基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展

基因重组技术论文

基因重组技术 学生姓名：赵慧芳学号：20115071261 生命科学学院生物科学专业 指导教师：张海滨职称：教授 摘要：基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。发生在生物体内基因的交换或重新组合。包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。是生物遗传变异的一种机制。基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。[1] 关键词：基因重组；特点；分离；纯化 Abstract: Genetic recombination is the result of the fracture and the connection of different DNA strand DNA fragments of exchange and recombination, the formation of new DNA molecule. In organisms of gene exchange or recombine. Including the homologous recombination, site specific restructuring, transfer function and abnormal four categories. Is a mechanism of biological genetic variation. Genetic recombination is refers to the recombination between alleles. Can produce a large number of variation types, but only to create new genotypes, does not produce new genes. Genetic recombination is the cytological basis of the original cells first division of meiosis, homologous chromosomes split each other, not the free combination between homologous chromosomes and the intersection of the chromatids of homologous chromosomes swap. Genetic recombination is the theoretical foundation of the cross breeding. Gene mutation is refers to the change of the molecular structure of the gene, the gene sequence of DNA nucleotides changed, resulting in the change of the genetic information. Keywords: Genetic recombination；feature；separate；purification 1.基因工程的核心

工业微生物菌种的选育、保藏与培养

工业微生物菌种的选育、保藏与培养 自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。 菌种收集和筛选途径： （1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 （2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 菌种筛选主要步骤： 调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定 一、菌种的分离筛选 一）样品采集与预处理 总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样 土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。

基因重组和重组DNA技术教案

第四节基因突变和基因重组 第2课时基因重组和重组DNA技术 【自主学案】 1．基因重组 （1）概念：生物体在进行________的过程中，控制不同性状的________重新组合的过程。 （2）基因重组的类型 ①自由组合型：生物体在________，非同源染色体上的非等位基因发生自由组合。 ②交叉互换型：生物体在________，同源染色体上的非姐妹染色单体之间交换片段，使得染色单体上的基因发生重新组合。 【思维激活】基因重组有什么意义呢？ 2．重组DNA技术 （1）概念：将从一个生物体内分离得到或人工合成的________入另一个生物体中，使后者获得________或________的技术。 （2）重组DNA技术的一般过程 ①分离目的基因：从生物细胞内直接________，获得目的基因。 ②选择基因工程载体：运载目的基因需要载体，常用的载体有________等。 ③重组DNA技术的基本步骤：体外重组DNA→________→________→目的基因表达。 【思维激活】具备什么条件才能充当载体？ 【典题精析】 重点一：基因重组的理解 例1．以下有关基因重组的叙述，错误的是（） A．非同源染色体的自由组合能导致基因重组 B．非姊妹染色单体的交换可引起基因重组 C．纯合体自交因基因重组导致子代性状分离 D．同胞兄妹的遗传差异与父母基因重组有关 解析：基因重组主要指减数分裂过程中非同源染色体上的非等位基因发生自由组合和同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。纯合体自交后代不发生性状分离。 答案：C 重点二：重组DNA技术技术的操作工具

例2．下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（） A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B．限制性内切酶能识别和切割RNA C．限制性内切酶的活性受温度的影响 D．限制性内切酶可以从原核生物中提取 解析：限制性内切酶主要从原核生物中分离纯化出来。它们能够识别一种特定的脱氧核苷酸序列，别且使每条链中特定部位的两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。 答案：B 【学生自测】 1．进行有性生殖的生物，其亲子代之间总是存在着一定差异的主要原因是（） A．基因重组 B．基因突变C．染色体变异 D．环境条件的改变 2．下列有关基因重组叙述的说法，错误的是（） A．基因重组发生在减数分裂过程中 B．基因重组产生原来没有的新基因 C．基因重组是形成生物多样性的重要原因之一 D．基因重组能产生原来没有的新性状 3．要将目的基因与载体连接起来，在基因操作中应选用（）A．只需DNA连接酶 B．同一种限制酶和DNA连接酶 C．只需限制酶 D．不同的限制酶和DNA连接酶 4．下列有关基因工程技术的叙述中正确的是（） A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列

