细菌中的小RNA

文章编号：１００９－０００２（２００８）０４－０５８７－０４综述细菌中的小ＲＮＡ

宋兰１，２，周先礼１，岳俊杰２，梁龙２

１．西南交通大学生物工程学院，四川成都６１００３１；２．军事医学科学院生物工程研究所，北京１０００７１

［摘要］小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）或非编码ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）在原核生物和真核生物中广泛分布。迄今，在各种细菌中共发现超过１５０种ｓＲＮＡ，在大肠杆菌中发现了约８０种ｓＲＮＡ。ｓＲＮＡ通过与靶ｍＲＮＡ配对而发生作用，导致ｍＲＮＡ翻译和稳定性的变化；ｓＲＮＡ的功能涉及从结构调节到催化作用，影响生物体内各种各样的加工过程，一个单独的ｓＲＮＡ就能调控大量的基因并对细胞生理产生深远影响。目前，对ｓＲＮＡ的研究主要采用生物信息学预测结合分子生物学实验的方法。

［关键词］小ＲＮＡ；功能；大肠杆菌；生物信息学

［中图分类号］Ｑ５２２［文献标识码］Ａ

ＳｍａｌｌＲＮＡｓｉｎＢａｃｔｅｒｉａ

ＳＯＮＧＬａｎ１，２，ＺＨＯＵＸｉａｎ－Ｌｉ１，ＹＵＥＪｕｎ－Ｊｉｅ２，ＬＩＡＮＧＬｏｎｇ２

１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００３１L

２．ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００７１LＣｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ｓｍａｌｌＲＮＡ（ｓＲＮＡ），ａｌｓｏｃａｌｌｅｄｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ），ａｒｅｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｉｎｖａｒｉｅｔｙｏｆｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍｅｕｋａｒｙｏｔｅｓｔｏｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｔｏｄａｔｅ，ｍｏｒｅｔｈａｎ１５０ｓＲＮＡｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｉｎｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ８０ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ，ｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｅｎｍｏｓｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ｓＲＮＡｐｌａｙｅｘｔｅｎｓｉｖｅｒｏｌｅｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｙａｃｔｂｙｂａｓｅ－ｐａｉｒｉｎｇｗｉｔｈｔａｒｇｅｔｍＲＮＡ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍＲＮＡ．ｓＲＮＡａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｄｉｖｅｒｓｅｒａｎｇｅｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｆｒｏｍｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｔｈｒｏｕｇｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｔｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｆｆｅｃｔｉｎｇａｌａｒｇｅｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＡｓｉｎｇｌｅｓＲＮＡｃａｎｒｅｇｕｌａｔｅｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓａｎｄｈａｖｅｐｒｏｆｏｕｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｆｓＲＮＡｍａｉｎｌｙｂａｓｅｄｏｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｓｍａｌｌＲＮＡLｆｕｎｃｔｉｏｎLＥ．ｃｏｌｉLｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

近年来发现了一类新的ＲＮＡ，与以往人们所熟悉的ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等类型不同，有其独特的性质和功能。目前已证明这类ＲＮＡ广泛存在于多种生物体中，在从细菌到哺乳动物中都有分布。在真核生物中这类ＲＮＡ通常被称为非编码ＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ），在细菌中一般被称为小ＲＮＡ（ｓｍａｌｌＲＮＡ，ｓＲＮＡ）［１－２］。ｓＲＮＡ在细菌的生命活动中发挥着极为广泛的调控作用，在染色体转录与失活、基因表达与关闭、细胞周期乃至个体发育等过程中均具有重要的作用，很可能对生物体的复杂性也起决定作用［３］。对ｓＲＮＡ进行研究，可能对揭示基因转录后调控、基因敲除及生物进化有重要意义。

