease)：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病 ３病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ４显性病毒感染：有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等进入机体，到达靶细胞后大量增殖，使细胞和组织损伤，机体出现明显的临床症状，这样的感染称为显性病毒感染或临床感染；按症状出现早晚、持续时间的长短以及病毒在体内持续存在状态等显性感染又分为急性病毒感染和持续性病毒感染两种。 ５病毒在宿主易感细胞内增殖造成细胞破坏与死亡，这种感染称杀细胞性感染。 ６病毒在细胞内增殖引起细胞变性、死亡裂解的作用称病毒的细胞病变效应（CPE）。 ７细胞凋亡：多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程，是形态上术语。细胞程序性死亡：细胞内特定基因的程序性表达介导的死亡，是功能性术语。 1.2病毒在机体内的散播 局部散播:病毒只在入侵部位感染细胞局部散播。 血行散播：病毒可在入侵局部增殖进入血液经血流或神经系统向全身或远离入侵部位的器官散播。 神经散播：HSV单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、VZV水痘-带状疱疹病毒、狂犬病病毒。 1.3病毒感染的条件 ａ．病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ｂ．合适的感染途径。 c．宿主的易感染性细胞：跟细胞表面的病毒受体、宿主机体的免疫状态、其他物理分子（如体温、营养及年龄、病毒的致病机制）有关。 1.4病毒的致病机理 病毒对细胞的致病作用包括来自病毒的直接损伤和机体免疫病理应答两个方面。敏感的宿主细胞被病毒感染后，两者相互作用下可表现为：杀细胞性感染；稳定状态感染；细胞凋亡；包涵体的形成；细胞增殖和转化；病毒基因的整合。 1.病毒对细胞的直接致病作用 由于病毒在细胞内增殖，干扰和破坏了宿主细胞的正常代谢，造成细胞死亡即所谓杀细胞效应(cytocidal effect)。 2.机体的免疫应答引起的免疫病理作用 病毒感染细胞后，细胞表面可产生新的病毒抗原，可诱发宿主产生免疫应答，也能造成

[VIP专享]病毒感染细胞实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒

1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制 是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时 间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬 时表达外源基因 感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转 染的原代细胞（如神经细胞）及体内 实验 感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达

气升式环流反应器

气升式环流反应器公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-

实验9 气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定 一．实验目的 1．了解气升式环流反应器的工作原理、结构形式及应用的领域。 2．掌握气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定方法。 3．掌握电导仪及测氧仪的使用方法。 4．学习利用组态王软件进行实验过程的数据采集和数据处理的方法。 二．实验原理 气升式环流反应器是近年来作为化学反应器和生化反应器而发展起来的一种新型高效气-液两相反应器和气-液-固三相反应器。气升式环流反应器是利用反应气体的喷射动能和液体的循环流动来搅动反应物料，所以具有结构简单、造价低、易密封、能耗低，也不会由于机械搅拌破坏生物细胞等优点。广泛用于化工、石油化工、生物化工、食品工业、制药工程和环境保护等领域。对反应器的结构尺寸进行恰当的设计后，能得到较好的环流流动的循环强度，在反应器内形成良好的循环，促进固体催化剂粒子的搅动。因而环流反应器对于反应物之间的混合、扩散、传热和传质均很有利，既适合处理量大的较高粘度的流体又适合处理热敏感性的生物物质，还可用于气-液两相或气-液-固三相之间的非均相化学反应。 根据气升式环流反应器降液管的形式可将环流反应器分为内环流反应器和外环流反应器两种。内环流反应器是指气体从升气管下方喷射进入反应器，使得升气管中液体的气含率大于降液管中液体的气含率，引起两者之间存在密度差，从而使得环流反应器中的液体在气体带动下得以循环起来。外环流反应器是指将