微生物菌种保藏及复壮

微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。

因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡

(整理)基因重组与基因工程

基因重组与基因工程 一、选择题 1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 3．溶原菌是指： A．整合了噬菌体基因组的细菌 B．整合了质粒基因组的细菌 C．含有独立噬菌体基因组的细菌 D．含有独立质粒基因组的细菌 E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌 4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为： A．转化 B．转导

C．转染 D．转座 E．接合 5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组 B．同源重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 6．发生在同源序列间的重组称为： A．位点特异的重组 B．非位点特异的重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生： A．5'磷酸基和3'羟基基团的末端 B．3'磷酸基和5'羟基基团的末端 C．5'磷酸基和3'磷酸基团韵末端 D．5'羟基和3'羟基基团的末端 E．以上都不是 8．可识别并切割特异DNA序列的称： A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶

C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶 E．DNA酶 9．限制酶的识别顺序通常是： A．聚腺苷酸 B．聚胞苷酸 C．RNA聚合酶附着点 D．回文对称序列 E．甲基化“帽”结构 10．限制酶： A．从噬菌体中提取而得 B．可将单链DNA任意切开 C．可将双链DNA任意切开 D．可将双链DNA特异切开 E．不受DNA甲基化影响． 11．限制酶的作用特性不包括： A．在对称序列处切开DNA B．同时切开双链DNA C．DNA两链的切点常在同一位点 D．酶切后的DNA片段多具有粘性互补末端 E．酶辨认的碱基一般为4—6个 12．限制酶的特点不包括： A．只识别一种核苷酸序列 B．其识别不受DNA来源的限制

微生物菌种保藏方法

菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入

最新基因重组与基因工程

基因重组与基因工程

基因重组与基因工程 一、选择题 1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为： A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 3．溶原菌是指：

A．整合了噬菌体基因组的细菌 B．整合了质粒基因组的细菌 C．含有独立噬菌体基因组的细菌 D．含有独立质粒基因组的细菌 E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌 4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为： A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组 B．同源重组 C．基本重组 D．随机重组

E．人工重组 6．发生在同源序列间的重组称为：A．位点特异的重组 B．非位点特异的重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生： A．5'磷酸基和3'羟基基团的末端 B．3'磷酸基和5'羟基基团的末端 C．5'磷酸基和3'磷酸基团韵末端 D．5'羟基和3'羟基基团的末端 E．以上都不是 8．可识别并切割特异DNA序列的称： A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶

C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶 E．DNA酶 9．限制酶的识别顺序通常是：A．聚腺苷酸 B．聚胞苷酸 C．RNA聚合酶附着点 D．回文对称序列 E．甲基化“帽”结构 10．限制酶： A．从噬菌体中提取而得B．可将单链DNA任意切开 C．可将双链DNA任意切开 D．可将双链DNA特异切开 E．不受DNA甲基化影响．11．限制酶的作用特性不包括：

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果

基因重组和基因工程

第十七章基因重组和基因工程 一、单项选择题 1.限制性核酸内切酶切割DNA后产生 A. 5′磷酸基和3′羟基基团的末端 B. 5′磷酸基和3′磷酸基团的末端 C. 5′羟基和3′羟基基团的末端 D. 3′磷酸基和5′羟基基团的末端 E. 以上都不是 2. 可识别并切割特异DNA序列的酶是 A. 非限制性核酸外切酶 B. 限制性核酸内切酶 C. 限制性核酸外切酶 D. 非限制性核酸内切酶 E. DNA酶 3. 有关限制性核酸内切酶，以下哪个描述是错误的？ A. 识别和切割位点通常是4～8个bp长度 B. 大多数酶的识别序列具有回文结构 C. 在识别位点切割磷酸二酯键 D. 只能识别和切割原核生物DNA分子 E. 只能切割含识别序列的双链DNA分子 4. 在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的酶是 A. 解链酶 B. DNA聚合酶 C. DNA连接酶 D. 内切酶 E. 拓扑酶 5. 对基因工程载体的描述，下列哪个不正确？ A. 可以转入宿主细胞 B. 有限制酶的识别位点 C. 可与目的基因相连 D. 是环状DNA分子 E. 有筛选标志 6. 克隆所依赖的DNA载体的最基本性质是 A. 卡那霉素抗性 B. 青霉素抗性 C. 自我复制能力 D. 自我表达能力 E. 自我转录能力 7. 重组DNA技术中常用的质粒DNA是 A. 病毒基因组DNA的一部分 B. 细菌染色体外的独立遗传单位 C. 细菌染色体DNA的一部分 D. 真核细胞染色体外的独立遗传单位 E. 真核细胞染色体DNA的一部分 8. 下列哪种物质一般不用作基因工程的载体？ A. 质粒 B. 噬菌体