１细菌ｓＲＮＡ的特征及类型

１．１特征

从生物效应看，细菌ｓＲＮＡ与真核生物ｍｉｃｒｏＲＮＡ（微小ＲＮＡ）及ｓｉＲＮＡ（小干扰ＲＮＡ）有一定的相似之处，但就转录加工过程和作用方式而言，它们之间则有很大不同：ｍｉｃｒｏＲＮＡ及ｓｉＲＮＡ以茎环结构存在于较长的ＲＮＡ转录物中，后经胞浆中的Ｄｉｃｅｒ核酸酶剪切成２２ｎｔ的ＲＮＡ分子，这些ＲＮＡ分子被胞内蛋白质复合物ＲＩＳＣ识别，并被递呈到互补的ｍＲＮＡ（一般为３＇非翻译区），抑制该ｍＲＮＡ的翻译（当非编码ＲＮＡ与ｍＲＮＡ部分匹配时）或导致该ｍＲＮＡ降解（当非编码ＲＮＡ与ｍＲＮＡ完全匹配时）；而细菌ｓＲＮＡ的转录物一般不经过加工，长度约为５０～４００ｎｔ，通常开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列［４］，转录终止于一个Ｒｈｏ不依赖的转录终止子，茎环结构有助于稳定整个分子。对这些ｓＲＮＡ体内稳定性的直接测试表明大多数ｓＲＮＡ明显比ｍＲＮＡ稳定［５］。多数情况下，细菌ｓＲＮＡ在一些蛋白质（如ＲＮＡ伴侣Ｈｆｑ）的引导下，结合在ｍＲＮＡ５＇端，抑制翻译起始。

细菌中的ｓＲＮＡ有２种形式：已研究的大部分ｓＲＮＡ是由位于２个蛋白编码基因之间的非编码区（ＩＧＲ）序列转录而来；小部分ｓＲＮＡ（目前确认只有ＲｙｅＢ和ＳｒａＣ／ＲｙｅＡ）是从ｍＲＮＡ的头部或尾部非翻译区剪切下来的，目前这一类型的ｓＲＮＡ虽然较少，但这一发现对研究ｓＲＮＡ的功能、结构及起源具有重要意义，并且使人们更进一步认识到ｓＲＮＡ的复杂性。

１．２类型

随着各种创新性的生物信息学和实验方法的发展，迄今已发现了超过１５０种细菌ｓＲＮＡ，其中大肠杆菌中已知的ｓＲＮＡ就约有８０种。在其他细菌中也有一些发现，如枯草芽孢杆菌、霍乱

［收稿日期］２００７－１１－０５

［作者简介］宋兰（１９８４－），女，硕士研究生

［通讯作者］岳俊杰，梁龙，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｙｕｅ＿ｊｕｎｊｉｅ＠１２６．ｃｏｍ

２个署名单位为并列第一单位

弧菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌等。

不同的ｓＲＮＡ发挥功能的机制不同。按照发挥生物学功能的形式，可将目前已经鉴定的细菌ｓＲＮＡ分为３种类型。

行使持家功能的ｓＲＮＡ，它们高度表达并且是必需的。目前发现３种，包括具有酶催化活性并形成ＲＮａｓｅＰ的催化亚单位Ｍ１ＲＮＡ、转移信使ＲＮＡ（ＳｓｒＡ或１０ＳａＲＮＡ）及组成核糖核蛋白（ＲＮＰ）复合物的４．５ＳＲＮＡ。

蛋白质结合ｓＲＮＡ，如６ＳＲＮＡ在原核生物中高度保守并且在稳定期逐渐积聚，它能够与σ７０－ＲＮＡ聚合酶相互作用并改变它对启动子识别的特异性。ＣｓｒＢ和ＣｓｒＣＲＮＡ也能够特异性地与全局转录后调控因子ＣｓｒＡ蛋白相互作用形成一个调控反应回路，在这个回路中这２个ＲＮＡ分子作为ＣｓｒＡ蛋白的拮抗物，严紧地调控着这个蛋白的活性。