降液管移到反应器的外面，循环原理和内环流反应器相同。 实验中利用体积膨胀高度法测定气含率ε；利用电导脉冲示踪法测量液体 循环速度u L ；利用动态溶氧法测定氧体积传质系数K L a。 三．实验装置和流程 1．实验装置 气升式内环流反应器的结构简图见图2-9-1，实物装置见图2-9-2。进入反应器的气体喷射至升气管后，由于气体的喷射动能和升气管内流体的密度降低，迫使升气管中流体向上，降液管中流体向下做有规则的循环流动，从而在反应器中形成良好的混合和反应条件。 气升式外环流反应器的结构简图，见图2-9-3，实物装置见图2-9-4。 图2-9-1 内环流反应器的结构简图图2-9-2 内环流反应器实物装置图 图2-9-3 外环流反应器的结构简图图2-9-4 外环流反应器实物装置图 环流反应器是作为气-液两相或气-液-固三相反应器而应用于生物化工或其他化学反应过程，因此传质性能往往成为过程的控制因素，能否提供良好的传质条件对环流反应器的应用具有决定意义。本实验在气升管尺寸不变的情况下，通过 改变不同的气体流量，测定了设备的流体力学性能（气含率 ，液体循环速度 L u 等）及传质特性（氧体积传质系数a K L ）。这三个指标既是衡量气升式环流反应器传递性能的重要指标，也是环流反应器设计和工程放大的重要参考数据。2．实验流程

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应性免疫的参与机制

病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应 性免疫的参与机制 以呼吸道病毒感染为例，当病毒入侵机体时将会产生以下几个阶段的防御反应。 一、呼吸道粘膜以及细胞分泌物的机械和化学屏障 当病毒通过呼吸道入侵机体时，首先遇到由完整粘膜组成的免疫系统第一道防线，黏膜产生阻挡作用的同时还通过纤毛的不断同向摆动，清除粘膜表面的病原体。除机械性作用外，粘膜细胞分泌的多种物质亦可阻挡病毒的入侵。 二、固有免疫细胞和免疫分子的免疫应答作用 当病毒突破机体屏障结构进入体内时，固有免疫细胞和免疫分子启动免疫应答——第二道防线。 首先发挥作用的是游离在血液中小吞噬细胞中性粒细胞，感染发生初期在炎性细胞因子等的作用下，血管内皮细胞表达E-选择素，诱导吞噬细胞表达相应配体，并与血管内壁黏附，沿内皮细胞表面滚动，以致穿越血管内皮，接着在趋化因子作用下向感染灶募集和迁移，聚集在感染灶的吞噬细胞PRR与病毒PAMP识别结合启动吞噬与杀灭作用。 NK细胞通过识别受感染的靶细胞表面HLA-I类分子，激活杀伤

活化受体，与HLA-I类分子表达下降的感染细胞表面相应配体结合，从而产生杀细胞效应。同时通过NKG2D和自然细胞毒性受体识别受病毒感染细胞高表达的相应配体，选择性的杀伤靶细胞。 此外，NKT细胞、B1细胞、γδT细胞、树突状细胞(DC)等也起到了相当重要的免疫应答作用。以上均为固有免疫的参与机制，为感染发生后的96小时内反应，固有免疫将贯穿整个免疫应答过程。 三、T淋巴细胞介导的细胞免疫应答 1.T细胞识别抗原 病毒被DCs吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给初始CD4+ T细胞；而吞噬细胞通过对病毒的吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给效应CD4+ T细胞和记忆CD4+ T细胞识别。由此激活由T细胞介导的细胞免疫应答。 被病毒感染的细胞通过表达病毒肽-MHC I类分子分子复合物，被初始CD8+ T细胞识别。 2.T淋巴细胞活化 CD4+ T细胞表面的TCR与ACPs表面的抗原肽-MHC II类分子复合物结合后，以及CD8+ T细胞表面的TCR与靶细胞表面病毒肽-MHC I类分子分子复合物结合后引发第一信号，促进免疫突触的形成，启动信号传导途径，导致T细胞基因表达改变，表达基因编码了介导T细胞生物学效应的蛋白质。同时，T细胞将第一信号整合，直至达

关于慢病毒感染的相关知识总结..

慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含

氧化应激与心肌

氧化应激与心肌 1957年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞IRI的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是IRI发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌IRI的研究进展做一综述。 1.氧化应激和ROS 氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或)外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O2- ·）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）和羟基自由基（·OH）。ROS作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在IRI过程中，参与合成ROS的酶体系增多，且活性更强，如NADPH氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。 2.ROS的主要来源 NADPH氧化酶是细胞内ROS的最主要来源，是由催化亚基gp91phox或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶1~4(NOX1~4) 、双功能氧化酶1~2(Duox1~2) ，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的NADPH氧化酶复合物与NADPH结合并释放2个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷(FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的2个氧分子结合生成O2-，最后生成H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团[1,2]。NOX源性的ROS在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX源性ROS 一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌IRI的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX活性对治疗心肌IRI并不是最好的选择。Vincent等[3]研究发现在30分钟缺血-24小时再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除组与NOX1和NOX2敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性NOX4 在H/R损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。 黄嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时XO活力升高，并且A TP分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时O2大量介入，次黄嘌呤和氧在XO作用下反应生成O2- ·和H2O2。有研究指出，XO不仅通过合成ROS参与心肌缺血再灌注损伤，XO本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO可以直接损伤血管内皮细胞（EC）或通过ROS间接损害EC，影响心肌血流再灌注[4]。 3.ROS与细胞损伤

气升式环流反应器PDF.pdf

实验9 气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定 一．实验目的 1．了解气升式环流反应器的工作原理、结构形式及应用的领域。 2．掌握气升式环流反应器流体力学及传质性能的测定方法。 3．掌握电导仪及测氧仪的使用方法。 4．学习利用组态王软件进行实验过程的数据采集和数据处理的方法。 二．实验原理 气升式环流反应器是近年来作为化学反应器和生化反应器而发展起来的一种新型高效气-液两相反应器和气-液-固三相反应器。气升式环流反应器是利用反应气体的喷射动能和液体的循环流动来搅动反应物料，所以具有结构简单、造价低、易密封、能耗低，也不会由于机械搅拌破坏生物细胞等优点。广泛用于化工、石油化工、生物化工、食品工业、制药工程和环境保护等领域。对反应器的结构尺寸进行恰当的设计后，能得到较好的环流流动的循环强度，在反应器内形成良好的循环，促进固体催化剂粒子的搅动。因而环流反应器对于反应物之间的混合、扩散、传热和传质均很有利，既适合处理量大的较高粘度的流体又适合处理热敏感性的生物物质，还可用于气-液两相或气-液-固三相之间的非均相化学反应。 根据气升式环流反应器降液管的形式可将环流反应器分为内环流反应器和外环流反应器两种。内环流反应器是指气体从升气管下方喷射进入反应器，使得升气管中液体的气含率大于降液管中液体的气含率，引起两者之间存在密度差，从而使得环流反应器中的液体在气体带动下得以循环起来。外环流反应器是指将降液管移到反应器的外面，循环原理和内环流反应器相同。 实验中利用体积膨胀高度法测定气含率ε；利用电导脉冲示踪法测量液体循环速度u L；利用动态溶氧法测定氧体积传质系数K L a。 三．实验装置和流程 1．实验装置 气升式内环流反应器的结构简图见图2-9-1，实物装置见图2-9-2。进入反应器的气体喷射至升气管后，由于气体的喷射动能和升气管内流体的密度降低，迫使升气管中流体向上，降液管中流体向下做有规则的循环流动，从而在反应器中形成良好的混合和反应条件。

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成

病毒与细胞凋亡复习课程

病毒与细胞凋亡

病毒与细胞凋亡 万文娟 2011302220031 摘要：细胞凋亡的概念、与细胞凋亡有关的病毒和基因、病毒调控细胞凋亡的机制 关键词：病毒细胞凋亡 1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应 生存环境而主动争取的一种死亡过程。根据形态学特征，细胞凋亡可分为三个阶段（1）：第 一阶段为核碎裂阶段，此阶段细胞要经过核固缩、染色质凝聚、胞浆浓缩等变化；第二阶段为凋亡小体形成阶段，包括细胞膜形成泡状突起、突起与胞体分离形成凋亡小体等过程；第三阶段为凋亡小体被临近细胞吞噬或凋亡小体自行降解阶段。 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程 （1）凋亡的启动阶段 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，目前比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。 2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经：实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。 （2）．凋亡的执行 尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。

细胞悬浮培养

细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化

1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。