C. 哺乳动物的病毒 D. 逆转录病毒ＤＮＡ E. 大肠杆菌基因组 9. 关于pBR322质粒描述错误的是 Ａ．有一些限制酶的酶切位点Ｂ．含有1个ori. Ｃ．含有来自大肠杆菌的lacZ基因片段Ｄ．含个氨卞青霉素抗性基因Ｅ．含四环素抗性基因。 10. 以ｍＲＮＡ为模板催化ｃＤＮＡ合成需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Klenow片段 D. 逆转录酶 E. ＤＮＡ酶 11. 催化聚合酶链反应需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Taq DNA聚合酶 D. 逆转录酶 E.限制性核酸内切酶 12. 关于ＰＣＲ的描述下列哪项不正确？ A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产物量大 D.扩增的对象是ＤＮＡ序列 E.扩增的对象是RNA序列 13. 在基因工程中，DNA重组体是指 A. 不同来源的两段DNA单链的复性 B. 目的基因与载体的连接物 C. 不同来源的DNA分子的连接物 D. 原核DNA与真核DNA的连接物 E. 两个不同的结构基因形成的连接物 14. 基因工程操作中转导是指 A. 把重组质粒导入宿主细胞 B. 把DNA重组体导入真核细胞 C. 把DNA重组体导入原核细胞 D. 把外源DNA导入宿主细胞 E. 以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞 15. 重组DNA的筛选与鉴定不包括哪一方法 A. 限制酶酶切图谱鉴定 B. PCR扩增鉴定 C. 显微注射 D. 蓝白筛选 E.抗药筛选

基因重组技术基本工具

课题 学科组高二生物主备人朱建国执教人朱建国课题DNA重组技术的基本工具课型时间 课时教学目标1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 教学设想 重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 难点：基因工程载体需要具备的条件。 教法学法指导：：启发式教学多媒体课件 教学过程个性化修改 1.设置问题情境，引导学生在思索中学习新知识。 本节内容主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。如果我们采用直白、平淡的方式介绍，不利于调动学生学习的积极性，也不利于学生科学素养的全面提高。应当通过创设情境，提出问题，诱导学生积极参与教学活动，开启他们思想的闸门。 限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。可在进入这部分内容学习时，设置学生关心的问题“限制酶从哪里寻找”，诱导学生联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而诱导学生产生“可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就将书中直白的“这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的写法，变成了一个自主探索的思想活动。 DNA连接酶──DNA片段的“分子缝合针”，写得比较简洁。我们可以从原有的知识出发，诱发学生思考，达到辨析、明理的作用。要想连接被切割开的DNA，学生根据从前学过的知识，第一反应就想到“DNA聚合酶”。学生这种想法的产生是很自然的。但实际上并不能用这种酶进行DNA片段的连接。应引领学生分析DNA聚合酶与DNA连接酶的不同作用，从而达到更深层次认识DNA连接酶的目的。 基因进入受体细胞的载体──“分子运输车”的学习内容，提到作为载体必需的四个条件。教学不能仅仅着眼于让学生记住这几个条件，而应该通过诱导思索，明确为什么要有这四个条件才能充当载体。 2.让抽象的语言在直观的插图中找到注释，在实际动手中形成正确认识。 语言文字具有抽象、概括的特点；插图等信息媒体，具有形象、直观的特点，容易