与ｍＲＮＡ相互作用的调控ｓＲＮＡ，这是细菌ｓＲＮＡ发挥调节功能最为普遍的一种形式，目前发现的细菌ｓＲＮＡ绝大多数都属于这个类型。ｓＲＮＡ同靶位ｍＲＮＡ结合后，通过多种机制影响靶基因的表达。有的ｓＲＮＡ与目标ｍＲＮＡ通过不完全的碱基配对结合后，可能会阻滞核糖体进入而引起翻译抑制；还有的ｓＲＮＡ结合在ｍＲＮＡ的３＇端，起到稳定ｍＲＮＡ的作用；还有些非编码ＲＮＡ可以结合在ｍＲＮＡ的茎环结构上，使茎环结构打开，从而起到促进翻译的作用。

细菌ｓＲＮＡ通过与靶ｍＲＮＡ配对而发生作用［６］，导致ｍＲＮＡ翻译和稳定性的变化，包括顺式编码和反式编码反义ＲＮＡ［７－８］。在原核和真核生物中，最终的活性ＲＮＡ必须以某种方式提呈到它将要与之配对的目标ｍＲＮＡ上，大多数ｓＲＮＡ作为转录后调控子，在ｍＲＮＡ５＇先导区形成复合物［９］。蛋白协同因子在此过程中有重要作用。细菌ｓＲＮＡ也要和相应的蛋白即ＲＮＡ伴侣Ｈｆｑ结合。这个高度保守的六环蛋白与真核生物ＲＮＡ剪接中的Ｓｍ和Ｓｍ样蛋白密切相关。Ｈｆｑ与ｓＲＮＡ在单链富ＡＵ区域强烈作用，这种相互作用稳定了许多ｓＲＮＡ。这并不是Ｈｆｑ的惟一作用，因为它也结合到目标ｍＲＮＡ的富ＡＵ区域，并在体外激发ｓＲＮＡ和目标的配对［１０］。Ｈｆｑ可通过干扰核糖体结合使ｍＲＮＡ降解［１１］。

多数ｓＲＮＡ与ｍＲＮＡ相互作用的特点包括：通常与ｍＲＮＡ不完全互补；大多结合在５＇非翻译区；可以有多个靶物；通常需要蛋白伴侣Ｈｆｑ；种属间高度保守；能通过产生向上或向下调控蛋白来改变转录、翻译或ｍＲＮＡ稳定性。

２ｓＲＮＡ的功能

传统理论认为ＲＮＡ分子是把信息从基因带到翻译系统的调节者，如ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ既执行自身功能，也和翻译过程有联系。现在发现的ｓＲＮＡ在细菌中所起的作用很广泛，它们涉及到的功能包括从结构调节到催化作用，影响各种各样的加工过程，如质粒复制、噬菌体发育、细菌毒性、压力反应、发育控制、ＲＮＡ剪切和修饰、ｍＲＮＡ稳定性及蛋白质降解等［１２－１４］。

２．１压力反应

许多真核ｎｃＲＮＡ表现为发育地调控，有时不止一个ｎｃＲＮＡ用于转录。对原核生物ｓＲＮＡ来说，启动子与其他细菌基因并无本质上的不同。它们是高度可调控的，并作为压力反应调节系统中的一部分频繁表达。ｓＲＮＡ作为协调因子对环境变化做出反应，整合环境信号，进而控制目的基因表达［１５－１６］。如ＯｘｙＳ是对氧化压力的ＯｘｙＲ－调控转录反应的一部分；ＲｈｙＢ由Ｆｕｒ阻遏物调节；Ｓｐｏｔ４２的合成由ｃＡＭＰ和ｃＡＭＰ接受蛋白（ＣＲＰ）调节。几乎所有主要的压力反应都包含至少一种ｓＲＮＡ作为调控的一部分。２．２体内铁平衡

