ELISA--sill

ELISA方法

用包被液包被纯化后的重组蛋白，包被量依次为1.25ng，2.5ng，5ng，10ng，每孔100μl，

兔多抗血清和免疫前阴性血清依次稀释1000倍，10000倍和100000倍与包被重组蛋白结合。

具体操作如下：

以包被缓冲液稀释重组蛋白，加入96孔板，100μl/孔，37 ℃2 h或4℃过夜；PBST洗板3次，每次1-2min；3％BSA (或者5%的脱脂奶粉)300μl/孔，封闭96孔板，37 ℃3 h或4℃过夜PBST洗板3次，每次1-2min；加入5%的脱脂奶粉稀释兔多抗血清和免疫前阴性血清，100μl/孔，37℃2h；

PBS-T洗板5次，每次1-2min；加入HRP酶标羊抗兔二抗，100μl/孔，37℃ 1h；PBS-T洗板4-5次，每次1-2min；

加入TMB显色底物50-100μl，(即先加A液一滴，再加B液一滴，A+B约100μl)室温5-20min(或30分钟)，待显色满意后加入等体积1N的H2SO4或HCL终止反应（约50μl）；

用酶联仪检测A450nm吸光度值。

兔多抗血清的吸光度值与阴性血清吸光度值的比值大于2即判为阳性。

棋盘滴定法确定最佳抗原包被量

表1-1 棋盘滴定法实验设计表

Table 1-1 Range of ELISA assay

抗原量（多肽）prM兔多抗(或单抗) 兔阴性血清（单抗阴性血清）Blank 1/2

00 1/1000 1/5000

1/1000

1/50000 1/20

0 1/1000 1/5000

1/100

00

1/500

00

无Ab

100ng 100ng 1μg

1μg

5μg

5μg

10μg

10μg

1．按表1-1的设计用包被液稀释多肽，按每孔100 μl分别加入相应的ELISA板（聚苯乙烯微孔反应板）孔内，Blank加入100 μl包被液，4 ℃包被过夜。用PBST 洗涤3次，每次5 min。

2．用5% FBS封闭以减少非特异性吸附，每孔加入封闭液300 μl，37 ℃封闭1~2 h。用PBST洗涤3次，每次5 min。

3．根据表1-1分别按比例稀释兔多抗血清和兔阴性血清（或单抗），Blank内加入100 μl PBST，37 ℃孵育1~2 h。用PBST洗涤3次，每次5 min。

4．加入100μl以1:5000比例新鲜稀释的带HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，每孔100 μl，37 ℃孵育1 h。用PBST洗涤3次，每次5 min。

5．每孔加入底物100 μl，包括blank，室温孵育5~30 min。

6．每孔加入50 μl终止液（2 M H2SO4）。用酶标仪检测450 nm处的OD值。7．阳性判断标准：加入兔多抗孔的吸光度值与阴性血清孔吸光度值的比值大于2即判断为阳性。然后再从中找出阳性血清OD450nm值和阴性血清OD450nm 值之比（即P/N）最高的反应孔的抗原浓度和多肽稀释度为最佳抗原包被浓度和多肽稀释度

1μg的浓度即为10μg/ml

冻干多肽的保存

所有标明“保持冻干”的产物, 都必须保存在冰冻条件下，最好-20℃，若保存在-10℃以下, 大多数肽可维持几年的活性。

当使用冰冻产品时, 开盖之前, 瓶或试管应在装有新鲜干燥剂的干燥箱内升至室温。对于保存于-20℃的产品, 这个过程需要一小时或更长, 随包装大小而异。否则, 当瓶打开时, 水气进入导致多肽凝缩而降低其稳定性。一旦打开, 应迅速称量完毕, 并立即密闭以免潮解, 尤其亲水肽更应注意