基因工程和基因重组

第十四章基因重组与基因工程 内容提要： 细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用。通过自动获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。由病毒携带将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。 重组DNA技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基因的结构与功能，从构建的基因组DNA文库或cDNA文库分离、扩增某一感兴趣的基因就是基因克隆或分子克隆，又称重组DNA技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1．分，即目的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几种途径：化学合成、PCR技术、基因组文库或cDNA文库中获得。载体是目的基因的携带者，常用的载体有质粒、噬菌体等。2．切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，是实现重组DNA技术的重要的工具酶。3．接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组DNA）。4．转，即将重组体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、转染及感染。5．筛，即重组体的筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和Southern印迹或免疫学方法对抗药菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组DNA获得基因克隆。重组DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。 一、选择题 【A型题】 1．下列DNA序列属于回文结构的是（） A．ATGCCG TACGGC B．GAA TTC CTTAAG C．GGCCGG CCGGCC D．TCTGAC AGACTG E．CTAGGG GA TCCC 2．DNA经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾相接，自行成环。这是因为存在着（） A．钝性末端B．平端C．粘性末端D．5’端E．3’端 3．限制性内切核酸酶的通常识别序列是（） A．粘性末端B．聚腺苷酸 C．回文对称序列D．RNA聚合酶附着点E．甲基化“帽”结构 4．pBR322是（）

第14章 微生物的保存技术

第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜

工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 诱变选育 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种的步骤与方法 （一）、工业育种的一般步骤（图） （二）、诱变育种方案设计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。 1、出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株

选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。 3、单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

(生物科技行业类)菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基

消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

【高中生物】菌种保存和微生物常识

（生物科技行业）菌种保存和微生物常识

菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查

培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。

1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。

基因重组技术一、 技术原理基因重组是指不同DNA链的断裂和连接而 ...

基因重组技术 一、技术原理 基因重组是指不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫 做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂- 复合的基因交流。真核生物在减数分裂时,通过非同源染色体的自由组合形成各种不同的配子,雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代,这种重组过程虽然也导致基因型的变化,但是由于它不涉及DNA分子内的断裂- 复合,因此,不包括在狭义的基因重组的范围之内。 二、基因重组分类 基因重组，包括同源重组、位点特异性重组、转座作用和异常重组四大类。 1同源重组 同源重组(Homologus Recombination)，是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、Rec F、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11- Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 2位点特异性重组 在位点特异性重组(site-specific recombination)中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─D NA序列发生重排。位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。 λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状

工业微生物菌种开发的一般过程

1、工业微生物菌种开发的一般过程 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。土壤样品的含菌量最多。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 （1）采样 注意事项 1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的； （2）富集培养 目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。 例如控制培养基的营养成分的富集培养，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。 （3）分离筛选 经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 例如划线分离法，用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。 （4）产物鉴别 经典微生物分类鉴别 现代的分子生物学分类鉴别 2、分子生物学分类方法（微生物分类鉴定的经典和现代方法）

中国医学微生物菌种保藏管理办法

中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。 第一条组织及任务 在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心: 中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。 中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。 中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。 保藏管理中心的任务是: (一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究; (三)组织学术交流和经验交流; (四)办理国内外菌种交换; (五)编制保管的菌种目录。 保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。其具体任务是: (一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)承担本专业有关疑难菌种鉴定; (三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用; (四)办理对外交流和交换菌种。

各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。 生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。 第二条菌种的分类 菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。 一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。如: 鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌(包括EL-tor弧菌); 天花病毒、黄热病毒(野毒株)、新疆出血热(克里米亚刚果出血热)病毒、东、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、拉沙热(Lassa)病毒、马堡(Marburg)病毒、埃波拉(Ebola)病毒、猴疱疹病毒(猴B病毒); 粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、杜波氏组织胞浆菌。 二类:实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命，发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种。如: 土拉弗郎西丝氏菌、布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌; 狂犬病病毒(街毒)、森林脑炎病毒、流行性出血热病毒、国内尚未发现病人在国外引起脑脊髓炎及出血热的其它虫媒病毒、登革热病毒、甲、乙型肝炎病毒; 各种立克次体(包括斑疹伤寒、Q热); 鹦鹉热、鸟疫衣原体、淋巴肉芽肿衣原体;