ｓＲＮＡ能迅速关闭许多蛋白质的合成，改变必需细胞营养物。如ｓＲＮＡＲｙｈＢ在限制铁的条件下产生，与靶ｍＲＮＡ上至少５个编码铁结合蛋白的操纵子配对，包括ｂｆｒ（编码细菌铁蛋白）、ｓｄｈ（编码琥珀酸盐脱氢酶）、ｓｏｄＢ（编码超氧化物歧化酶）等。Ｈｆｑ结合可使ｓｏｄＢ信息改建，从而推动ｍＲＮＡ和ＲｙｈＢ的配对。靶ｍＲＮＡ和ＲｙｈＢ本身的降解都依赖于ＲＮａｓｅＥ，其酶切位点和Ｈｆｑ结合位点类似。破坏ｍＲＮＡ进而终止这些铁结合蛋白合成的结果是，细胞对铁的需求减少，以使更多离子可用于必需蛋白质。在铜绿假单胞菌中也有作用相似的ｓＲＮＡ。在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中，ｓＲＮＡ都由Ｆｕｒ抑制剂调控，Ｆｕｒ与铁结合时抑制ｓＲＮＡ合成，当铁有限时产生ｓＲＮＡ。因此，由Ｆｕｒ执行对铁的感应水平，也协调细胞对限制铁的反应［１０］。

２．３转录因子ＲｐｏＳ的正调控

ＲｐｏＳ是一个选择性的σ因子，原核ＲＮＡ聚合酶的启动子特异性亚单位。转录中依赖ＲｐｏＳ的基因根据多种营养物的损耗条件和其他压力，帮助细胞调整进入稳定期。在这些情况下，对ＲｐｏＳ的需求增大，主要是翻译增加，蛋白降解减少。在有些压力环境下，产生更多的ＲｐｏＳ并不是最好的反应。如尽管ＲｐｏＳ帮助细胞处理温和的氧化压力，但如果氧化压力足够强，ＯｘｙＲ调控元件的特异修复基因减少，另一个ｓＲＮＡ——

—ＯｘｙＳ会更多地抑制ＲｐｏＳ翻译，而不是激发它。ＯｘｙＲ特异修复基因比ＲｐｏＳ依赖的压力反应基因更具优先性。

ＲｐｏＳ翻译的调控说明细胞可利用各种ｓＲＮＡ来设置调控优先性。在一个给定的压力条件下（如低温或细胞表面压力），适当的ｓＲＮＡ会迅速合成，活化ＲｐｏＳ翻译。大量的各种压力条件需要ＲｐｏＳ水平的提高，这由一些独立的特异性调控ｓＲＮＡ完成。２．４群体感应ｓＲＮＡ

在弧菌属中，许多基因由群体感应的反应调控，或由感应培养基中其他细菌的密度调控，这是由细菌分泌小分子得到的。如果许多细菌存在并分泌，培养基中的小分子浓度将足够高以致被感应到，并引起每种细菌反应；如果只有少量分泌，信号将在周围液体中稀释，而不被感应到。在霍乱弧菌中存在大量的群体感应信号，它们聚集到一个单独的转录调控子ＬｕｘＯ上，以某种方式导致另一个下游调控子的负调控。

２．５大肠杆菌中的ｓＲＮＡ

目前研究最充分的是大肠杆菌中的ｓＲＮＡ，已发现超过８０个［１７］。如ＧａｄＹ与ＧｙｄＸ的３＇非翻译区作用抑制其降解；ＤｓｒＡ在低温下表达刺激ＲｐｏＳ的翻译；ＣｓｒＢ调控ＣｓｒＡ使细菌从指数生长期向稳定生长期转变［１８］。

在大肠杆菌中，ｓＲＮＡ的功能主要包括：①影响转录，１８４ｎｔ的６ＳＲＮＡ靠结合在δ７０全酶上调控启动子的使用；②ＲＮＡ的加工，３７７ｎｔ的ＲＮａｓｅＰＲＮＡ作为ＲＮａｓｅＰ的催化中心，调节ｔＲＮＡ和一些ｒＲＮＡ的５＇端加工过程；③ＲＮＡ的稳定性，８０ｎｔ的ＲｙｈＢ可能调控ｍＲＮＡ的降解，但具体机制不清楚；④ｍＲＮＡ的翻译，１０９ｎｔ的ＯｘｙＳ通过碱基配对，结合于ｍＲＮＡ上核糖体的对应位点，从而阻止翻译的进行；８７ｎｔ的ＤｓｒＡｓＲＮＡ通过碱基配对结合在ｍＲＮＡ上，阻止ｍＲＮＡ翻译抑制结构的形成，从而

激活ｍＲＮＡ的翻译；⑤蛋白质稳定性，３６３ｎｔ的ｔｍＲＮＡ能够为新生的“问题”多肽链打上降解标签；⑥蛋白质的转运，１１４ｎｔ的４．５ＳＲＮＡ作为信号识别颗粒（ＳＲＰ）的中心组分，调控蛋白质跨膜转运。还有很多ｓＲＮＡ的功能仍然未知。目前虽然已知ｓＲＮＡ在各种生物体中普遍存在，但很多ｓＲＮＡ都是诱导型，其何时发挥作用、发挥作用的诱因，以及在细菌中的稳定性等，目前知道的还较少。

３ｓＲＮＡ的研究方法

据估算，某些细菌基因组平均每４～５Ｍ的范围中，就可能含有２００～３００个ｓＲＮＡ，即细菌基因组编码的ｓＲＮＡ数量占到了其编码的蛋白质数量的５％左右。ｓＲＮＡ并没有统一的标准，如大小、基因构成或结构基序，也就不能把它们归到一个明确的功能类别中［１９－２０］。由于ｓＲＮＡ的碱基数目相对较小，同时ｓＲＮＡ不翻译为蛋白质，又没有开放阅读框，也就对移码和无义突变无反应，因此很难用生化和基因方法检验，并且可能只在特定的细胞环境下表达［２１－２２］；同样的原因，常规的计算机算法依赖于蛋白质编码序列的存在，也就不能检测这些基因［２３］。所以对编码ｓＲＮＡ的基因进行研究比较有难度。２０世纪最后３０年，只有１０种编码ｓＲＮＡ的基因在大肠杆菌中被发现，而且大多是由于其高丰度而偶然被发现［２４－２５］，近几年才真正开始对细菌ｓＲＮＡ进行系统研究。

研究ｓＲＮＡ的典型方法是生物信息学预测结合分子生物学实验［１２］；对进化中不太保守的细菌，还可以采用对细胞中的ｓＲＮＡ进行克隆和测序的方法。目前研究细菌ｓＲＮＡ的一般策略是，先通过计算机方法扫描细菌的基因组序列，利用已知ｓＲＮＡ序列的一些特点（如分布在非编码区，具有特殊的茎环结构，转录终止为Ｒｈｏ不依赖型），分析相关种属的序列同源性，从而预测ｓＲＮＡ的存在，并通过实验证实这些ｓＲＮＡ在细菌中确实被转录，然后再进一步通过各种实验手段研究其功能。计算机预测的候选ｓＲＮＡ主要用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交验证，对证实的ｓＲＮＡ再进一步进行结构研究和功能分析，采用的技术包括ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ和凝胶迁移分析等。

用于在原核生物中寻找ｓＲＮＡ及其基因的方法包括ＲＮＡ标记和染色、功能基因筛选、生物信息学搜寻、微列阵检测、鸟枪克隆法、与蛋白质共纯化等［１０］。由于ｓＲＮＡ基因的信号比蛋白编码基因弱，所以寻找二级结构或转录信号起始比较困难。各种搜寻ｓＲＮＡ的方法均有其优缺点，还没有一条完美的研究途径。３．１ＲＮＡ标记和染色

放射性同位素标记的磷酸氢化物很容易被生长中的细菌吸收并结合到核酸中，在这样的处理下，提取细胞总ＲＮＡ，由１Ｄ和２Ｄ－ＰＡＧＥ分离，用射线照相术分析，选择的带或斑点再从凝胶中分离，经核酸酶消化测序（指纹鉴定）。许多以这种方式发现的ｓＲＮＡ显示带有重要的持家或调控功能，如ＲｎａｓｅＰ的Ｍ１ＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、４．５ＳＲＮＡ和６ＳＲＮＡ。标记时间要足够长，才能抵消特别稳定的ｓＲＮＡ翻转，指定ｓＲＮＡ的带或斑点强度与它在细胞中的丰度直接相关。

优点：容易检测到大多数给定生长条件下的高丰度ｓＲＮＡ，或以最高速率合成的ｓＲＮＡ；不需要对感兴趣的ｓＲＮＡ有充分的前期了解；允许种属特异性的ｓＲＮＡ检测；靶向于被识别ｓＲＮＡ的成熟形式。

缺点：不能区分ｓＲＮＡ和大量ｔＲＮＡ的加工片段；需要高度放射性同位素追踪细菌培养的处理。

３．２功能基因筛选

多拷贝质粒文库是识别ｓＲＮＡ的有用工具，可显示与生理功能的直接联系。然而，这种筛选很少是专门针对ｓＲＮＡ基因的；相反，这些文库常包含足够长的ＤＮＡ片段，可编码更大蛋白质或操纵子。为了丰富ｓＲＮＡ基因文库，最好克隆较小的ＤＮＡ片段，即分离ＤＮＡ之后用限制性酶进行切割。用于文库构建的质粒型也应仔细选择。一方面，有些ｓＲＮＡ基因在普通生长环境下，甚至更多拷贝存在时保持抑制状态，这可以解释为ｓＲＮＡ只在特定压力条件下发生的自调控、正调控或转录活化抑制，这时，在质粒生长诱导或合成启动子控制下，克隆的ＤＮＡ片段容易表达。另一方面，过高的拷贝数会导致多效作用，由杂交引起ｓＲＮＡ基因失活或使它杀死其宿主。所以，建立既有低拷贝数又有高拷贝数的同种文库可能会更有效。

优点：可以快速准确地发现所研究ｓＲＮＡ的功能；可以建立在之前杂交系和基因研究中已发现的方法上。

缺点：如ｓＲＮＡ在过度表达时是必需的或有毒性的则有困难；可能无法发现在特殊环境下起作用的ｓＲＮＡ；耗费较大。３．３微列阵检测

微列阵法是在基因组水平监测ｍＲＮＡ表达轮廓图的方法，也能用于研究ｓＲＮＡ表达，甚至寻找新的ｓＲＮＡ转录物。主要的问题是在现有微列阵设计中，大多数可用的数列仅限于ＯＲＦ，最多包括ｔＲＮＡ和ｒＲＮＡ基因。换句话说，ＩＧＲ转录物中多数ｓＲＮＡ基因残基不能被检测到。有研究者应用一种高密度寡核苷酸探针数列，它不仅带有所有ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ和ｒＲＮＡ区域的特异链探针，也覆盖了一定范围的ＩＧＲ。随着微列阵分析技术的发展，它有望成为发现细菌ｓＲＮＡ和描述其表达轮廓图的标准工具。

优点：产生许多平行ｓＲＮＡ基因的转录轮廓图；迅速检测环境依赖性ｓＲＮＡ表达模式；允许种属特异性ｓＲＮＡ转录物检测。

缺点：需要覆盖ＩＧＲ的微列阵；耗费昂贵；与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交信号比较，常产生不一致的ｓＲＮＡ检测结果。

３．４鸟枪克隆法

给定尺寸范围的ＲＮＡ鸟枪克隆法是优于缓慢分离和序列测定的高丰度ＲＮＡ方法，利用它已发现了数百个真核和原核生物中的ｎｃＲＮＡ。典型的ＲＮＡ基因组学流程是先在聚丙烯酰胺凝胶中分离总ＲＮＡ，进行ｃＤＮＡ克隆，构建文库再进行测序。这种无目的地克隆尽可能多的ｓＲＮＡ片段，旨在识别给定基因组在给定条件下的表达。

优点：可允许检测在一个特定时间点表达的一定尺寸范围的所有ｓＲＮＡ；不需要对ｓＲＮＡ特性有前期了解；能自动化；能检测进程中种属特异性和非经典的ｓＲＮＡ；允许检测初级转录物。

缺点：测序耗费昂贵；筛选和估算非经典候选物十分耗费劳力；ｃＤＮＡ合成可能对高度组织化的ｓＲＮＡ有影响。

３．５与蛋白质共纯化

在细胞环境中有这样的猜测，许多ｓＲＮＡ在它们生命循环的不同时期与蛋白质形成复合物。ＲＮＡ结合蛋白可以帮助一个ｓＲＮＡ折叠成它的活性构象，在遇到其目标物之前抵御核酸酶，或促进它与目标ｍＲＮＡ的结合。其他与蛋白质作用的ｓＲＮＡ直接调控其活性。通过蛋白伴侣纯化核糖体核酸－蛋白复合物，使分离新的ｓＲＮＡ更容易。实际上，已经有一些与高丰度ＲＮＡ结合

宋兰等：细菌中的小ＲＮＡ５８９

生物技术通讯

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１９Ｎｏ．４Ｊｕｌ．，２００８

的蛋白（如ＣｓｒＡ、Ｈｆｑ）共纯化的ｓＲＮＡ被发现。

优点：能显示与蛋白质之间特殊的相互作用，以及ｓＲＮＡ的活性形式。

缺点：ｓＲＮＡ必须在纯化过程中保持与蛋白质的紧密结合；共免疫沉淀需要高度特异性的抗体；限于一小类ｓＲＮＡ。

３．６生物信息学搜寻

最早在大肠杆菌基因组中发现的ｓＲＮＡ都存在于基因间区，大多数已知ｓＲＮＡ只在近源细菌中是保守的，且ｓＲＮＡ之间并无序列相似性。利用近源种属中ｓＲＮＡ的高度保守性可进行预测。根据ｓＲＮＡ的存在方式，对ｓＲＮＡ的预测有几种方法：①运用ｓＲＮＡ的一些保守序列在细菌基因间的非编码区进行搜寻，很多ｓＲＮＡ都是这样被发现的；②根据ｓＲＮＡ结构上的保守性，在ＲＮＡ水平对ｓＲＮＡ基因进行预测；③根据转录子的转录起始和终止特征预测ｓＲＮＡ基因；④运用微芯片技术，依据ｓＲＮＡ的特征序列在基因间进行大规模的克隆。但这些方法都基于序列相似性的基础，而对不具相似序列的ｓＲＮＡ的研究仍较困难［１０］。

基于计算机预测蛋白质编码基因是注释细菌基因组序列的标准程序。除了寻找最长的可能的阅读框，这样的ｍＲＮＡ基因预测常由相关细菌中同源物的存在来支持，也可以在预测的起始密码附近推断核糖体结合位点，而ｓＲＮＡ基因没有这样明显的识别特征。所幸细菌的全基因组序列不断增长和丰富，为基于生物信息学的ｓＲＮＡ研究铺平了道路。多数生物信息学寻找ｓＲＮＡ的方法都基于基因间区特征，以及近源种属中的序列保守性。

优点：迅速形成一系列待研究的ｓＲＮＡ候选名单；允许与相关细菌基因组的种系进行发生比较。

缺点：需要对ｓＲＮＡ特性有前期了解，并确认大量候选基因座。

４展望

细菌中的ｓＲＮＡ开始崭露头脚，它们已被证明是许多调控线路中的重要成分。虽然目前已经有一些方法可用于寻找ｓＲＮＡ，但还没能建立一套经典的可全面应用的流程。迄今发现的ｓＲＮＡ数目不多，据估计只占总体的很小一部分。但由于其广泛的分布，继续寻找新ｓＲＮＡ分子有巨大的潜力。另一个挑战是寻找这些ｓＲＮＡ的作用靶位，透彻理解ｓＲＮＡ及其靶位的相互作用规律将有助于全面揭示ｓＲＮＡ的整体面貌。

随着生物化学和分子生物学实验技术的发展，以及对ＲＮＡ分子特性研究的深人，将会发现越来越多的ｓＲＮＡ分子，这必将会加深人们对ｓＲＮＡ参与的转录后加工及翻译调控等各个生命过程的认识。随着原核生物中ｓＲＮＡ的大量发现和深人研究，并通过与真核生物中ｓＲＮＡ的比较分析，有可能使人们对生物进化和生命的发展过程有更为深入的了解。

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［１１］ＭａｓｓｅＥ，ＧｏｔｔｅｓｍａｎＳ．ＡｓｍａｌｌＲＮＡｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｉｒｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＥ．ｃｏｌｉ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００２，９９：４６２０－４６２５．

［１２］ＨｅｒｓｈｂｅｒｇＲ，ＡｌｔｕｖｉａＳ，ＭａｒｇａｌｉｔＨ．ＡｓｕｒｖｅｙｏｆｓｍａｌｌＲＮＡ－ｅｎ－ｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，２００３，３１（７）：１８１３－１８２０．［１３］ＬｕｎｇＢ，ＺｅｍａｎｎＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｆｒｏｍｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｎｄｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００６，３４（１４）：３８４２－３８５２．

［１４］ＲｏｍｂｙＰ，ＶａｎｄｅｎｅｓｃｈＦ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＲＮＡｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｌｅｎｃｅ－ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，９：２２９－２３６．［１５］ＭａｎｄｉｎＰ，ＲｅｐｏｉｌａＦ，ＶｅｒｇａｓｓｏｌａＭ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｉｎＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｍＲ－ＮＡｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ，２００７，３５（３）：９６２－９７４．

［１６］ＪｏｈａｎｓｅｎＪ，ＲａｓｍｕｓｓｅｎＡＡ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｍａｌｌｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｔｈａｔｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅσＥｒｅｇｕｌｏｎ：Ｒｏｌｅｉｎｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００６，１０：１０１６－１０２４．

［１７］ＨａｎｓｅｎＰＶ，ＪｏｈａｎｓｅｎＪ，ＲａｓｍｕｓｓｅｎＡＡ．ＳｍａｌｌＲＮＡｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｒｉｎｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，１０：１－４．

［１８］ＫｕｌｋａｒｎｉＰＲ，ＣｕｉＸＨ．ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｃｓｒＡ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｍａｌｌＲＮＡｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＶｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００６，３４（１１）：３３６１－３３６９．

［１９］ＧｅｒｈａｒｔＥ，ＷａｇｎｅｒＨ，ＶｏｇｅｌＪ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｎｏｖｅｌｎｏｎ－ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｎｏｎ－ｍＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｈａｎｄ－ｂｏｏｋＲＮＡＢｉｏｃｈｅｍ，２００５，３７：６１４－６４２．

［２０］ＭｉｓｓａｌＫ，ＺｈｕＸＰ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆｔｈｅｎｅｍａｔｏｄｅｓＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓａｎｄＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｂｒｉｇｇｓａｅ［Ｊ］．ＪＥｘｐＺｏｏｌ，２００６，３０６Ｂ：３７９－３９２．

［２１］ＵｚｉｌｏｖＡＶ，ＫｅｅｇａｎＪＭ，ＭａｔｈｅｗｓＤＨ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｅｅｅｎｅｒｇｙｃｈａｎｇｅ［Ｊ］．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，７：１７３－２４９．

［２２］ＫｌｅｉｎＲＪ，ＭｉｓｕｌｏｖｉｎＺ，ＥｄｄｙＳＲ．ＮｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｇｅｎｅｓｉｄｅｎｔｉ－ｆｉｅｄｉｎＡＴ－ｒｉｃｈｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００２，９９（１１）：７５４２－７５４７．

［２３］ＲｉｖａｓＥ，ＫｌｅｉｎＲＪ．ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｉｎＥ．ｃｏｌｉｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，２００１，１１：１３６９－１３７３．

［２４］ＷａｓｓａｒｍａｎＫＭ．ＳｍａｌｌＲＮＡｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａ：Ｄｉｖｅｒｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００２，１０９：１４１－１４４．

［２５］ＳａｔｒｏｍＰ，ＳｎｅｖｅＲ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｇｅｎｅｓｉｎＥ．ｃｏｌｉｗｉｔｈｂｏｏｓｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００５，３３（１０）：３２６３－３２７０．

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